链霉菌表达系统作业
链霉菌对小麦条锈病生物防治机制研究
链霉菌对小麦条锈病生物防治机制研究链霉菌是一种常见的土壤真菌，被广泛应用于农业生物防治领域。
小麦条锈病是小麦生产中的一种重要病害，给小麦产量和质量造成严重影响。
链霉菌对小麦条锈病的生物防治机制引起了科研工作者的广泛关注。
本文将对链霉菌对小麦条锈病的生物防治机制进行研究。
链霉菌以其广谱的抗菌活性而被广泛应用于农业生物防治中。
研究表明，链霉菌对小麦条锈病的生物防治机制主要包括以下几个方面。
首先，链霉菌通过竞争作用抑制小麦条锈病菌的生长。
小麦条锈病菌需要寄生于小麦叶片上进行生长，而链霉菌能够迅速占领小麦叶片表面的营养资源，使得条锈病菌无法寻找到合适的生长环境，从而抑制了其生长繁殖。
其次，链霉菌产生抗菌物质对抗小麦条锈病菌的感染。
链霉菌能够产生一系列抗菌物质，如链霉素、霉菌素等，这些化合物具有强大的抗菌活性。
研究发现，链霉菌产生的抗菌物质能够直接抑制小麦条锈病菌的生长，遏制病害的进一步发展。
另外，链霉菌还能够激活小麦的抗病能力，增强其抵抗小麦条锈病的能力。
研究发现，链霉菌通过诱导小麦产生一系列抗病相关蛋白和抗氧化酶，增强小麦细胞膜的稳定性和抵抗力，从而提高小麦对条锈病菌的抵抗性。
此外，链霉菌还能够诱导小麦产生一类特殊的化合物，称为黄酮类物质。
这类化合物具有广谱的抗菌活性，不仅能够抑制小麦条锈病菌的生长，还能够对抗其他病原菌的感染。
研究人员通过实验发现，链霉菌诱导小麦产生的黄酮类物质对小麦条锈病的防治起到了积极的作用。
总之，链霉菌对小麦条锈病的生物防治机制主要包括竞争作用、产生抗菌物质、激活小麦的抗病能力和诱导产生黄酮类物质等方面。
这些机制相互作用，共同发挥了链霉菌对小麦条锈病的防治作用。
未来的研究中，还需要进一步探究链霉菌对小麦条锈病的作用机制，提高生物防治效果，并广泛应用于实际生产中。
链霉菌通过以上提到的机制对小麦条锈病进行生物防治的研究中还有一些重要的进展。
一方面，研究人员发现链霉菌通过激活小麦的免疫系统来抵御条锈病的侵染。
变铅青链霉菌TK24secE启动子表达特性的研究
究逐 步 深 入, 模 式 菌 天 蓝 色 链 霉 菌 ( Streptomyces coelicolor ) 的基因组测序已经完成[ 1] 。与此同时, 变 铅青链霉菌( S. lividans ) 经 10 余年的研究也已发展 成为新的高效分泌异源蛋白的表达体系, 许多真核 蛋白在 该体 系 中获 得了 成 功的 分 泌表 达, 如 TNF [ 2] , 鲑鱼降钙素[ 3] 等。变铅青链霉菌具有高效 分泌机制, 能将具有生物活性的异源表达产物直接 分泌到培养液中, 但变铅青链霉菌分泌外源蛋白的 量并 不稳 定, 不 同的 异源 蛋白 表 达水 平可 从 300 mg L到几 g L 不等, 说明有些异源基因的分泌表达 存在瓶颈部位。对变铅青链霉菌分泌机制的研究将
通讯作者。E-mail: binhong@ 95777. com
4期
王丽非等: 变铅青链霉菌 TK24 secE 启动子表达特性的研究
371
关键词: Streptomy ces lividans ; secE 启动子; xylE
中图分类号: Q765
文献标识码: A
文章编号: 0379-4172( 2003) 04- 0370-06
到目前为止, 对链霉菌 Sec 蛋白转位系统, 尤其 是对 sec 基因的表 达调控 的了 解还很 少。Morosoli 等[ 7] 通过测定 sec 基因的 mRNA 水平分析了不同培 养条件下 sec 基因的表达水平。本文以儿茶酚加氧
链霉菌基因转移的方法
生物工程进展 2002,Vol.22,No.1技术与方法链霉菌基因转移的方法吴胜夏焕章(沈阳药科大学生物制药系,沈阳110016)摘要本文介绍了用于链霉菌基因转移的各种方法,涉及原生质体转化、电穿孔、接合转移和噬菌体转导,对影响链霉菌基因转移的各种因素进行了分析。
关键词链霉菌原生质体转化电穿孔接合转移噬菌体转导链霉菌是一类重要的工业微生物,它可以产生各种各样的生物活性物质,越来越受到重视,链霉菌基因工程技术的发展,使得克隆次级代谢产物生物合成基因、有目的地定向改造基因、提高基因的表达水平以改造菌种的生产能力、基因重组产生新化合物成为可能。
在对一个链霉菌进行基因改造时,首要的问题就是建立所研究菌株的基因转移系统,这是实现对其基因功能分析、生物合成基因簇定位、基因改造等一系列工作的基础。
然而,有许多链霉菌,尤其是有实用价值的链霉菌在进行DNA转化时,均遇到很大困难。
为克服这一困难,科研人员进行许多研究。
通过分离内源性质粒、筛选噬菌体并通过改造其结构而构建了许多有用的克隆载体。
在方法学上也进行了许多有益的探索,建立了几种基因转移方法如转化、转导和接合转移等。
下面对这些方法在链霉菌中应用逐一进行介绍。
1转化包括PE G-介导的质粒转化原生质体(polyeth ylene glycol-induced plasmid transformation of proto plasts)和电穿孔(electroporation)。
前者是链霉菌基因操作中最常用的方法,后者主要用于植物和动物细胞,在链霉菌中也有成功的报道。
1.1PEG-介导的质粒转化原生质体转化大肠杆菌的关键是用冷刺激和CaCl2处理诱导感受态细胞,由此形成通过质粒中介的克隆操作,但这在链霉菌中尚无成功的报道。
在Okanishi 和他的合作者有关链霉菌原生质体形成、再生和转染工作的基础上,Bibb等发现当有PEG存在时,质粒DNA能以很高的频率转化变铅青链霉菌原生质体[1]。
链霉菌基因实验操作
链霉菌实验操作1录入时间:2009/8/28 16:09:31 来源：食品科技网一、培养基、抗生素、生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrerm Eaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?501051010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-5*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
链霉菌微生物医药基因工程结课报告
链霉菌微生物医药基因工程结课报告篇一：摘要:本文介绍了链霉菌微生物医药基因工程的基本原理和应用领域。
通过构建合适的菌株、选择合适的表达载体、构建基因表达系统以及优化基因表达结果,链霉菌微生物医药基因工程可以实现药物筛选、药物研发和药物生产等多种功能。
此外,本文还探讨了链霉菌微生物医药基因工程的未来发展方向和应用前景。
正文:一、链霉菌微生物医药基因工程的基本原理链霉菌是一种具有强大微生物活性的真菌,在医药领域有着广泛的应用前景。
近年来,链霉菌微生物医药基因工程逐渐成为了一个热门的研究领域。
链霉菌微生物医药基因工程的基本原理是通过利用链霉菌的微生物特性,构建具有特定功能的微生物菌株,并将其应用于医药领域。
链霉菌微生物医药基因工程的基本原理包括:1. 构建合适的菌株:根据不同的需求,构建适合应用于医药领域的链霉菌菌株。
2. 选择合适的表达载体:选择合适的表达载体,将链霉菌的基因表达到适当的目标蛋白或核酸序列上。
3. 构建基因表达系统:构建适合链霉菌基因表达系统的基因表达平台,实现链霉菌基因的高效表达。
4. 优化基因表达结果:优化链霉菌基因表达的结果,包括调整表达温度、诱导剂、培养基成分等,获得高效表达且稳定性好的菌株。
