链霉菌表达系统作业

不产生黑色素， 不产生黑色素，重组菌落变为白色
五、链霉菌作为表达系统的特点
• 优点： 优点：
1.链霉菌工业化发展成熟，适于大规模产业化。 链霉菌工业化发展成熟，适于大规模产业化。 链霉菌工业化发展成熟 2.链霉菌基本为非致病菌，不产生内毒素。 链霉菌基本为非致病菌， 链霉菌基本为非致病菌 不产生内毒素。 3.可以进行高密度培养，并能在相当长的一段时间保持其代 可以进行高密度培养， 可以进行高密度培养 谢活性。在稳定期，细胞仍能合成次级代谢产物。 谢活性。在稳定期，细胞仍能合成次级代谢产物。 4.可分泌胞外酶，可将分泌信号肽序列纳入载体，使外源蛋 可分泌胞外酶， 可分泌胞外酶 可将分泌信号肽序列纳入载体， 白可以分泌到胞外。 白可以分泌到胞外。在胞外分泌的异源蛋白能正确折叠的 可能性大，且易被纯化。 可能性大，且易被纯化。 5.链霉菌中有许多可利用的转录起始信号，利用来自链霉菌 链霉菌中有许多可利用的转录起始信号， 链霉菌中有许多可利用的转录起始信号 的能充分产生及分泌蛋白的转录和分泌信号肽基因， 的能充分产生及分泌蛋白的转录和分泌信号肽基因，可以 轻易地在链霉菌中进行基因产物的高表达。 轻易地在链霉菌中进行基因产物的高表达。
DNase印记法 印记法
DNA 结合 蛋白
45bp 与原核生物典型启动子-10和 区相类似 与原核生物典型启动子 和-35区相类似
硫链丝菌素
Hg2+
MerR蛋白 蛋白
tipAL
N端 端 螺旋—转角 螺旋 螺旋 转角—螺旋 转角
SoxR蛋白 蛋白
同源性
TipAL具有DNA结合蛋白活性 具有 结合蛋白活性
链霉菌作为表达系统的特点
• 缺点： 缺点：
1.在链霉菌中表达的真核异源蛋白往往产量均 在链霉菌中表达的真核异源蛋白往往产量均 较低，达不到工业化生产水平。 较低，达不到工业化生产水平。 2.使外源蛋白糖基化能力有限。 使外源蛋白糖基化能力有限。 使外源蛋白糖基化能力有限
与大肠杆菌对比： 与大肠杆菌对比：
链霉菌S.albogriseolus S-325 链霉菌 SSI信号肽序列 信号肽序列 目的基因 ：SSI基因 基因 载体：pIJ702 载体： 宿主： ． 宿主：S．lividans 66 选择性标记： 选择性标记：mel、tsr基因 基因 mel基因失活 基因失活
蛋白质
碱性蛋白酶活性
SSI分泌产物 分泌产物 其蛋白活性与天然产物 相同
硫链丝菌素
tipAS tipA
tipAL
＞＞
tipAS
人体中转化生长因子TGF-α在链霉菌中的表达 在链霉菌中的表达 人体中转化生长因子 转化生长因子：肿瘤细胞能产生一 种刺激静止性生长的细胞呈非静止性生 长的多肽因子。TGF-α是一种多功能肽 类物质，可与表皮生长因子受体结合发 挥一系列的生物学功能，与肿瘤发生关 系甚为密切，是反映肿瘤细胞恶变具有 指示意义的分子指标。
方法并不通 用或者仅限 于某种特定 的链霉菌 单基因操作方面更加方便
应用
在链霉菌中的 变铅青链霉菌和生二素链霉菌等对 应用实例比较 外源DNA 无限制修饰作用的菌种 外源 少
最常用方法： 介导的质粒转化原生质体法。 最常用方法： PEG- 介导的质粒转化原生质体法。在进 行转化实验之前, 首先要制备原生质体, 行转化实验之前 首先要制备原生质体 要求原生质体有较高 的形成率和再生率。 的形成率和再生率。
谷胱甘肽硫 转化酶活性 谷胱甘肽硫转化酶 (GST) 过氧化物酶 活性
GST在癌症及肿瘤的治疗以及保护生物体过氧化 在癌症及肿瘤的治疗以及保护生物体过氧化 反应中起着重要的作用。 反应中起着重要的作用。
材料: 材料
1.菌株和质粒:大肠杆菌(E.coli) ，变铅青链霉菌TK54及质粒 Bluescript M13-。大肠杆菌正选择质粒pKRV。 2.培养基:大肠杆菌用LB培养基，链霉菌液体生长培养基(YEME)， 原生质体再生培养基(R2YE)及基本培养基(MM) 。 3.抗生素:苄氨青霉素贮存液浓度为50mg/ml，使用浓度为 50µg/ml。硫链丝菌素(Thio，thiostrepton)贮存液浓度为 50mg/ml，在MM中使用浓度为7µg/ml，在R2YE培养基中使 用浓度为50µg/ml，上述抗生素贮存液均置20℃冰箱保存。 4.酶和试剂:所用限制性内切酶EcoRV、BamHΙ及Ndel，BglII和 T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶，异丙基-β-D-硫代半乳糖昔 (IPTG) 亲合层析柱用谷胱甘肽琼脂糖(Glutathione-Agarose)
过程： 过程：
Step1.构建质粒 构建质粒
Step2.大肠杆菌感 大肠杆菌感 受态细胞的制备
转化
Step3.链霉菌原生 链霉菌原生 质体制备、 质体制备、再生
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Step4.转化结果检验 转化结果检验
提取
Step5.蛋白提取及纯化 蛋白提取及纯化
PtipA
硫链丝菌素
DNA 结合 蛋白
tipAL tipAS
优点
应用范围广, 应用范围广 可被用于鸟枪克隆和 阻断变株随机互补实验, 阻断变株随机互补实验 这在快速 筛选目的基因方面着无法比拟的 优势
程序相对简 方便、 单、方便、 快捷
可以克服宿主对 外源DNA 的限制 外源 性障碍。 性障碍。
缺点
因涉及到原生质体的制备与再生相 对耗时且工作环节多 存在限制性障碍
链霉菌表达系统与方法
主要内容： 主要内容：
一、生物学特性以及目前应用简介 二、链霉菌表达系统的组成 三、表达的一般步骤 四、应用实例 五、链霉菌表达系统特点及前景展望
一、链霉菌生物学特征
链霉菌是一类好氧、丝状能形成孢子的 革兰氏阳性细菌，其主要特点为： 1.G+C含量73%，高于其他类宿主菌 56%~65%。 2.是一种非严格广谱宿主菌。 3.可识别多种外源原核启动子。 4.包膜缺乏分泌障碍，可以得到蛋白的分泌 产物，易纯化，可用于工业生产。
Thank you!
