测定α-淀粉酶活力的方法

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可见分光光度法测定α-淀粉酶活力

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化学与生物工程２０２０,Vol．３７No．０３ www．
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张雪娇,田欢,刘春叶,等．可见分光光度法测定 α
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DNS法测定α淀粉酶活力的方法

生物学研究中关于糖测定中常用的方法
菲林试剂滴定——还原糖，常量分析 DNS比色法——还原糖，微量分析蒽酮比色法——总糖，微量分析
配制系列浓度稀释液的方法
线性稀释——稀释液的浓度梯度是相同的（0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0……）；
对数稀释（倍数稀释）——系列溶液的浓度比是一常数，取决于稀释梯度——2倍稀释（1、1/2、1/4、1/8……）；10倍稀释（1、1/10、1/100、 1/1000……）；
调和浓度稀释——系列溶液的浓度为连续排列整数的倒数（1，1/2，1/3，1/4， 1/5……）。
α-淀粉酶酶活力测定的原理
底物（反应物）为淀粉——碘比色法（反应一定量淀粉为糊精的时间）产物为麦芽糖、糊精等——麦芽糖为还原糖，可以用测定还原糖的方法来测定其生成量（如DNS法），从而计算出酶活力单位。
计算公式：根据标准曲线计算。
3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂配制说明
21g 氢氧化钠（先加入溶解）；
182g 酒石酸钾钠（同上）；
6.3g DNS（3，5-二硝基水杨酸），加热完全溶于上述溶液中；
5g 重蒸苯酚（冷却后加入）；
5g 无水亚硫酸钠（冷却后加入）；
完全溶解后定容至1000ml，贮存时间越长越稳定。
酶活力测定步骤（流程）
蒸馏水（mL）
2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0
麦芽糖含量（mg）
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
DNS试剂（mL）
2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0
加入完成混匀后沸水浴5min，定容至25mL混匀比色。
预留发酵液酶活力测定需要稀释倍数

实验一 α-淀粉酶活力的测定

1. 结果要取平均值，并以标准差表示实验结果。 2. 要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或
颜色变化终点要照像，并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里。
[实验报告书书写要求]
1. 实验报告书的编写要参考教师提出的写作格式规范。 2. 即：题目、作者（包括同组成员）、单位（班级和组别）、
酶活力单位（g/ml）=(60/T×20×2%×N)÷0.5
60 —酶活定义中反应时间为60min； T —反应时间（min）； 20 —可溶性淀粉的毫升数； 2% —可溶性淀粉浓度； N —酶液稀释倍数； 0.5 —测定时所用的稀酶液量（ml）。
表 1 α-淀粉酶活力测定结果
X
[实验结果处理要求]
酶活力单位gml60t202n05实验结果计算实验结果计算重复数反应时间min酶活力gmlmin要求实验过程中淀粉的颜色变化过程录像或颜色变化终点要照像并多媒体型实验结果单独标注班级和小组名提交或图片型实验结果直接写入在实验报告书里
实验一 α-淀粉酶活力的测定
[实验性质] 验证性实验 [实验学时] 2学时 [实验目的] (1) 掌握淀粉酶糖化淀粉的原理；
[实验步骤]
第一步：待测酶液的配制；第二步：标准色的配制；第三步：样品的酶解反应；第四步：计算。
1. 待测酶液的制备
α-淀粉酶
1.000 g
①
50 mL
2. 标准色的配制
150mL
60℃,30 min
250 mL

③可溶性淀粉 2.0g
酶液
2%淀粉液
A液
②
B液
8.0 mL 1.0 mL
3. 样品测定步骤
中文摘要、中文关键词、英文摘要、英文关键词、前言、材料与方法、结果与讨论、结论、参考文献等顺序。 2. 报告书的篇幅要求2000字以上。 3. 参考文献必须5篇以上，并至少有一篇英文。 4. 提交时间限为每周一下午3点。先交到课代表，由课代表汇总之后按时送到任课老师办公室。 5. 领取的报告书要妥善保管，期末考试时作参考。

