免疫组化染色SP法
免疫组化各步原理
一、免疫组化技术免疫组织化学（Immunohistochemistry"HC）技术是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测技术。
目前，这种技术在临床病理诊断和形态学研究中已得到广泛应用。
Slide 3:（一）、免疫组化常用染色方法和步骤（石蜡切片）SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）:SP法（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法）原理采用生物素标记的第二抗体与链霉菌抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及底物色素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
主要步骤:主要步骤1、石蜡切片脱蜡（与常规HE切片脱蜡相同）：石蜡切片置60 ℃ 烤箱烤片15小时以上一从烤箱中拿出立即放入二甲苯I中5~10 min一二甲苯II 5~10min 一无水乙醇5min 一95%乙醇5min 一80%乙醇5min 一70%乙醇5min 一自来水洗Slide 6:2、3%H2O2阻断20min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；PBS 洗3次，每次5min。
3、抗原修复；PBS洗3次，每次5min。
4、滴加5~10% 正常山羊血清封闭，37℃, 10min （消除背景非特异性着色）Slide 7:5、吸干组织周围多余的血清，不洗，滴加第一抗体，37℃,孵育60min或孵育30min 再4℃冰箱过夜；PBS洗3次，每次5min。
6、擦干组织周围PBS, 滴加生物素标记的第二抗体，37c 孵育20min, PBS洗3次，每次5min。
Slide 8:7、擦干组织周围PBS,滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液37c 孵育20min。
8、PBS洗3次，每次5min, D.W洗2次，DAB显色（DAB必须现用现配），镜下控制显色程度，自来水冲洗，苏木素复染胞核，烤干，中性树胶封片。
染色步骤:染色步骤石蜡切片脱蜡到水；3%H2O2阻断10min （以消除内源性过氧化物酶的活性，降低背景）；蒸馏水洗2次，PBS洗3次，每次5min。
免疫组化三步法
三步法（SP系列），实验步骤使用说明：SP9001（兔）适用于兔来源的一抗SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗SP9003 （山羊）适用于山羊来源的一抗SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格￥230.00 / 6.0ml- 价格￥380.00 / 18ml- 价格￥1080.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年一﹑试剂盒内容试剂1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清）即用型试剂2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊）即用型试剂3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物即用型试剂3 过氧化物酶标记链酶卵白素即用型实验步骤简介：1. 细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS 室温10分钟复水。
2. 修复：滴加复合消化液（0.125胰蛋白酶% +0.1胃蛋白酶%+0.01 EDTA% ）（0.1molPBS 配制）4度30-40分钟0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟3. 血清封闭：（试剂1）室温10分钟，倾去。
4. 一抗：37℃1小时或4度过夜5. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟6. 相应的生物素化二抗（试剂2）37℃30-40分钟7. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟8. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3）37℃40分钟9，NBT/BCIP或DAB显色，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。
灏洋生物15:14:49名称：connexin 43产品编号：CM7269价格/规格：0.1ml/20ug技术指标：小鼠抗人，大鼠，小鼠单克隆抗体Ig分类：IgG2a适用组织：冰冻/石蜡阳性部位：细胞浆组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）产品说明：产地: Cellscience二步法（无生物素PV6000系列），实验步骤使用说明：试剂盒组成试剂A: 3% H2O2试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）PV6001（兔）适用于兔来源的一抗PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗3.0ml- 价格￥300.00 / 6.0ml- 价格￥580.00 / 18ml- 价格￥1780.00试剂盒规格及贮存条件规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年免疫组化染色步骤1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。
免疫组化SP法
免疫组化SP法步骤2008-08-14 17:31SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步骤啊,具体如下：1.烤片，68℃，20分钟,2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色
常用免疫组化染色方法SP法免疫组化染色1. 原理：链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素（Biotin）连接的部位，且二者间有极强的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。
S-P采用生物素标记的第二抗体与链霉素抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
2. 基本染色方法：（1）石蜡切片脱蜡至水。
（2）3%H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3）蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