二、链霉菌微生物医药基因工程的应用领域链霉菌微生物医药基因工程的应用领域非常广泛,包括以下几个方面:1. 药物筛选:利用链霉菌微生物医药基因工程,可以筛选出具有特定功能的微生物菌株,用于药物筛选。
2. 药物研发:利用链霉菌微生物医药基因工程,可以构建新的药物基因序列,并通过基因表达技术将药物基因表达到适当的蛋白或核酸序列上,进行药物研发。
3. 药物生产:利用链霉菌微生物医药基因工程,可以构建适合生产药物的微生物菌株,并通过发酵技术将药物基因表达到适当的蛋白或核酸序列上,进行药物生产。
三、链霉菌微生物医药基因工程的未来发展方向和应用前景随着科技的不断进步,链霉菌微生物医药基因工程也将继续发展。
一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法及重组链霉菌[发明专利]
![一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法及重组链霉菌[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/628a5e33a7c30c22590102020740be1e650ecc9b.png)
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011640261.1(22)申请日 2020.12.31(71)申请人 河南省商业科学研究所有限责任公司地址 450000 河南省郑州市金水区文化路87号申请人 河南省科学院(72)发明人 朱海华 王鋆坦 王小瑞 平洋 谭静 张亚勋 周莉 王慧 (74)专利代理机构 成都弘毅天承知识产权代理有限公司 51230代理人 李颖(51)Int.Cl.C12N 15/76(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12N 9/16(2006.01)C12R 1/465(2006.01)C12R 1/48(2006.01) (54)发明名称一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法及重组链霉菌(57)摘要本发明属于基因工程领域，涉及一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法，步骤一，选择磷脂酶D的异源高效表达宿主，步骤二，筛选磷脂酶D合成基因的最佳来源，步骤三，获取链霉菌来源的磷脂酶D基因片段，步骤四，连接目的基因形成磷脂酶D重组质粒，步骤五，重组质粒接合转移至宿主菌，步骤六，重组菌株的发酵培养及磷脂酶D酶活检测，进而得到高效表达磷脂酶D的重组链霉菌。
选用链霉菌来源的磷脂酶D进行重组蛋白异源表达，具有天然优势，对磷脂酶D合成基因进行了密码子优化，选取变铅青链霉菌SBT5作为异源表达宿主，优异的异源表达效果加上良好的胞外活性分泌表达效果，使得该重组菌株具有极高的创新性和实用性。
权利要求书1页 说明书6页序列表3页CN 112575023 A 2021.03.30C N 112575023A1.一种在链霉菌中高效表达磷脂酶D的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，选择磷脂酶D的异源高效表达宿主，选用链霉菌作为宿主，同时选用链霉菌来源的磷脂酶D基因作为目的基因作为基因工程的改造对象；步骤二，筛选磷脂酶D合成基因的最佳来源，通过酶活测定进行对比实验，选用S.antibioticus抗菌素链霉菌和S.chromofuscus色褐链霉菌作为获得目的基因的目标菌株；步骤三，获取链霉菌来源的磷脂酶D基因片段，通过PCR扩增技术得到抗菌素链霉菌来源的磷脂酶D基因和色褐链霉菌来源的磷脂酶D基因；步骤四，连接目的基因形成磷脂酶D重组质粒，将抗菌素链霉菌来源的磷脂酶D基因分别连接链霉菌常用表达载体和链霉菌高效表达载体，形成第一重组质粒和第三重组质粒，再将色褐链霉菌来源的磷脂酶D基因分别连接链霉菌常用表达载体和链霉菌高效表达载体，形成第二重组质粒和第四重组质粒；步骤五，重组质粒接合转移至宿主菌，通过接合转移手段，进而得到与第一重组质粒、第二重组质粒、第三重组质粒、第四重组质粒依次对应的第一重组菌株、第二重组菌株、第三重组菌株、第四重组菌株；步骤六，重组菌株的发酵培养及磷脂酶D酶活检测，通过对原始菌株和重组菌株的酶活检测，进而找到表达效果最好的菌株，其中原始菌株为S.lividans变铅青链霉菌、S.antibioticus抗菌素链霉菌以及S.chromofuscus色褐链霉菌；而重组菌株为步骤五所得的第一重组菌株、第二重组菌株、第三重组菌株、第四重组菌株。
遗传学实验20种技术
一、DNA提取1、实验原理通常采用机械研磨的方法破碎植物的组织和细胞，由于植物细胞匀浆含有多种酶类(尤其是氧化酶类)对DNA的抽提产生不利的影响，在抽提缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)以降低这些酶类的活性。
在液氮中研磨，材料易于破碎，并减少研磨过程中各种酶类的作用。
十二烷基肌酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(简称为CTAB)、十二烷基硫酸钠(简称SDS)等离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使DNA得以游离出来。
再加入苯酚和氯仿等有机溶剂，能使蛋白质变性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很强，经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质。
上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物总DNA溶液。
二、RNA提取1、实验原理Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂,在匀浆和裂解过程中,能在破碎细胞、降解蛋白质和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA酶,同时能保持RNA的完整性。
在氯仿抽提、离心分离后,RNA处于水相中,将水相转管后用异丙醇沉淀RNA2、操作步骤1、取植物嫩叶,液氮研磨,每1.5ml tube分装0.1克样品;2.每管加入0.5ml Trizol液,迅速混匀,注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10%。
3、室温下静置5~10分钟以利于核酸蛋白质复合体的解离4、加入O.5mI的氯仿,盖紧离心管,用手剧烈摇荡离心管15秒,室温静置5分钟5、10000r/min离心10分钟6、取上清液(水相)转入一新的离心管,加入等体积异丙醇,室温放置10分钟,10000r/min离心10分钟。
7、弃去上清液,加入至少1ml的70乙醇,涡旋混匀,4℃下7500r/min离心5分钟。
8、小心弃去上清液,然后室温或真空干燥5—10分钟,注意不要干燥过分,否则会降低RNA的溶解度。
然后将RNA溶于TE或DEPC处理过的水中,必要时可55℃—60℃水溶10分钟。
链霉菌H197 mtg基因毕赤酵母表达载体的构建与鉴定
下 游 ： ｃＲ Ｉ Ｃ Ｇ Ａ ｒ Ｔｒ Ｃ Ｇ Ｃ Ｇ Ｃ Ｅｏ Ｃ Ｇ Ａ １ Ｃ Ａ Ｇ Ｃ Ａ Ｃ Ｃ ｒ
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完 成．