淀粉酶活力的测定方法

淀粉酶活力的测定方法淀粉酶是一种能够降解淀粉的酶类。

测定淀粉酶活力的方法主要有光密度法、滴定法、浊度法、电极法等。

下面将详细介绍这几种方法。

一、光密度法光密度法是利用淀粉酶在一定温度和pH值条件下降解淀粉产生的葡萄糖，与p-二硫化苯胺生成的被称为多脱氧萘酚蓝的有色物质在特定波长下的吸光度变化来测定淀粉酶活力。

测定步骤：1. 准备试剂：液体缓冲液、淀粉溶液、pH 7.0缓冲液、2%～4%淀粉溶液、0.1% p-二硫化苯胺、1%酶液。

2. 在试管中加入2 mL pH 7.0缓冲液、2 mL 2%～4%淀粉溶液和1 mL 酶液，置于37恒温槽中培养10分钟。

3. 取出试管后，立即加入5 mL p-二硫化苯胺试剂和1 mL液体缓冲液，混匀后，放置15分钟使产生的多脱氧萘酚蓝发色充分。

4. 测定吸光度：使用特定波长的光源（通常为540 nm）对反应液进行吸光度测定。

5. 用纯水代替酶液重复上述步骤，结果作为对照组。

6. 计算淀粉酶活力：对照组的吸光度减去实验组的吸光度，乘以吸光度系数K （由标准淀粉酶活力校准得出），即可得出淀粉酶的活力。

二、滴定法滴定法是通过滴定试剂滴定淀粉酶产生的葡萄糖来测定淀粉酶活力的方法。

测定步骤：1. 准备试剂：碘滴定剂（0.02 mol/L碘酸钾，0.2 mol/L硫酸），0.1 mol/L氢氧化钠溶液，0.1%淀粉溶液。

2. 取一定量的淀粉酶加入试管中。

3. 预热培养：将试管放置于37水浴中预热，约5分钟。

4. 添加滴定剂：将试管中的淀粉加入10 mL淀粉溶液中，迅速搅拌。

5. 滴定：在反应时加入少量滴定剂，然后滴定到反应性红色消失的那一点为止。

6. 计算淀粉酶活力：滴定所使用的硫酸溶液的体积与滴定所使用的碘滴定剂的体积之间的比值即为滴定效价，根据滴定效价计算淀粉酶的活力。

三、浊度法浊度法是通过测定淀粉酶降解淀粉导致溶液浑浊度变化来测定淀粉酶活力的方法。

测定步骤：1. 准备试剂：0.1 mol/L淀粉溶液，0.1 mol/L缓冲液，1%淀粉酶溶液。

α-淀粉酶测定的操作规程

α-淀粉酶测定的操作规程1、用途：测定人血清中或尿液中α-淀粉酶的酶活浓度。

2、原理：α-淀粉酶与α-葡萄糖苷酶偶联，水解特异性底物4,6-亚乙基-4-硝基苯酚-α-庚糖，产生对-硝基苯酚，对-硝基苯酚生成速率与α-淀粉酶的活性成正比，在405nm波长下用速率法检测。