人胰岛素、 大肠杆菌 人胰岛素、IFN-α2、生长激素 在大肠杆菌中， 在大肠杆菌中，外源基因的表达量可达总蛋白的 10%~30%。然而许多在大肠杆菌中表达出来的真核基因 。 产物常常是不可溶的、无生物活性的、或者是不能形成正 产物常常是不可溶的、无生物活性的、或者是不能形成正 不可溶的 确二硫键的蛋白质 的蛋白质。 确二硫键的蛋白质。 尽管分泌型的表达载体可用来部分解决上述问题， 尽管分泌型的表达载体可用来部分解决上述问题，但 是在分泌型的大肠杆菌表达系统中， 是在分泌型的大肠杆菌表达系统中，被运送到细胞的周质 中的外源基因产物时常只有极少量的是具有正确三维折叠 和二硫键连接的蛋白质，其含量常常只有0.1~1.0mg·L-1。 和二硫键连接的蛋白质， 含量常常只有
链霉菌的目前应用
目前，70%以上抗生素产生菌是链 霉菌。此外，许多细胞因子和真核基因 产物已在链霉菌中获得表达，如nIFNα1、 hIL-2、hTNF、前胰岛素原、牛生长激 素和牛卡介素等。其中，前四种已获得 分泌性表达。
二、链霉菌表达系统的组成
＊常用宿主：变铅青链霉菌、天蓝色链霉 常用宿主 菌等 ＊载体：高拷贝载体（pIJ101、pIJ702) 、 载体 低拷贝载体（pIJ922、pIJ940）、穿梭载 体（pHJL197）、柯斯载体、接合转移载 体、 噬菌体载体（KC304、KC505）、表 达载体、分泌载体
三、外源蛋白在链霉菌中表达的一般步骤
（1）将编码外源蛋白的DNA序列克隆到含有 链霉菌启动子和转录终止子的表达框中； （2）转化及在宿主中稳定维持该DNA融合产 物； （3）外源蛋白在特定培养条件下合成； （4）外源蛋白的纯化及其与天然产物的比较
方法
转化 PEG- 介导的质粒转化原生质体法 电穿孔法 噬菌体转导法 不仅可以转导 对外源DNA 无 对外源 限制性的链霉 菌，也可以转 导已被确认具 有限制性系统 的链霉菌 结合转移法
四、应用实例
一、表达载体： 表达载体： 人体中谷胱甘肽硫转化酶在链霉菌中的表达 分泌载体： 二、分泌载体： 人体中转化生长因子TGF-α在链霉菌中的表达 人体中转化生长因子 在链霉菌中的表达
人体中谷胱甘肽硫转化酶在链霉菌中的表达： 人体中谷胱甘肽硫转化酶在链霉菌中的表达： 使谷胱甘肽分子上的 巯基(SH)与广泛的亚 硝基苯类化合物结合， 使这类致癌物转化成 无毒的化合物 能与细胞内源的一些 阴离子化合物(如胆 红素和亚铁血红素) 结合并参与运输
链霉菌 nIFNα1、hIL-2、hTNF、前胰岛素原 、 、
不同于大肠杆菌，它们只具有单层细胞外膜， 不同于大肠杆菌，它们只具有单层细胞外膜，分泌的 蛋白质常常能直接分泌到培养基中，利于分离纯化。 蛋白质常常能直接分泌到培养基中，利于分离纯化。
与大肠杆菌对比展望
前景展望
基因表达的研究方面链霉菌还远远落后 于大肠杆菌，但是链霉菌在表达和分泌 表达和分泌有活 于大肠杆菌，但是链霉菌在表达和分泌有活 性的蛋白质方面则远远优于大肠杆菌。 性的蛋白质方面则远远优于大肠杆菌。实践 证明链霉菌能产生多种多样的可溶性的具有 生物活性的蛋白质。我们有理由相信，随着 生物活性的蛋白质。我们有理由相信， 研究的深入， 研究的深入，越来越多的真核基因将比较容 易地在链霉菌中得到高水平的表达， 易地在链霉菌中得到高水平的表达，链霉菌 亦必将成为外源基因表达最具潜力的宿主。 亦必将成为外源基因表达最具潜力的宿主