ｓ． １７为本 实验 室保 存． ｐＨ９
１ １ ２ 主要 试 剂 ．．
重组 质粒 Ｐ Ｒ鉴定 引物合成 ， 序列如下 ： Ｃ 引物
５ ＡＯＸ１ ｉ ｒ ＧＡＣＩ ｍｅ Ｐｒ ’ ＧＧＴＴ ＡＡＴ ＣＣ ＴＧＡＣＡＡＧＣ：
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《具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立》
《具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立》一、引言稻瘟病是一种对水稻生产造成严重威胁的病害，而链霉菌因其抗稻瘟病菌活性被广泛研究。
为了有效应对稻瘟病病害，本文通过深入研究，成功分离并鉴定了具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株，并建立了其接合转移方法。
二、材料与方法（一）材料本实验所使用的材料包括：稻瘟病感染的水稻叶片、土壤样品、培养基等。
（二）方法1. 链霉菌的分离与纯化采用涂布法在选择性培养基上分离链霉菌。
经过多次划线纯化，得到纯种链霉菌。
2. 链霉菌的鉴定通过形态观察、生理生化试验及分子生物学方法（如16S rRNA基因序列分析）对链霉菌进行鉴定。
3. 接合转移方法的建立采用原生质体接合转移技术，通过电击等方法诱导链霉菌原生质体的形成，然后进行DNA的接合转移。
三、实验结果（一）链霉菌的分离与纯化经过多次尝试和优化，成功从稻田土壤中分离出链霉菌ⅠT2和ⅡW1两个菌株，并在选择培养基上纯化。
（二）链霉菌的鉴定通过对ⅠT2和ⅡW1菌株的形态观察、生理生化试验及分子生物学方法鉴定，确认其均为链霉菌属。
其中，ⅠT2和ⅡW1菌株具有抗稻瘟病菌活性。
（三）接合转移方法的建立我们成功建立了链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的接合转移方法。
通过原生质体接合转移技术，实现了DNA的高效接合转移。
其中，电击等物理方法被证明能够有效地诱导原生质体的形成。
通过多次实验，我们优化了接合转移的条件，提高了接合转移的效率。
四、讨论本研究成功分离并鉴定了具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株，并建立了其接合转移方法。
这为进一步研究链霉菌的生物学特性及其在稻瘟病防治中的应用提供了重要的基础。
在链霉菌的分离与纯化过程中，我们采用了多种方法进行优化，以提高分离纯化的效率。
在鉴定过程中，我们不仅进行了形态观察和生理生化试验，还采用了分子生物学方法进行鉴定，以确保鉴定的准确性。
此外，我们还研究了不同因素对接合转移效率的影响，为提高接合转移效率提供了重要的参考依据。
CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的应用和优化
CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的应用和优化目录一、内容概述 (2)1.1 CRISPR技术简介 (2)1.2 链霉菌细胞工厂的重要性 (3)1.3 CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的潜力 (4)二、CRISPR技术的基本原理与操作 (5)2.1 CRISPR-Cas9系统概述 (6)2.2 基因编辑的基本步骤 (8)2.3 CRISPR技术在链霉菌中的应用策略 (9)三、CRISPR技术在链霉菌基因组编辑中的应用 (10)3.1 基因敲除与插入 (11)3.2 基因表达调控 (12)3.3 蛋白质工程与代谢途径优化 (14)四、CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的优化策略 (15)4.1 代谢途径的强化 (16)4.2 抗性筛选与性状鉴定 (17)4.3 细胞工厂的稳定性和可重复性 (18)五、CRISPR技术在链霉菌中的实际应用案例 (20)5.1 抗生素生产优化 (21)5.2 生物燃料生产 (22)5.3 代谢产物的合成 (24)六、挑战与展望 (25)6.1 技术挑战与解决方案 (26)6.2 行业发展趋势 (27)6.3 未来研究方向与应用前景 (28)七、结论 (29)7.1 CRISPR技术在链霉菌细胞工厂中的重要成果 (30)7.2 对工业生物技术的贡献与影响 (31)一、内容概述CRISPR技术，作为一种革命性的基因编辑工具，近年来在生物医学领域引起了广泛关注。
其高效、精确的特性使得科学家能够以前所未有的精度对生物体的基因进行操作，为生物工程和合成生物学的发展提供了强大的支持。
特别是将CRISPR技术应用于链霉菌细胞工厂，不仅为抗生素生产、生物燃料合成等工业应用开辟了新途径，还极大地推动了微生物细胞工厂的优化和升级。
链霉菌作为一类重要的革兰氏阳性菌，具有独特的代谢途径和生物学特性，使其成为生物工程领域理想的宿主。
传统的链霉菌基因编辑方法存在效率低下、操作复杂等问题，限制了其在工业生产中的广泛应用。
大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌穿梭表达BAC载体的构建
大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌穿梭表达BAC载体的构建黄慧颖;宋杰;尚广东【摘要】异源表达生理活性物质的生物合成基因簇是药物研发领域的一个重要的方向,它可通过异源表达来研究基因功能,获得目标化合物或对现有的化合物进行结构改造.生物合成基因簇一般较大,常规的DNA载体由于容量不足、拷贝数较低或不能在不同的异源宿主间穿梭表达而难以对其进行操作.本研究运用重组工程策略和常规的克隆手段,将多个异源表达所必须的功能基因克隆至常用的构建BAC文库的载体pECBAC1,获得了一个可在大肠杆菌-链霉菌一假单胞菌3个常见的异源表达宿主间进行穿梭表达的BAC载体.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(033)002【总页数】5页(P104-108)【关键词】BAC载体;重组工程;穿梭表达【作者】黄慧颖;宋杰;尚广东【作者单位】南京市微生物工程技术研究中心,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京,210046;南京市微生物工程技术研究中心,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京,210046;南京市微生物工程技术研究中心,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,南京师范大学生命科学学院,江苏南京,210046【正文语种】中文【中图分类】Q819微生物是临床使用药物的主要来源.随着越来越多的微生物基因组被解析,微生物基因组资源的充分利用成为微生物药物学研究领域的一个热点.作为一种重要的基因工程手段,微生物药物生物合成基因簇的异源表达在:①常规方法难以或不能培养的生理活性物质产生菌的遗传操作;②产量极低而通常发酵难以进行的化合物的研究;③因结构复杂而使得化学合成难以进行或因收率极低而不能运用于工业化生产的化合物的研究等方面有着其它方法无可比拟的优越性[1-3]. 