3、适用仪器：奥林巴斯AU480型全自动生化分析仪.4、样本要求：4.1、样本种类：新鲜无溶血血清或尿液。

4.2、样本采集：常规静脉采血约2ml，不抗凝。

置普通管中，或采用含有分离胶的真空采血管。

尿液保存时应将pH值调节至7.0。

4.3、样本干扰：对反映吸光度有干扰的样本，包括溶血和浑浊的样本都可能影响检测结果遇上述情况建议重新采集标本。

4.4、样本保存：血清样本2℃—8℃可稳定7天，-20℃可保存一个月，忌反复冻融。

尿液样本2℃—8℃可稳定10天.5、检测方法：5.1、试剂的准备：试剂开瓶即可使用。

5.2、检测步骤：2、动生化分析仪操作步骤：参数设置→试剂装载→校准→质控→样品加载→测定→结果审核→报告。

5.3、校准：用K因素进行试剂空白校准，也可使用Diazyme公司校准品进行校准操作，当试剂更换批号、出现质控漂移、仪器做完保养后及重要零件更换时，须重新校准。

5.4、结果计算：全自动生化分析仪会自动给出检测结果。

3、6、参考范围：(各医院应根据本地区实际情况建立自己的参考范围。

）7、注意事项：7.1、试剂具有一定的酸碱性，避免直接接触皮肤和眼睛，切勿吞咽。

7.2、使用后的器具应按照规定处理，扔入指定的垃圾箱内，不可随处乱扔，防止环境污染和二次使用。

7.3、由于运输过程产生渗液或漏夜的产品，或在运输贮存中没有按照说明书要求进行维护的试剂，不可使用。

7.4、试剂只用于体外诊断。

8、参考文献：中华人民共和国卫生部医政司，全国临床检验操作规程（第三版），东南大学出版社，2006。

王惠萱、李雪梅、王冈，临床检验操作手册，云南科技出版社，2008.陆永绥、李清华、张伟民主编，临床检验自动化仪器分析标准操作规程，浙江大学出版社，2006.。

α-淀粉酶amy检测原理麦芽庚糖苷法

α-淀粉酶amy检测原理麦芽庚糖苷法α-淀粉酶是一种能够分解淀粉为较小的糖分子的酶类。

它是一种广泛存在于生物体中的酶，包括人类、动物和植物。

淀粉是由α-葡聚糖链构成的多糖，而α-淀粉酶能够通过水解反应将淀粉分子切割成糊精（dextrin）和葡萄糖单糖。

麦芽庚糖苷法是一种常用的测定α-淀粉酶活性的方法。

该方法的原理是利用α-淀粉酶将庚糖苷（G7）中的庚糖分子逐个水解成葡萄糖分子，并且测定庚糖苷水解的速率来间接测定α-淀粉酶的活性。

具体的操作步骤如下：首先，准备一定浓度的庚糖苷溶液作为底物。

然后，在一定温度和pH条件下，将α-淀粉酶加入到庚糖苷溶液中，使其开始催化反应。

随着时间的推移，庚糖苷逐渐被水解成葡萄糖，反应体系中葡萄糖的浓度逐渐增加。

最后，通过测定葡萄糖浓度的变化，可以计算出α-淀粉酶的活性。

麦芽庚糖苷法具有以下优点：首先，该方法操作简单，不需要复杂的仪器设备，只需要常见的化学试剂即可。

其次，该方法对α-淀粉酶具有较高的灵敏度和特异性，可以准确地测定α-淀粉酶的活性。

此外，该方法还可以用于测定不同来源的α-淀粉酶的活性差异。

麦芽庚糖苷法在许多领域都有广泛的应用。

首先，在食品工业中，该方法可以用于测定食品中的淀粉含量和淀粉降解的速率，从而评估食品的品质和保存性。

其次，在生物制药工业中，该方法可以用于监测发酵过程中淀粉酶的活性，以确保产品的质量和产量。

此外，该方法还可以用于医学研究中，例如测定血液或尿液中α-淀粉酶的活性，以辅助诊断某些疾病。

α-淀粉酶检测原理麦芽庚糖苷法是一种简单可靠的方法，广泛应用于食品工业、生物制药工业和医学研究等领域。

通过测定庚糖苷的水解速率来间接测定α-淀粉酶的活性，该方法具有操作简单、灵敏度高和特异性强的特点，为相关领域的研究和应用提供了有力的工具。

实验一 α-淀粉酶酶活的测定

盐酸溶液：c ( HCI) = 0. 1 mol/L。
四、实验方法
待测酶液的制备：