（4）5～10%正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。
倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃过夜。
（5）PBS冲洗，5分钟×3次。
（6）滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10～30分钟; 或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（7）PBS冲洗，5分钟×3次。
（8）滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素(PBS 稀释)，37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟。
（9）PBS冲洗，5分钟×3次。
（10）显色剂显色（DAB或AEC）。
（11）自来水充分冲洗，复染，封片。
（附，冰冻切片免疫组化染色步骤：冰冻切片4~8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
用3%过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗，5分钟×2次。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取岀来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原-一抗-二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发岀一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,形成抗原—一抗—二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）.通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量.组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术.它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组化SP法步骤
•免疫组化SP法步骤 生物谷网站SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法.按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。
按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法)；按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。
一般的sp法步骤啊,具体如下：1.烤片，68℃，20分钟,2. 常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯I 20min --二甲苯II 20 min--100%酒精I 10min --100%II 10min --95% 5min-- 80% 5min-- 70% 5min3.阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O2 37℃孵育10min，PBS冲洗3X5min；4. 抗原修复:置0.01M枸橼酸缓冲液（PH 6.0）中用煮沸（95℃，15－20min），自然冷却20min 以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。
5. 正常羊血清工作液封闭，37℃10 min，倾去勿洗.6. 滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）；滴加生物素标记二抗, 37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;7. 滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min, PBS冲洗3X5min;8. DAB/ H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原- 一抗- 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组化SP法与SABC
SP法
1）脱蜡、水化;
2)ＰBS洗2～３次各5分钟；ﻫ3）３%H2Ｏ2(80%甲醇）滴加在TMA上,室温静置10分钟;
8）PＢS洗三次每次2分钟。ﻫ9）滴加生物素化二抗，２０℃～3７℃２０分钟。
10）PBC洗３次每次2分钟。
11）滴加试剂SABC,20℃～３7℃20分钟。
1２)PBS洗4次每次5分钟。ﻫ１3)DＡB显色:DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色(镜下掌握显色程度)。
14）蒸馏水洗。苏木素复染２分钟、盐酸酒精分化。ﻫ1５)脱水、透明、封片、镜检。
(A★为ＨRP标记的卵白素)Ａ★与2抗的生物素结合,aｖiｄｉn起桥联作用。如将该法中的卵白素（ａvｉdｉｎ)变换成链霉卵白素 （stｒｅｐtａvidin）,LＡB法即成LsAＢ法,或称SP法。
据认为LAB法比ABC法敏感2~４倍，而ＬsＡB法因strｅptavidin不与组织细胞中内源性生物素结合而特异性更高。现在SP法已趋于取代ABC法而广为应用。
免疫组化ＳP法与SABC
———————————————————————————————— 作者:
———————————————————————————————— 日期:
ﻩ
ABＣ法:ABC代表的是亲和素－生物素-过氧化物酶复合物。利用抗生物素分 别连接生物素标记的第二抗和生物素标记的酶。但是此法注意内源性生物素活性的消除，以减少非特异性的染色。
SＰ法
1脱蜡水化
2蒸馏水中5分钟
3用蒸馏水或PＢS配置新鲜的3%H2Ｏ2室温封闭10分钟蒸馏水洗1次ﻫ4抗原修复
免疫组化染色SP法
免疫组化SP 法一．实验原理SP 法是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。
链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000. 同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。
亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变为中性蛋白质。
链霉亲和素等电点接近中性，IP=6.0~6.5 ，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。
根据研究，SP 大约可形成一百万个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所形成的复合物。