大肠杆菌(Escherichia co li),链霉菌(Streptom yces.sp)和假单胞菌(Pseudom onas.sp)是最为常见的3种生物合成基因簇异源表达的宿主菌,三者各有其优点[4-6].微生物药物的生物合成基因簇常常较大(数十至上百kb),常规的克隆载体以及粘粒载体(cosm id),fosm id等由于容量有限(最大可达45 kb)而不能在一个载体中涵盖完整的生物合成基因簇,而基因簇分布在两个甚至多个载体上则牵涉载体的抗性筛选标记、载体的兼容性以及DNA之间和蛋白质之间相互作用效率可能受影响等等问题.BAC(BacterialA rtificialCh romosom e)载体,即细菌人工染色体载体,由于具有可克隆大片段(多至300 kb)、所克隆的外源片段可在宿主内稳定存在(不发生缺失,扩增,重组)等特点而成为克隆和异源表达的首选载体之一[7,8].通常使用的BAC载体为单拷贝(1～2个分子/细胞),这样在进行DNA操作以及获取足够量的DNA方面有许多困难.而且迄今的BAC载体多为在大肠杆菌中进行操作,缺乏可在大肠杆菌、链霉菌和假单胞菌3个宿主之间穿梭表达BAC载体.本研究综合运用常规的基因克隆方法和重组工程(recom bineering)方法[9,10],从构建基因文库常用的BAC载体pECBAC1[11]出发,将异源表达的必需原件加以有效地综合和优化排列,构建了新型的大肠杆菌链霉菌假单胞菌的穿梭表达的BAC载体.1.1.1 菌株和质粒含重组酶质粒的菌株HS996/pSC101-BAD-gbaA由德国D resen University张友明博士惠赠;pECBAC1由美国加州大学戴维斯分校R ichard M ichelmore教授惠赠;菌株E.coli DH10B,P.pud ita KT2440;质粒pUC18,p IJ2925,pB luescrip t KS(-)和pSET152均为实验室保存.1.1.2 试剂和仪器p fu聚合酶购自上海生工公司;各种限制性内切酶,T4 DNA连接酶和DNA B lunting试剂盒购自TaKa-Ra B iotechnology公司(大连);其余试剂均为分析纯.PCR引物由上海生工公司合成;PCR仪为B io-Rad公司的DNA Engine;电转化仪为B io-Rad公司的Gene Pu lser II.1.1.2 DNA序列测定由上海英骏生物技术有限公司完成.1.2.1 分子生物学常规操作大肠杆菌培养,感受态细胞的转化,质粒提取,鉴定等按手册[12]进行.1.2.2 表达重组酶的菌株HS996/pSC101-BAD-gbaA+pEXPUBAC电转化感受态细胞的制备将HS996/pSC101-BAD-gbaA+pEXPUBAC单菌落接种至3mL 10μg/mL四环素及12.5μg/mL氯霉素的LB液体培养基,于30℃过夜振荡培养,按1/50的体积转接至20m L同样的培养基,30℃振荡培养,至A600为0.2时,加入终浓度为0.15%的L-阿拉伯糖,37℃振荡培养至A600为0.4时,12 000 r/m in,4℃离心3m in,弃上清,以10%的甘油洗涤沉淀2次,最终悬浮于200μL 10%的甘油中.50μL分装,用于一次转化.1.2.3 PCR扩增反应体系:2.5mmo l/L dNTP,1μM引物,2.5mmo l/L M gCl2,100 ng染色体DNA(或20 ng质粒),5U p fu,5%DM SO,加ddH2O至100μL.97℃处理5m in 后,PCR循环条件:97℃45 s,60℃1m in,72℃3m in,共30个循环,最后在72℃延伸10m in.本研究所使用的PCR引物及测序引物见表1 ,引物中同源臂部分以小写表示,酶切位点以下划线表示.将pECBAC1和pUC18均以Bam H I酶切,沉淀,回收,连接,转化E.co li DH 10B 感受态细胞,转化液涂布至含12.5μg/mL氯霉素,50μg/mL氨苄青霉素,20μg/mL IPTG和40 gμg/mL X-Gal的LB固体平板上,37℃培养过夜.挑取白色菌落,提取质粒,酶切验证,pUC18可以两个方向引入pECBAC1,酶切验证重组质粒,选取一个方向的克隆,命名为pEPUBAC.pEPUBAC兼具pECBAC1和pUC18的功能,为高拷贝的BAC载体.首先将pEPUBAC上含Xba I位点的2.1 kb Bg l II片段克隆至p IJ2925(pUC18的衍生载体,其多克隆位点两侧均为Bg l II位点),得到pBG2.以Xba I酶切pBG2,通过T4 DNA聚合酶和dNTP的作用,使得Xba I位点的序列TCTAGA变为TCTAGCTAGA,这样即去除了Xba I位点.测序证明序列正确后,将所得克隆命名为pBG-2.将pBG-2上Bg l II2.1 kb片段克隆至pEPUBAC Bg l II酶切的8.0 kb大片段,酶切验证克隆方向正确后,得到pEXPUBAC.pEXPUBAC只有在多克隆位点上存在单一的Xba I位点.以pSET152为模板,引物A 1和A 2扩增0.9 kb的阿普霉素抗性基因(Am)片段,以Bam H I和Pst I酶切后,克隆至pB luescrip t KS(-)相同位点,所得克隆测序正确后,命名pAM.以P.pud ita KT2440的基因组DNA为模板,引物C1和C2扩增1.0 kb的crp区域,Pst I和Eco R I酶切后,克隆至pB luescrip tKS(-)相同位点,所得克隆测序正确后,命名为pCRP.将pAM的Bam H I和Pst I0.9 kb,pCRP的Pst I和Eco R I1.0 kb与Bam H I和Eco R I处理的pB luescrip t KS(-)三片段连接,得到包含Am-crp-PP0423′基因盒的克隆pAC.运用重组工程原理,将2个DNA片段同时克隆至靶载体并去除靶载体相应部位的“三片段克隆”的策略是:上下游2个片段分别在其5′和3′端引入与靶载体的同源臂(同源臂即相同序列的一段核苷酸序列),上游片段的3′端和下游片段的5′端之间也有同源臂,同源臂常常是通过PCR的引物而引入.在大肠杆菌体内,L-阿拉伯糖诱导重组酶的表达,重组酶催化3个同源臂之间的DNA重组.经过筛选,即可得到目的克隆.本研究所设计的引物SP1的前50个碱基(小写)为与pEXPUBAC氯霉素抗性基因3′端3397-3346序列相同的同源臂,后面为扩增pSET152 oriT部位的序列;SP2的51个碱基(小写)为pSET152整合酶基因(int)3′端的序列;SP3的前51个碱基(小写)为SP2的反向互补序列,后面为扩增Am-crp-PP0423′基因盒5′的序列;SP4的前50个碱基(小写)为与pEXPUBAC redF和氯霉素抗性基因5′端之间4107～4156序列相同的同源臂,后面为扩增Am-crp-PP0423′基因盒3′的序列.首先将pEXPUBAC转化至HS996/pSC101-BAD-gbaA,在30℃下,以10μg/mL 四环素和12.5μg/mL氯霉素进行筛选.所获菌株为HS996/pSC101-BAD-gbaA+pEXPUBAC.以pSET152为模板,引物SP1和SP2扩增2.4 kb的oriT-attp-int基因盒,以pAC 为模板,引物SP3和SP4扩增2.6 kb的Am-crp-PP0423′基因盒.PCR反应体系乙醇沉淀,溶解于水后,以20U的Dpn I酶切4 h,胶回收,DNA溶于10mmol/LpH8.0 Tris.C l.将0.3μg的oriT-attp-int基因盒DNA片段和0.3μg的Am-crp-PP0423′基因盒DNA片段共转化至L-阿拉伯糖诱导重组酶表达的HS996/pSC101-BAD-gbaA+pEXPUBAC.