称取1 g ~ 2 g酶粉(精确至0.000 1 g)或准确吸取酶液1.00 mL，用少量磷酸缓冲液充分溶解，将上清液小心倾入容量瓶中，若有剩余残渣，再加少量磷酸缓冲液充分研磨，最终样品全部移入容量瓶中，用磷酸缓冲液定容至刻度，摇匀。用四层纱布过滤，滤液待用。
三、实验仪器及试剂
仪器：分光光度计、恒温水浴锅（控温精度±0. 1℃）、移液管、试管、烧杯、容量瓶、玻璃棒、秒表。
试剂及溶液
试剂：
碘、碘化钾、 α-淀粉酶制剂、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸、可溶性淀粉（湖州展望化学药业有限公司）。
溶液配制：原碘液：称取11.0 g碘和22.0 g碘化钾，用少量水使碘完全溶解，定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。稀碘液：吸取原碘液2.00 mL，加20.0 g碘化钾用水溶解并定容至500 mL，贮存于棕色瓶中。
注:待测中温a-淀粉酶酶液酶活力控制酶浓度在3.4 u/mL~4. 5 u/mL范围内，待测耐高温淀粉酶活力控制酶浓度在60u/mL~65u/mL范围内。
酶活力测定
吸取10.0 mL可溶性淀粉溶液于试管中，加入磷酸缓冲液
2.5 mL，摇匀后，置于60℃±0.2℃(耐高温α-淀粉酶制剂
置于70℃±0. 2℃)恒温水浴中预热8 min；加入0.5 mL稀释好的待测酶液，立即计时，摇匀，准确反应5 min；
酶活力计算
耐高温α-淀粉酶制剂的酶活力按下式计算: X2 = c×n×16.67 式中: X2—样品的酶活力，u/mL或u/g c—测试酶样浓度，u/mL或u/g n—样品的稀释倍数 16.67 — 根据酶活力定义计算的换算系数。所得结果表示至整数。允许差：平行试验相对误差不得超过5%

淀粉酶活力的测定

2.2.2 碘贮存液(0.1mol/L)
称取1.7835g碘酸钾和22.5g碘化钾，溶于去离子水中，再缓慢加人4.5mL浓盐酸，用去离子水稀释至500mL，充分混匀，贮棕色瓶中，每月配制新鲜溶液，置冰箱中保存。
2.2.3 碘稀释液(0.lmol/L) 取碘贮备液用去离子水稀释10倍，贮棕色瓶中，现用现配。
底物缓冲液(40℃预温５min,mL) 1.0 1.0
酶滤液（mL）混匀，40℃水浴7.5min 0.2 -
碘稀释液（mL） 1.0 1.0
去离子ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ（mL） 6.0 6.2
2.4 淀粉酶活力计算
淀粉酶活力= 式中:AB:空白管吸光度；AU:测试管吸光度；淀粉酶活性定义:lmL酶滤液中(1g酶粉)的酶，在40℃和底物淀粉作用30min，水解10mg淀粉为1个淀粉酶活性单位。
2.3 操作步骤
称取酶粉1.0g充分碾细，加去离子水100mL,在40℃水中搅拌30min，充分溶出酶蛋白，过滤，滤液备用。按表2分别加入底物缓冲液、酶滤液、碘稀释液和去离子水，混匀，于660nm波长处(lcm光径)，以去离子水调吸光度为零，读各管吸光度。
试剂用量
加入物测定管（Ｕ）（３支平行样）空白管（Ｂ）
2.2 试剂
2.21 底物缓冲液
精确称，取9.0g；氯化钠；22。6g无水磷酸二钠和12.5g无水磷酸二氢钾，置于约500mL去离子水中力口热至沸腾溶解。称取0.4g可溶性淀粉于一小烧杯中，加入10mL去离子水，使其混悬后加人上述沸腾溶液中，冷却至室温后加入5mL37%甲醛溶液，用去离子水稀释至1000mL。此即为pH7.0、酶底物淀粉浓度为0.4g/L的缓冲液。
淀粉酶活力的测定
测定淀粉酶活力的方法有4类，一是测定底物淀粉的消耗量，有粘度法、浊度法和碘-淀粉比色法等；二为生糖法，测定产物葡萄糖的生成量；三为色原底物分解法，四是酶偶联法。其中碘-淀粉比色法测淀粉酶活力操作简便迅速、实用。

