链霉菌实验操作手册

链霉菌室实验操作手册（2003年）

第一章培养基抗生素生长因子 (3)

常用抗生素及其使用浓度 (3)

LB（Luria-Bertani）培养基 (3)

LA (3)

基本培养基（MM） (3)

R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 (4)

YEME(酵母膏-麦芽膏培养基)1L（液体培养链霉菌） (4)

TSBY（1L）（液体培养链霉菌） (4)

MS培养基 (5)

2CMY培养基（用于井岗的接合转移） (5)

YMS培养基（阿维，井岗产孢） (5)

YD培养基 (5)

生长因子补充物的使用浓度 (5)

(77)

第二章DNA基本操作..............................................................

大肠杆菌质粒的抽提 (7)

酶连反应 (7)

DNA片段凝胶回收 (7)

DNA纯化 (9)

E.coil总DNA的提取 (9)

链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） (10)

去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） (10)

AT克隆（详见说明书） (10)

Southern Blot (11)

第三章PCR及相关技术 (13)

PCR (13)

PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429重叠延伸技术） (14)

PCR定点诱变（DpnI法） (14)

15第四章基因片段转移技术......................................................

(15)

大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化 (15)

DNA转化 (15)

大肠杆菌质粒的快速检测 (15)

接合转移（详见英文《手册》249页） (16)

链霉菌原生质体的制备 (16)

链霉菌原生质体的转化 (17)

PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 (17)

19

(19)

第五章RNA操作技术............................................................

链霉菌总RNA的抽提 (19)

链霉菌的RT-PCR（promega RT kit） (19)

21

(21)

第六章蛋白质基本操作技术..................................................

PAGE，考马斯亮蓝染色 (21)

SDS-PAGE

SDS-

大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）： (21)

链霉菌总蛋白抽提： (22)

大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）： (22)

Western Blot (23)

25

(25)

第七章遗传作图相关技术......................................................

链霉菌孢子悬液的制备 (25)

链霉菌中NF的证明 (25)

孢子杂交 (25)

在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因 (25)

27

(27)

第八章其他技术......................................................................

链霉菌菌种保藏 (27)

检测链霉菌淀粉酶的活性 (27)

第一章培养基抗生素生长因子常用抗生素及其使用浓度

抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度

(mg/ml)

使用终浓度（μg/ml）

链霉菌大肠杆菌

MM2CM YEME LA或LB

氨苄青霉素氯霉素

潮霉素

卡那霉素壮观霉素链霉素

硫链丝菌素红霉素

阿泊拉霉素Ampicillin,Amp

Chloramphenicol,Cml

Hygromycin,Hyg

Kanamycin,Km

Spectinomycin,Spc

Streptomycin,Str

Thiostrepton,Thio

Erythomycin,Ery

Apramycin,Am

bla

cat

hyg

aac或aph

aadA

str

tsr

erm E

aac(3)IV

100

25(无水乙醇配)

50

25

50

50

25(DMSO配)

100

50

R

10

10

2?

50

10

5

100

10

R

－

25

50

50

25

10

－

50

R

－

－

－

50

－

2.5

－

50

50-100

25

50

50

50

25

不敏感

20

30-50

*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制

*此表仅供参考！！！

*R表示不敏感

*Km和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。

*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。

*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg,Km,Vio

LB（Luria-Bertani）培养基

胰蛋白胨10g，

酵母抽提物5g，

NaCl5g，葡萄糖1g，

蒸馏水加至1000ml，

pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）

LA

LB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需

1.5%，而华美的需要2%)。

＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖

基本培养基（MM）

溶液：L-天冬酰胺0.5g，

K2HPO40.5g,

MgSO4·7H2O0.2g,

FeSO4·7H2O0.01g,