在37℃下,以50μg/mL阿普霉素和12.5μg/mL氯霉素加以筛选,所得的质粒再次转化E.co li DH 10B加以纯化,最终得到氯霉素抗性基因部分为oriT-attp-int基因盒和Am-crp-PP0423′基因盒所取代的目标载体pESPBAC.pESPBAC的质粒图谱见图1,酶切验证的结果见图2.设计表1 中的测序引物S1-S5,对pESPBAC中通过重组工程法所引入的4.3 kb进行测序,结果证明与预期完全一致.pESPBAC的GenBank收录号为EU 718182. 微生物药物生物合成基因簇的异源表达是药物研究领域的一个有前途的方向,其目的可包含:提高化合物的产量、获得新的药效学性质改善的衍生物以及改进化合物的提取分离纯化工艺.BAC载体已逐渐成为异源表达生物合成基因簇的常规载体,因此发展有效的BAC载体可以大大提高异源表达的效率,增加高通量筛选的成功率.重组工程是上世纪90年代末发展并逐渐成熟的一种在大肠杆菌体内利用重组酶催化而进行DNA之间同源重组的基因克隆手段.其优点在于不受任何酶切位点的限制,不引入碱基突变,快速高效.本研究充分运用重组工程和经典的基因克隆策略,构建了目标BAC载体pESPBAC.pESPBAC有如下5个特点:①大肠杆菌链霉菌假单胞菌3个宿主之间穿梭表达BAC载体.载体上的oriT片段同时供转移至假单胞菌和链霉菌.attp位点用来整合至链霉菌基因组的attB位点,而载体上假单胞菌基因组中的非必须基因crp 部分可以通过同源重组而整合至假单胞菌的基因组.这样,克隆在pESPBAC载体上的DNA片段在大肠杆菌中以游离质粒形式存在而进行表达,在链霉菌和假单胞菌中则为整合至基因组上进行表达.②保留了原BAC载体克隆大片段(可多至300 kb)的特点.保留了LacZ,可以使用蓝白斑筛选重组克隆.③pUC18作为填充片段克隆至Bam H I位点,使得BAC载体由单拷贝(1～2个分子/细胞)变为高拷贝(500～700个分子/细胞),这样基因操作如常规克隆载体一样简便易行.填充片段可以通过Bam H I切除,所得片段即为克隆大片段BAC载体.④去除了原载体pECBAC1一个多余的Xba I位点,这样可用位于载体的多克隆位点上克隆片段两侧的、链霉菌基因组上酶切位点较少的限制性内切酶Eco R I和Xba I将克隆片段切出,通过脉冲场凝胶电泳来鉴定克隆片段大小.⑤阿普霉素作为大肠杆菌链霉菌假单胞菌3个宿主的共同筛选标记.pESPBAC具有成为通用的高效表达次级代谢来源的生物合成基因簇的载体和运用于高通量表达化合物的潜力.【相关文献】[1] Tang L,Shah S,Chung L,et al.Ju lien B.C loning and heterologous exp ression of the epo thilone gene cluster[J].Science,2000,287(5453):640-642.[2] Long P F,Dun lapW C,BattershillCN,etal.Sho tgun cloning and hetero logous exp ression of the patellam ide gene cluster as a strategy to achieving sustainedm etabo lite p roduction[J].Chem biochem,2005,6(10):1 760-1 765.[3] W o lpertM,Heide L,Kamm erer B,et al.A ssem b ly and hetero logous exp ression of the coum erm ycin A 1 gene cluster and p roduction of new derivatives by genetic engineering[J].Chem biochem,2008,9(4):603-612.[4] PfeiferB A,Adm iraal SJ,Gram ajo H,etal.B iosynthesisof comp lex po lyketides in am etabo lically engineered strain of E.coli[J].Science,2001,291(5509):1 790-1 792.[5] A lduina R,GiardinaA,Gallo G,etal.Exp ression in Strep tom yces lividansofNonom uraea genes cloned in an artificial chromosom e[J].App lM icrobio lB iotechno l,2005,68(4):656-662.[6] W enzel SC,Gross F,Zhang Y,et al.Hetero logous exp ression of am yxobacterial naturalp roducts assem b ly line in p seudomonads via red/ET recom bineering[J].Chem B io l,2005,12(3):349-356.[7] SosioM,Giusino F,Cappellano C,etal.A rtificial chromosom es fo rantibiotic-p roducing actinom ycetes[J].NatB iotechnol,2000,18(3):343-345.[8] Penn J,L iX,W hiting A,et al.Hetero logous p roduction of dap tom ycin in Strep tom yces lividans[J].J Ind M icrobio lB iotechno l,2006,33(2):121-128.[9] Zhang Y,Buchho lz F,M uyrers JP,etal.A new logic forDNA engineering using recom bination in Escherichia co li[J].Nat Genet,1998,20(2):123-128.[10] Datsenko KA,W annerB L.One-step inactivation of chromosom algenes in 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链霉菌SH-62中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达