α-淀粉酶活力的测定

α-淀粉酶活力的测定α-淀粉酶活力的测定姓名___学号___ 一、实验目的:1. 掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理及其实验方法。

二、实验原理: α-淀粉酶- 是一种内切酶- 只能水解α-1, 4糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键- 不能水解α-1,6糖苷键附近的α-1,4糖苷键- 产物为糊精、低聚糖、麦芽糖和少量葡萄糖α-淀粉酶活力测定的方法1(反应底物: 可溶性淀粉2(反应环境: 60?，pH为6.0，常压。

3(产物: 还原性葡萄糖4(活力测定方法:1)测定还原糖产生速度2)测定淀粉遇碘显色力下降的速度3)测底物粘度下降的进度• 还原糖与黄色的 3,5- 二硝基水杨酸显色反应来测定.• 生成物颜色的深浅与还原糖的量成正比.• 以每克酶在一定时间内生成的还原糖(麦芽糖)量表示酶活大小.三、试剂与仪器:1、仪器(1)电子天平(2)容量瓶 100mL(3)试管(4)恒温水浴锅(5)紫外可见分光光度计(6)烧杯 250 mL2(试剂(1)1% 可溶性淀粉溶液:称取可溶性淀粉(以绝干计)1. 000g(精确至0.001g，用水调成浆状物(在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。

然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。

此溶液需要当天配制。

(2)0.4mol/L 氢氧化钠: 称取 1.6g 氢氧化钠，溶于少量蒸馏水，定容至100 mL.1(3)磷酸缓冲液(pH6.0): 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4?12H2O)45.23g、柠檬酸(C6H8O7?H2O)8.07g，用水溶解并定容至1000mL。

配好后用pH计校正。

(4)3,5- 二硝基水杨酸:精确称取 1g 3,5- 二硝基水杨酸溶于 20mL 1mol/L 氢氧化钠中,加入 50mL 蒸馏水,再加入 30g 酒石酸钾钠,待溶解后用蒸馏水稀释至100mL ,盖紧瓶塞,防止CO2进入.(5)麦芽糖标准液(1mg/ml):称取0.100g麦芽糖,溶于少量蒸馏水,定容至100mL .(6)α-淀粉酶:枯草芽孢杆菌生成，最适pH 5.5-7.5,最适温度 50~70? 四、测定步骤:1. 麦芽糖标准曲线的制作:取25ml刻度试管7支,编号.分别加入麦芽糖标准液(lmg/ml) 0, 0.2, 0.6, 1.0,1.4, 1.8,2.0 ml ,然后用吸管向各管加蒸馏水使溶液达 2.0ml ,再各加 3 , 5 -二硝基水杨酸试剂2.0m1 ,置沸水浴中加热5min .取出冷却,用蒸馏水稀释至25 m1 .混匀后用分光光度计在520 nm 波长下进行比色,记录吸光度.以吸光度为纵坐标,以麦芽糖含量(mg)为横坐标,绘制标准曲线.2. 待测酶液的制备:称取酶粉0.1g，精确至0.0002g，先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至100mL，摇匀。

实验一α-淀粉酶活力的测定

结果处理与计算
数据处理
根据实验数据，我们计算了酶活力、反应速率等参数。
图表绘制
我们使用图表展示了实验结果，以便更直观地分析数据。
结果分析
酶活力比较
通过比较不同浓度酶液的酶活力，我们可以得出酶活力与酶浓度之间的关系。
反应速率分析
通过分析反应速率，我们可以了解酶促反应的动力学特征。
结论总结
综合以上分析，我们可以得出实验一α-淀粉酶活力测定的结论，并为其应用提供依据。
用紫外可见分光光度计在540nm波长处测定各管的吸光度值。
数据记录与处理
01
记录实验数据，计算α-淀粉酶活力。
02
根据实验数据绘制标准曲线和酶活性曲线。
04
结果分析
数据记录
实验数据
在实验过程中，我们记录了不同浓度酶液处理后的反应时间、温度、pH值等数据。
实验误差
在实验过程中，我们尽量减小误差，如使用精确的测量工具、多次测量取平均值等。
05
实验总结与讨论
实验总结
01
实验原理
本实验通过测定α-淀粉酶催化淀粉水解生成可溶性糖的速率，从而确定
酶活力的大小。
02 03
实验步骤
准确称取适量淀粉和底物溶液，加入试管中，加入适量酶液，在适宜温度下恒温水浴一定时间，然后加入碘液和氢氧化钠溶液终止反应，最后用斐林试剂进行滴定。
实验结果
通过滴定结果计算出α-淀粉酶活力的大小。
DNS溶液
称取3，5-二硝基水杨酸6.3g，溶解于50mL蒸馏水中，加入2mol/L氢氧化钠溶液 16.8mL，再加入20%酒石酸钾钠溶液10mL和2mol/L硫酸溶液20mL，混合均匀后加热至80℃，不断搅拌，直至溶液呈透明。冷却后用蒸馏水定容至100mL，避光保存。

