链霉菌实验操作手册
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链霉菌室实验操作手册（2003年）
第一章培养基抗生素生长因子 (3)
常用抗生素及其使用浓度 (3)
LB（Luria-Bertani）培养基 (3)
LA (3)
基本培养基（MM） (3)
R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 (4)
YEME(酵母膏-麦芽膏培养基)1L（液体培养链霉菌） (4)
TSBY（1L）（液体培养链霉菌） (4)
MS培养基 (5)
2CMY培养基（用于井岗的接合转移） (5)
YMS培养基（阿维，井岗产孢） (5)
YD培养基 (5)
生长因子补充物的使用浓度 (5)
(77)
第二章DNA基本操作..............................................................
大肠杆菌质粒的抽提 (7)
酶连反应 (7)
DNA片段凝胶回收 (7)
DNA纯化 (9)
E.coil总DNA的提取 (9)
链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） (10)
去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） (10)
AT克隆（详见说明书） (10)
Southern Blot (11)
第三章PCR及相关技术 (13)
PCR (13)
PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429重叠延伸技术） (14)
PCR定点诱变（DpnI法） (14)
15第四章基因片段转移技术......................................................
(15)
大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化 (15)
DNA转化 (15)
大肠杆菌质粒的快速检测 (15)
接合转移（详见英文《手册》249页） (16)
链霉菌原生质体的制备 (16)
链霉菌原生质体的转化 (17)
PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 (17)
19
(19)
第五章RNA操作技术............................................................
链霉菌总RNA的抽提 (19)
链霉菌的RT-PCR（promega RT kit） (19)
21
(21)
第六章蛋白质基本操作技术..................................................
PAGE，考马斯亮蓝染色 (21)
SDS-PAGE
SDS-
大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）： (21)
链霉菌总蛋白抽提： (22)
大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）： (22)
Western Blot (23)
25
(25)
第七章遗传作图相关技术......................................................
链霉菌孢子悬液的制备 (25)
链霉菌中NF的证明 (25)
孢子杂交 (25)
在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因 (25)
27
(27)
第八章其他技术......................................................................
链霉菌菌种保藏 (27)
检测链霉菌淀粉酶的活性 (27)
第一章培养基抗生素生长因子常用抗生素及其使用浓度
抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度
(mg/ml)
使用终浓度（μg/ml）
链霉菌大肠杆菌
MM2CM YEME LA或LB
氨苄青霉素氯霉素
潮霉素
卡那霉素壮观霉素链霉素
硫链丝菌素红霉素
阿泊拉霉素Ampicillin,Amp
Chloramphenicol,Cml
Hygromycin,Hyg
Kanamycin,Km
Spectinomycin,Spc
Streptomycin,Str
Thiostrepton,Thio
Erythomycin,Ery
Apramycin,Am
bla
cat
hyg
aac或aph
aadA
str
tsr
erm E
aac(3)IV
100
25(无水乙醇配)
50
25
50
50
25(DMSO配)
100
50
R
10
10
2?
50
10
5
100
10
R
－
25
50
50
25
10
－
50
R
－
－
－
50
－
2.5
－
50
50-100
25
50
50
50
25
不敏感
20
30-50
*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制
*此表仅供参考！！！
*R表示不敏感
*Km和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg,Km,Vio
LB（Luria-Bertani）培养基
胰蛋白胨10g，
酵母抽提物5g，
NaCl5g，葡萄糖1g，
蒸馏水加至1000ml，
pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）
LA
LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需
1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖
基本培养基（MM）
溶液：L-天冬酰胺0.5g，
K2HPO40.5g,
MgSO4·7H2O0.2g,
FeSO4·7H2O0.01g,