第３４卷第６期２０１５年㊀１１月华㊀中㊀农㊀业㊀大㊀学㊀学㊀报J o u r n a l o fH u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t yV o l ．３４㊀N o ．６N o v ．２０１５,５５~６０收稿日期:２０１４Ｇ０６Ｇ２０基金项目:国家自然科学基金项目(３１２７０１３６);教育部留学回国人员科研启动基金项目([２００９]１５９０);教育部新世纪人才支持计划项目(N C E T Ｇ０８Ｇ０７７９)张㊀怡,硕士研究生．研究方向:微生物天然产物的生物合成．E Ｇm a i l :a yi i m u s i c ＠１６３．．c o m 通信作者:何㊀璟,博士,教授．研究方向:微生物天然产物的生物合成．E Ｇm a i l :h e j i n g j j＠m a i l ．h z a u ．e d u ．c n 链霉菌SH Ｇ62中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达张㊀怡㊀鲁㊀洲㊀黄㊀胜㊀何㊀璟华中农业大学农业微生物学国家重点实验室,武汉４３００７０摘要㊀通过生物信息学分析,在链霉菌S H Ｇ６２的基因组中发现一个Ⅱ型聚酮合酶基因簇(e n t s ),与已报道的来源于S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s 的肠菌素生物合成基因簇具有高度的相似性.通过构建和筛选链霉菌S H Ｇ６２的基因组细菌人工染色体(B A C )文库,克隆得到完整的e n t s 基因簇.将e n t s 基因簇导入白色链霉菌中进行异源表达,H P L C 和L C ＧM S 分析结果表明该基因簇负责肠菌素的生物合成,从而证实了e n t s 基因簇的生物学功能.关键词㊀链霉菌S H Ｇ６２;肠菌素;细菌人工染色体;白色链霉菌;异源表达中图分类号㊀Q９３９．９㊀㊀文献标识码㊀A㊀㊀文章编号㊀１０００Ｇ２４２１(２０１５)０６Ｇ００５５Ｇ０６㊀㊀广泛存在于自然界中的链霉菌能产生丰富的次级代谢产物.到目前为止,人们已经从链霉菌中分离鉴定出几千种抗生素,其中很多都已应用于临床诊治,如抗肿瘤药物博来霉素[１]㊁抗结核药物利福平[２]等.令人遗憾的是抗生素的滥用导致了耐药性病原菌的大规模出现[３Ｇ５].针对这种现象,科学家们一方面对耐药性病原菌的抗性机制进行了大量的研究[６Ｇ９],另一方面加大了新型药物的发掘.近年来,随着测序技术的飞速发展和测序成本的下降,研究者对越来越多的微生物进行了全基因组测序.科学家对模式天蓝色链霉菌的基因组序列分析发现其基因组上存在多达数十个次级代谢产物的生物合成基因簇,与其实际所产生的抗生素的数量存在较大的差异,引起了广大研究者的重视[１０].在已知基因组序列信息的基础上进行天然活性产物的发掘目前已经成为天然产物生物合成研究的一个热门方向.链霉菌S H Ｇ６２是１９８７年从湖北省房县土壤中分离得到的,对枯草芽胞杆菌㊁苏云金芽胞杆菌㊁金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌具有很好的抗菌效果.对啤酒酵母(S a c c h a r o m yc e s c e r e v i s i a e )㊁掷孢酵母(S p o r b o l o m yc e s r o s e u s )㊁卡尔斯伯酵母(S a c Ｇc h a r o m y c e sc a r l s b e r g e n s i s )㊁匐枝根霉(R h i z o p u s s t o l o n i f e r )㊁黄曲霉(A s p e r gi l l u s f l a v u s )以及多种植物病原真菌,如水稻恶苗病菌(G i b b e r e l l az e a e )㊁玉米小斑病菌(C o c h l i c o b o l u s h e t e r o s t r o ph u s )㊁柑橘青霉(P e n i c i l l i u mi t a l i c u m )㊁柑橘绿霉(P e n i c i l l i Ｇu md i gi t a t u m )㊁柑橘黑腐(A l t e r n a r i ac i t r i )和酸腐病菌(G e o t r i c h u m c a n d i d u m )都有良好的拮抗作用[１１].笔者所在课题组在链霉菌S H Ｇ６２基因组的生物信息学分析中,发现一个Ⅱ型聚酮合酶(P K S)基因簇与肠菌素生物合成基因簇具有高度的相似性.本研究通过构建链霉菌S H Ｇ６２的基因组细菌人工染色体(B A C )文库,利用克隆及异源表达的方法对这个Ⅱ型聚酮合酶基因簇的生物学功能展开研究.1㊀材料与方法1.1㊀材㊀料１)菌种和质粒.大肠杆菌(E s c h e r i c h i ac o l i )D H ５a 为基因克隆宿主,大肠杆菌S １７Ｇ１为大肠杆菌Ｇ链霉菌属间接合转移供体菌,大肠杆菌D H １０B(pU Z ８００２)为文库宿主.白色链霉菌和链霉菌S H Ｇ６２由笔者所在实验室收藏.质粒p O J ２６０和文库构建载体p M S B B A C 为笔者所在实验室收藏.２)培养基.大肠杆菌培养基为L B 固体㊁液体培养基,大肠杆菌链霉菌属间接合转移时孢子的处㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀理用T S B,接合转移用２C M,链霉菌发酵培养基为Y D.３)主要试剂.抗生素购自S i g m a公司,限制性内切酶购自F e r m e n t a s公司,T４D N A连接酶和K O DD N A高保真聚合酶购自T O Y O B O公司, D N A m a r k e r购自东盛生物科技有限公司,普通D N A凝胶回收试剂盒购自A x y g e n公司,T S B购自P r o m e g a公司,其余药品购自国药集团.研究涉及引物全部由南京金斯瑞生物科技有限公司合成,测序反应由上海美吉生物医药科技有限公司负责. 1.2㊀方㊀法１)B A C文库的构建.将链霉菌S HＧ６２孢子接种于５０m L T S B中培养３６h,收集菌丝体,用蔗糖洗涤２次,T E２５S洗涤２次,加入等体积１．５％的低熔点琼脂糖制备包埋块.先使用１m g/m L溶菌酶在３７ħ水浴锅中进行２４h原位裂解,然后用含有１m g/m L蛋白酶K的N D S溶液在５０ħ水浴锅中进行２４h蛋白消化,２次.接着将包埋块挑出,放入含有０．０００１m o l/LP M S F的T Eb u f f e r中,４ħ轻轻振荡１h㊁２次,最后用T Eb u f f e r洗涤４次.选取最佳的B a m HⅠ部分酶切条件进行大量酶切,通过脉冲电泳对酶切片段进行分离,将包含有９０~２５０k b片段的凝胶切割下来,再次包埋到１．０％的琼脂糖凝胶中,通过脉冲电泳对酶切片段进行第２次筛选.然后将包含有所需片段的胶条切割下来,装入透析袋中通过电洗脱进行回收.回收好的大片段与处理好的载体进行连接,脱盐胶除盐后,电转化高效的大肠杆菌感受态细胞.从转化子中随机挑取１９个白斑,提取B A C的D N A,经H i n dⅢ酶切处理以检测插入片段的大小,经B a m HⅠ酶切处理以检验载体和插入片段.２)B A C文库的筛选.利用特异性引物S H０３６ⅡP K SＧ１F:５ᶄＧC A T C T G G C T G T T G C A T C G G T A A T CAＧ３ᶄ和S H０３６I I P K SＧ１R:５ᶄＧG C GC A G C G G G C A A T A A A A T C A TＧ３ᶄ㊁S H０３６I I P K SＧ２F:５ᶄＧG C G A C CC T G G C CC G G A A AC T ACＧ３ᶄ和S H０３６I I P K SＧ２R:５ᶄＧT C AC G CG C TA C CA G G A C A T C A A G AＧ３ᶄ对链霉菌S HＧ６２的基因组B A C 文库进行P C R筛选.首先筛选混合p l a t e库,然后根据结果筛选r o w库,随后得到阳性克隆子.P C R 扩增条件为９４ħ３m i n,９４ħ３０s,５４~６２ħ３０s,９４ħ３m i n,７２ħ１m i n,７２ħ１０m i n,３３个循环.３)异源表达菌株的构建.将阳性B A C导入大肠杆菌S１７Ｇ１,得到转化子.