测定α-淀粉酶活力方法

实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。

二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。

酶催化的反应称为酶促反应。

生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。

能提高酶活力的物质，称为激活剂。

激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。

使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。

氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。

应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。

如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。

酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH 值。

温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。

同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。

食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、M曲霉等微生物产生。

但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。

α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。

α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。

本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。

淀粉酶活的测定

α－淀粉酶活力的测定一、实验目的通过本实验，使学生掌握α-淀粉酶活力测定的基本原理、方法和操作技能。

二、实验原理α-淀粉酶能将淀粉分子链中的α-1,4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色消失的速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。

三、实验试剂和仪器（一）试剂1. 原碘液称取碘（I2）11g，碘化钾（KI）22g，用少量水使碘完全溶解，然后定容至500mL，贮于棕色瓶中。

2. 稀碘液吸取原碘液2.00mL，加碘化钾20g，用水溶解并定容至500mL，贮于棕色瓶中。

3. 20g／L可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉（以绝干计）2 000g．精确至0.001g，用水调成浆状物．在搅动下缓缓倾入70mL沸水中。

然后，以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯，洗液并入其中，加热至完全透明，冷却，定容至100mL。

此溶液需要当天配制。

注：采用浙江菱湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉。

4. 磷酸缓冲液（pH6.0）称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）45.23g、柠檬酸（C6H8O7·H2O）8.07g，用水溶解并定容至1 000mL。

配好后用pH计校正。

（二）仪器1. 分光光度计应符合GB 9721的有关规定2. 秒表3. 恒温水浴（60±0.2）℃4. 试管25mm×2000mm四、实验步骤1. 待测酶液的制备称取酶粉l-2g，精确至0.0002g（或吸取液体酶100mL），先用少量的磷酸缓冲液溶解，并用玻璃搅拌棒捣研，将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度（将估计酶活力除以4，即酶活力应在3.7-5.6IU／mL范围内），摇匀。

通过4层纱布过滤，滤液供测定用。

2. 测定（1）吸取可溶性淀粉溶液20.0mL于试管中，加入缓冲液5.00mL，摇匀后，于（60±0.2）℃恒温水浴中预热5min。

α-淀粉酶酶活力测定实验(碘比色法)