大量的酶将保证SP具有很高的敏感性。
SP兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。
三．操作步骤1．载玻片防脱片处理：可选择APES，捞片后置烤箱60℃60min 以使切片紧密粘附。
2．切片常规脱蜡3．30%过氧化氢1 份+蒸馏水10 份混合，室温10min 以灭活内源性酶。
蒸馏水洗 3 次4．热修复抗原：将切片浸入0.01M 构橼酸盐缓冲液（PH6.0），高压3min，之后冷却20min，再用PBS洗。
5．滴加5%BSA封闭液，室温10min，甩去多余液体，不洗6．滴加一抗（1:300 ）4℃过夜。
PBS（PH7.2~7.6）洗2min，共洗三次。
7．滴加生物素化的山羊抗兔IgG（1:100 ），37℃30min。
PBS （PH7.2~7.6 ）洗2min，共洗3 次。
8．滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素（1:100 ）PB（S PH7.2~7.6）洗5min，共 4 次。
9．DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)。
取1ml 蒸馏水，加设计盒中A,B,C 试剂各 1 滴，混匀后加至切片。
室温显色，镜下控制反应时间，一般5~30min 之间，蒸馏水洗涤。
10．苏木素轻度复染2min，脱水，透明，封片，显微镜观察。
免疫组织化学染色 实验
一 目的
• 掌握免疫组织化学（S抗原与抗体特异性结合的原理，使用 试剂盒所提供的生物素化二抗与一抗特异 结合，然后加入辣根过氧化物酶标记的链 霉卵白素，底物被辣根过氧化物酶分解显 色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、 定性及定量的研究。
• DAB显色原理：过氧化物酶催化底物中的过氧化氢水解，释放出氧，使
DAB氧化为吩嗪多聚体，在光镜下为不溶于水的棕色颗粒。
• 10 蒸馏水终止反应，洗净DAB，晾干 • 11 脱水，透明，封片： • 80%，95%乙醇各1次，1分钟/次——100%乙醇2次，1分钟/次—— 二甲苯透明，2次，1分钟/次——中性树胶封片 • 注意设置阴性对照和阳性对照
三 器材与试剂
• 1 器材: 显微镜,染色缸, 镊子,吸水纸，湿盒. • 2 材料: 小鼠小肠冰冻切片 • 3 试剂: PBS，SP试剂盒，一抗，DAB试剂 盒， 乙醇，二甲苯，中性树胶
四 步骤
• • • 1 冰冻切片——冷丙酮4℃固定15分钟——干燥 2 PBS洗3次，3分钟/次 3 加1滴3%H2O2，室温10分钟（灭活内源性过氧化物酶）
五 结果
• β-actin，广泛分布于各种组织中，是肌肉细丝及 细胞骨架微丝的主要成分，具有收缩功能。定位 于细胞质内，为粗细一致的棕黄色颗粒，显色强 时为棕褐色。
•
• • •
4 PBS洗3次，3分钟/次
5 加1滴血清，室温10分钟（封闭组织中的电荷基团） 6 倾去血清，勿洗，加50ul一抗，37℃孵育40分钟-1小时（在湿盒中进行，避免组 织面干燥）
• 7 PBS洗3次，3分钟/次，加一滴二抗，37℃孵育10分钟 • 8 PBS洗3次，3分钟/次， 加1滴SP工作液，室温10分钟 • 9 PBS洗3次，3分钟/次，加DAB工作液，孵育1-2分钟（肉眼变色即可） • DAB工作液现配，为1ml蒸馏水加一滴A（缓冲液）, B（浓缩型DAB， 即二氨基联苯胺，是辣根过氧化物酶的显色底物）,C （浓缩的H2O2） 混匀，因DAB有潜在致癌作用，注意防护。
免疫组化染色方法（SP法和SABC法）
免疫组化染色方法（SP法和SABC法）免疫组化染色方法（SP法和SABC法）来源：易生物实验浏览次数：854 网友评论 0 条免疫组化染色方法（SP法和SABC法）关键词：染色免疫免疫组化染色SP法SABC法SP法1）脱蜡、水化；2）PBS洗2～3次各5分钟；3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；6）PBS洗2～3次各5分钟；7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。
甩去多余液体。
8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
10）PBS洗3次各5分钟；11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
13）PBS洗3次各5分钟；14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；15）PBS或自来水冲洗10分钟；16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；17）自来水冲洗10～15分钟；18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法1)脱蜡、水化。
2)PBS洗两次各5分钟。
3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
4)抗原修复。
5)PBS洗5分钟。
6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。
甩去多余液体。
7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
8)PBS洗三次每次2分钟。
9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
10)PBC洗3次每次2分钟。
11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
12)PBS洗4次每次5分钟。
13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
14)蒸馏水洗。
苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
15)脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂 (荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体（第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，形成抗原 - 一抗 - 二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）。
通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。
组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术。
它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。
当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光，从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