将转化子的过夜培养物转接在新鲜的L B培养基中,３７ħ培养转化子到D６００＝０．４~０．６时收集菌体.用等体积新鲜的L B 洗涤菌体２次,０．１倍体积的L B悬浮备用.同时将链霉菌孢子用T S B洗涤２次后,重新悬浮于T S B 中,５０ħ水浴热激１０m i n,３７ħ摇床培养２h,按１ʒ１的比例将处理好的大肠杆菌和孢子混合,均匀涂布在２C M平板上,３０ħ培养１６~２０h然后用１m L含有１m g安普拉霉素和０．８m g萘啶酮酸的无菌水覆盖,３０ħ培养２~３d后可观察到接合转移子出现.４)H P L C检测.检测波长为２５４n m,流动相为水和乙腈,洗脱条件如下:０~３０m i n乙腈由５％~９０％,３０~４０m i n乙腈９０％~５％,４０~４５m i n乙腈保持１０％,流速为０．５m L/m i n.H P L C色谱柱为D i k e m a T e c h n o l o g i e s公司的D i a m o n s i l C１８(２);L C１２６０高效液相色谱仪购自安捷伦公司.５)L CＧM S检测.在阳离子模式下,L C检测波长为２５４n m,流动相为水(含有０．１％甲酸,V/V)和乙腈,洗脱条件如下:０~８m i n乙腈５％~９０％,８~１０m i n乙腈保持９０％,１０~１５m i n乙腈９０％~５％,流速为０．３m L/m i n.仪器为A P I２０００L C/ M S/M S.2㊀结果与分析2.1㊀从链霉菌SHＧ62基因组中发现ents基因簇通过KＧm e r分析初步判断链霉菌S HＧ６２基因组大小约为９．６２M b.通过４５４和I l l u m i n a H i s e q ２０００平台２种方法进行测序分析,得到１５６个c o nＧt i g,组装长度约为１２．２４M b的序列信息.将１５６个c o n t i g的序列进行生物信息学分析,通过F G E N E S B㊁B P R OM㊁G e n e M a r k等分析O R F,利用p r o t e i nＧp r o t e i nB l a s t及P f a m分析注释基因可能的功能.在链霉菌S HＧ６２的基因组中发现有超过２０个次级代谢产物的生物合成基因簇,其中包含２个Ⅱ型P K S基因簇.其中一个与天蓝色链霉菌中负责孢子色素合成的基因簇w h i E具有很高的相似性,推测其参与链霉菌S HＧ６２孢子色素的合成.另一个Ⅱ型P K S基因簇除了包含有典型的M i n i m a l P K S(酮基合成酶α亚基(e n t A)㊁酮基合成酶β亚基(e n t B)和酰基载体蛋白(e n t C))负责聚酮链的起始㊁延伸和终止以外,还含有负责起始单元苯甲酸辅酶A合成(e n t P H I M J N L)㊁聚酮链后修饰(e n t D K Q R)６５㊀第６期张㊀怡等:链霉菌S H Ｇ６２中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达㊀和调控(e n t U E F S )的基因等(表１).将该基因簇命名为e n t s (G e n B a n ka c c e s s i o nn u m b e rK J ８６７５１６).它与来源于S t r e p t o m yc e s m a r i t i m u s 的肠菌素(e n t e r o c i n )生物合成基因簇同源性高达９０％,基因组成和排列方式也基本相同,唯一的不同是在基因簇５ᶄ端多了一个调控基因e n t s U (图１).表１㊀链霉菌S H Ｇ６２中肠菌素生物合成基因簇O R F 分析T a b l e １㊀O R Fa n a l ys i s o f t h e e n t s c l u s t e r i n S t r e p t o m y c e s S H Ｇ６２编码序列O R F氨基酸a a 同源性I d e n t i t y/％同源蛋白H o m o l o go u s p r o t e i n E n t s U １３０３３L y s Rf a m i l y r e g u l a t o r yp r o t e i n [M yc o b a c t e r i u m g i l v u m S p y r １]E n t s V ４９６３７S u l f a t e p e r m e a s e [S t r e p t o m y c e s r a p a m y c i n i c u s N R R L５４９１]E n t s E １８２９２P u t a t i v e r e g u l a t o r yp r o t e i nE n c E [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s F２８３９２P u t a t i v e t r a n s c r i p t i o n a l r e g u l a t o rE n c F [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s G１５１９５E n c G [S t r e p t o m yc e sm a r i t i m u s ]E n t s H ５６８９１P u t a t i v e a c y l ＧC o Al i g a s eE n c H [S t r e p t o m yc e sm a r i t i m u s ]E n t s I２５８９０P u t a t i v e e n o y l ＧC o Ah y d r a t a s eE n c I [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s J ４００８４P u t a t i v e b e t a Ｇo x o a c y l ＧC o At h i o l a s eE n c J [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s K２４０９２P u t a t i v eO Ｇm e t h y l t r a n s f e r a s eE n c K [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s D２６６９４P u t a t i v ek e t o r e d u c t a s eE n c D [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s A ３９８９５P u t a t i v ek e t o s y n t h a s e a l p h aE n c A [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s B４０７９７P u t a t i v ek e t o s y n t h a s e b e t aE n c B [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s C ８２９５P u t a t i v e a c y l c a r r i e r p r o t e i nE n c C [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s L ３４０９３P u t a t i v e a c y l t r a n s f