酶活力测定的方法
碘比色法（有相应的国家标准）在一定反应条件下，1小时转化1g淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位 3，5-二硝基水杨酸比色法（DNS法）在一定反应条件下，1分钟反应生成1mg麦芽糖的酶量定义为1个酶活力单位注意：去除β-淀粉酶的干扰医学上的一些测定方法（专用试剂盒，通过生化仪器反应测定，需要微量快速）
α-淀粉酶酶活力测定实验 ——目视碘比色法
酶活力单位测定的介绍
测定的目的——纯化不容易；纯化过程中容易失活——质量（重量）不能用于定量；酶活力和酶活性的差别酶活力反应的实质——催化反应速度高低酶活力单位的定义及表示——增加可比性国际标准（25℃、1min、1umol）实际应用的标准酶活力的测定方法单位时间内底物的减少量或产物的增加量反应完一定量底物的时间长短测定物的要求：可测性、反应的专一性、稳定性、简便性比酶活力的定义——1mg酶蛋白的酶活力（有时用1g表示）测定过程中的条件控制——温度、pH等
β -淀粉酶
淀粉-1，4-麦芽糖苷酶 α -1，4 非还原端 2糖单位不能跨越麦芽糖、极限糊精
糖化淀粉酶
淀粉-1，4-葡萄糖苷酶、糖化酶 α -1，4 非还原端 1糖单位跨越葡萄糖 80%-100%
异淀粉酶
淀粉α -1，6-葡萄糖苷酶、支链淀粉酶 α -1，6 非还原端分枝点可切断分支糊精
比色终点，计下反应时间（与标准比色管颜色相同）代入公式计算酶活力单位注意：发酵液或酶液可能需要稀释，使加入的酶量可以在规定时间内完成反应。
α-淀粉酶测定反应比色稀碘液检测显色变化过程
反应终点颜色
思考题
报告测定结果？目视碘比色法在测定α-淀粉酶酶活力时需要注意哪些问题？通过查阅资料，还有哪些关于α-淀粉酶酶活力测定的方法？说明其基本原理及主要适用范围？

α、β-淀粉酶活性测定

α、β-淀粉酶活性测定
一、样品提取
3-5克样品→加0.1M/L 柠檬酸缓冲液(pH5.6)5ml+少量石英砂研磨至匀浆→加5ml 缓冲液清洗研钵→倒入10ml 具塞刻度试管→室温放置15-20min ，不断振荡→3500rpm 离心10min →上清液(酶提取液)备用
二、酶活性测定
α-淀粉酶活性测定测定管对照管 1.0ml 酶液 70℃水浴15min 1.0ml 柠檬酸缓冲液 4.0ml 0.4M NaOH 40℃水浴15min 2.0ml 1.0%淀粉，混匀 40℃水浴15min
加4.0ml 0.4M NaOH
各吸2ml 放入20ml 试管
加2ml DNS ，混匀
沸水浴5min
冷却，定容
测OD 520
三、标准曲线的制作
取20ml 的刻度试管6支并编号，分别加入麦芽糖标准液(1mg/ml ，称取0.10g 麦芽糖定容至100ml)0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0ml ，然后加水使都达到2ml ，再各加入DNS 2.0ml ，置沸水浴中煮沸5min ，冷却后用水稀释至20ml 。

在520nm 处测其消光值。

消光值为纵坐
(α+β)-淀粉酶总量测定
测定管对照管
0.5ml 酶稀释液
1.5ml 柠檬酸缓冲液
4.0ml 0.4M NaOH
40℃水浴15min
2.0ml 1.0%淀粉，混匀
40℃水浴15min
标，麦芽糖为横坐标作标准曲线。

二、α-淀粉酶活力的测定2010(精)

每组 1台每组 1台每组 1台
3.2 器材（每组）
15ml大试管10支 5ml移液管10支 1ml移液管5支 10ml移液管10支比色皿1套（4个）双蒸水1瓶（50ml）洗瓶1个玻璃平皿1套 50ml小广口瓶（棕色）2个 50ml 容量瓶 1个 100ml 容量瓶 1个 500ml 试剂瓶2个 100ml 试剂瓶2个 250ml 三角瓶2个 200ml烧杯2个 500ml烧杯1个记号笔1支、吸耳球、称量纸、药勺、试管架、研钵、纱布
2.实验原理
α-淀粉酶能够将淀粉分子中的α-1，4糖苷键随机切成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘的呈蓝色特性反应逐渐消失，呈现棕红色，其颜色消逝的速度与酶活性有关，可以用来表示淀粉酶水解的程度，因而能购通过反应后溶液的吸光度值衡量酶的活力。
3.试剂和溶液
3.4 磷酸缓冲液（pH6.0） 4.52g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）和0.8g柠檬酸（C6H8O7·H2O），定容至 100ml。pH计校正后使用。
3.5 盐酸溶液（0.1M/L） 100ml
4. 仪器及器材
4.1 仪器
电子天平
恒温水浴锅分光光度计记时器
2台
3.1 原碘液称取2.2g碘和4.4g碘化钾完全溶解后定容至100ml，储存于棕色瓶中（教师准备）。 3.2 稀碘液吸取原碘液2ml，加20g碘化钾用水溶解并定容至500ml。 3.3 可溶性淀粉溶液称取2.000g（精确到0.001g）可溶性淀粉于烧杯中，加适量蒸馏水调成浆糊状物，边搅拌边加入沸水90ml，搅拌加热至完全透明冷却后定容至100ml，现配现用。
生物技术专业系统实验（四）