免疫组化sp法
免疫组化SP法引言免疫组化(SP)法是一种常用的免疫组织化学染色技术，用于检测细胞和组织中蛋白质的表达情况。
相较于传统的免疫组化方法，SP法的敏感性和特异性更高，能够提供更准确的结果。
本文将介绍免疫组化SP法的原理、步骤和应用，并提供一些实验技巧和注意事项。
原理免疫组化SP法结合了辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）的酶标系统。
HRP可以催化有机物质与底物间的氧化还原反应，生成可见光。
而AP则能够催化磷酸酯与底物间的酸碱中和反应，生成二级离子，进而酶促反应。
SP法利用这两个酶的双重酶标效应，使得染色结果更明显，背景噪音更低。
实验步骤免疫组化SP法通常包括以下步骤：1.取得标本：首先需要准备待检测的组织样本或细胞制片。
可以选择固定、冻存或石蜡包埋样本。
2.制备切片：将组织样本切割成适当的厚度，一般为4-5μm。
使用玻璃片或载玻片使切片固定在切片架上。
3.脱脂去蜡：将切片在温水中浸泡片刻，去除石蜡并暴露组织。
4.抗原修复：根据需要，在组织上施加适当的抗原修复方法，以恢复由于石蜡包埋而导致的抗原损失。
5.抗体孵育：将适当的一抗或多抗添加到切片上，使其与目标蛋白结合。
根据需要，可以在抗体孵育前进行非特异性蛋白质封闭，以防止非特异性结合。
6.一抗信号放大：使用HRP标记的二抗与前一步骤结合的抗体结合。
在此步骤中，HRP将抗原邻近的HRP底物转化为可见的颜色。
7.二抗信号放大：使用AP标记的二抗与前一步骤结合的一抗结合。
AP 酶可将AP底物转化为色素，产生二级离子，使染色结果更明显。
8.染色：在适当的时间和温度条件下，在样本上施加适当的染色试剂，使目标蛋白在显微镜下呈现出想要的颜色。
9.倒置显微镜：使用倒置显微镜观察染色结果，根据需要进行图像拍摄记录。
实验技巧在进行免疫组化SP法实验的过程中，有一些技巧可以帮助提高实验效果：1.样本处理：对样本进行适当的抗原修复和封闭，以免出现非特异反应。
2.抗体选择：选择与目标蛋白有高度亲和力的特异性抗体，以提高染色的准确性。
免疫组化(SP法)原理步骤及试剂
免疫组化原理步骤及试剂原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理,通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素) 显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究。
众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。
免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来,以其作为抗原或半抗原去免疫实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(第一抗体）作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶（常用辣根过氧化物酶）或生物素等处理后再与前述抗原成分结合,形成抗原—一抗—二抗复合物，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的,因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来（常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒）.通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分,在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物,从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量.组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。
分类（常用）1、免疫荧光方法最早建立的免疫组织化学技术.它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素,以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原,在荧光显微镜下观察.当抗原抗体复合物中的荧光素受激发光的照射后即会发出一定波长的荧光,从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。
由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便，所以在临床病理诊断、检验中应用比较广。
2、免疫酶标方法免疫酶标方法是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。
基本原理是先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。
免疫酶标技术是目前定位准确、对比度好、染色标本可长期保存，适合于光、电镜研究等。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫组化SP法
一．实验原理
SP法是专为免疫组化和其他免疫检测而设计的，用以显示组织和细胞中抗原分布。
链霉亲和素是一种从链霉菌中提取的蛋白质，分子量47000.同亲和素一样，对生物素分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍。
亲和素是一个碱性蛋白质（IP=10），经改造后可以转变为中性蛋白质。
链霉亲和素等电点接近中性，IP=~，对组织和细胞的非特异吸附很低，基于链霉亲和素的免疫组化方法背景很低。
根据研究，SP大约可形成一百万个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所形成的复合物。
大量的酶将保证SP具有很高的敏感性。
SP兼具高敏感性，低背景和操作简便的优点。
二．试剂来源
三．操作步骤
1．载玻片防脱片处理：可选择APES，捞片后置烤箱60℃60min 以使切片紧密粘附。
2．切片常规脱蜡
3．30%过氧化氢1份+蒸馏水10份混合，室温10min以灭活内源性酶。
蒸馏水洗3次
4．热修复抗原：将切片浸入构橼酸盐缓冲液（），高压3min，之后冷却20min，再用PBS洗。
5．滴加5%BSA封闭液，室温10min，甩去多余液体，不洗
6．滴加一抗（1:300）4℃过夜。
PBS（~）洗2min，共洗三次。
7．滴加生物素化的山羊抗兔IgG（1:100），37℃30min。
PBS （~）洗2min，共洗3次。
8．滴加试剂辣根酶标记链霉卵白素（1:100）PBS（~）洗5min，共4次。
9．DAB显色：使用DAB显色试剂盒(AR1022)。
取1ml蒸馏水，加设计盒中A,B,C试剂各1滴，混匀后加至切片。
室温显色，镜下控制反应时间，一般5~30min之间，蒸馏水洗涤。
10．苏木素轻度复染2min，脱水，透明，封片，显微镜观察。