α–淀粉酶活力测定[辅导]

α–淀粉酶活力测定----目视碘比色法一实验目的1. 了解α–淀粉酶酶活力测定原理。

2．掌握α–淀粉酶酶活力测定的方法步骤。

二、实验原理比色法作为一种定量分析的方法，是以生成有色化合物的显色反应为基础，通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯比尔定律 (A＝kLC)为基础。

酶活力的大小、即酶量的多少用酶活力单位（U）（active unit）表示。

1961年国际生物化学学会酶学委员会提出采用统一的“国际单位”（IU）来表示酶的活力，规定为：在最适条件（25℃）下，每分钟内催化1微摩尔（μmol）底物转化为产物所需的酶量定为一个活力单位，即1IU = 1μmol /min。

这样酶的含量就可用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶活力单位来表示（U/g或U/ml）。

淀粉（紫蓝色，30分子以上）红色糊精（红棕色，7-30分子）无色糊精（7分子以下）、麦芽糖不显色。

通过测定酶促反应分解一定量淀粉的时间，以标准糊精（红色糊精）和碘反应的颜色作为终点指示（所给定的淀粉都已转化为糊精的时间）。

碘比色法酶活力规定：在60℃条件下，1小时转化1g 淀粉变为糊精的酶量定义为1个酶活力单位。

三、实验操作1．取试管1支，加入1ml标准糊精和3ml 标准稀碘液。

2．取锥形瓶一个，加入2%淀粉20ml和Ph6.0的缓冲液5ml。

3．将锥形瓶置于60℃水浴中，保温5分钟。

4．在比色盘中加入比色碘液，每穴2滴。

5．在锥形瓶中加入淀粉酶溶液2 ml，摇匀，开始计时。

6．在反应的前4分钟，每隔1分钟从锥形瓶中取1滴液体，与比色稀碘液混合，而后，每隔30秒从锥形瓶中取1滴液体与稀碘液混合，直至呈色与终点色一致。

四、酶活性计算实验注意事项：（1）测定酶促反应在锥形瓶中进行，标准反应在试管中进行。

（2）比色盘第1号位加入标准糊精和2滴标准碘液。

（3）应时间大约在10-15分钟。

二硝基水杨酸淀粉酶

二硝基水杨酸淀粉酶
二硝基水杨酸（2,4-dinitrosalicylicacid，简称DNS）淀粉酶法是一种用于检测淀粉酶（也称为α-淀粉酶）活性的常见方法。

这种方法基于淀粉的降解产生还原糖，进而与DNS反应，形成有色产物，可以通过测定产物的吸光度来定量测定淀粉酶的活性。

这个方法的基本步骤如下：
1.淀粉的降解：
淀粉酶催化淀粉分解成较小的多糖分子，主要是麦芽糖。

2.DNS试剂的添加：
加入DNS试剂，DNS试剂中的二硝基水杨酸与还原糖反应，生成有色产物。

3.热处理：
将反应混合物进行热处理，使得产物进一步显色。

4.吸光度测定：
使用分光光度计测定混合物的吸光度，吸光度值与还原糖的浓度成正比，从而可以间接地测定淀粉酶的活性。

这个方法是一种常用的、相对简便的淀粉酶活性测定方法，广泛应用于食品工业、酿酒业、生物技术等领域。

由于其敏感性和可操作性，使得这个方法在实验室和工业生产中得到广泛应用。