e r a s eE n c L [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s M ４６４９０P u t a t i v eF A D Ｇd e p e n d e n t o x y g e n a s eE n c M [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s N ５２２９５P u t a t i v e a r y l ＧC o Al i g a s eE n c N [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s O １３０８８E n c O [S t r e p t o m yc e sm a r i t i m u s ]E n t s P ５３９９１P u t a t i v e p h e n y l a l a n i n e a mm o n i a l y a s eE n c P [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s Q ８１９０P u t a t i v e f e r r ed o x i nE n c Q [S t re p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s R ４０１９３P u t a t i v e p ４５０m o n o o x y g e n a s eE n c R [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s S ２１５９３P u t a t i v e r e g u l a t o r yp r o t e i nE n c S [S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s ]E n t s T１１４９２P u t a t i v e e f f l u x p r o t e i nE n c T [S t r e p t o m yc e sm a r i t i m u s]图１㊀链霉菌S H Ｇ６２中e n t s 基因簇的组成F i g ．１㊀O r g a n i z a t i o no f t h e e n t s c l u s t e r i n S t r e p t o m yc e s S H Ｇ６２2.2㊀链霉菌SH Ｇ62基因组BAC 文库的构建由于在野生型链霉菌S H Ｇ６２中无法进行遗传操作,本研究构建了该链霉菌基因组的B A C 表达文库,利用B A C 载体能够承载大片段D N A 的能力,希望能够克隆到完整的次级代谢产物生物合成基因簇.制备链霉菌S H Ｇ６２菌丝体的包埋块,经B a m HⅠ部分酶切处理后,回收并纯化大小约为９０~２５０k b 的片段,与笔者所在课题组构建的可装载链霉菌大片段D N A 的B A C 载体p M S B B A C s 进行连接,转化大肠杆菌感受态细胞D H １０B (pU Z ８００２),共获得２４００个B A C 克隆子.从中随机挑取２４个转化子,抽提质粒D N A ,通过H i n d Ⅲ酶切及脉冲电泳检测(图２),发现B A C 克隆子的插入片段大小为７５~１１０k b ,平均插入片段大小为８５k b ,可覆盖链霉菌基因组２５．５倍.2.3㊀链霉菌SH Ｇ62基因组BAC 文库的筛选为了克隆到完整的e n t s 基因簇,在基因簇两端分别设计了一对特异性引物,通过P C R 对链霉菌S H Ｇ６２的基因组B A C 文库进行了筛选.利用引物S H ０３６ⅡP K S Ｇ１F 和S H ０３６I I P K S Ｇ１R 筛选到８个阳性克隆,然后利用引物S H ０３６ⅡP K S Ｇ２F 和S H ０３６I I P K S Ｇ２R 对这８个克隆子进行复筛,发现其中６个出现阳性信号(图３),分别为１A １１㊁２E ３㊁５D ２㊁１１B １㊁１４B ８和１５A １０.７５㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀㊀随机挑取２４个B A C 克隆的D N A 通过H i n d Ⅲ酶切检测插入片段大小.泳道M 为N E BP F G E m a r k e r Ⅱ,泳道１~２４为B A C 克隆的H i n d Ⅲ酶切产物.D N Ao f ２４r a n d o m l y s e l e c t e dB A C c l o n e sw a s d i ge s t e dw i t h H i n d Ⅲ．L a n eM :N E BP F G E M a r k e rⅡ;L a n e １Ｇ２４:B A Cc l o n e s /H i n d Ⅲ．图２㊀脉冲电泳检测链霉菌S H Ｇ６２基因组B A C 文库插入片段的大小F i g ．２㊀P FG E r e s u l t s f o r a n a l y z i n g t h e i n s e r t s i z eo f c l o n e s i n t h e S t r e p t o m y c e s s p ．SH Ｇ６２g e n o m i cB A C l i b r a ry㊀泳道１~６分别为阳性B A C１A １１㊁２E ３㊁５D ２㊁１１B １㊁１４B ８和１５A １０;泳道M 为１００b p D N Al a d d e r .L a n e １Ｇ６r e pr e s e n t s t h e p o s i t i v e B A C１A １１,２E ３,５D ２,１１B １,１４B ８a n d １５A １０,r e s p e c t i v e l y ;L a n eM :１００b p DN Al a d d e r ．图３㊀使用引物对S H ０３６I I P K S Ｇ１(A )和S H ０３６I I P K S Ｇ２(B )对阳性克隆子进行P C R 扩增的结果F i g．３㊀P C R r e s u l t s o f t h e p o s i t i v eB A Cc l o n e sw i t h p r i m e r sS H ０３６I I P K S Ｇ１(A )a n dS H ０３６I I P K S Ｇ２(B )2.4㊀ents 基因簇的异源表达将６个阳性B A C 通过接合转移的方法从大肠杆菌导入白色链霉菌,筛选得到正确的异源表达菌株后,分别用不同的链霉菌发酵培养基进行发酵培养.利用生物活性测定㊁薄层层析㊁高效液相色谱(H P L C )等方法对发酵产物进行检测,发现其中１４B ８和２２D ９的异源表达菌株(S ．a l b u s ::１４B ８和S ．a l b u s ::２２D ９)可以产生抑制枯草芽胞杆菌１６８的活性物质(图４),暗示着这２个阳性B A C 可能在异源宿主中成功地进行了表达,催化合成出相应的代谢产物.使用Y D 培养基发酵５d 后,发酵产物经萃取浓缩,在２５４n m 波长下进行H P L C 分析时,异源表达菌株S ．a l b u s ::１４B ８和S ．a l b u s ::２２D ９与对照菌株S ．a l b u s ::p M S B B A C 相比在６．２m i n 保留时间处多了一个紫外吸收峰,薄层层析也显示出相似的结果.利用液相Ｇ质谱联用技术(L C ＧM S )进一步检测该紫外吸收峰,发现在阳离子模式下[M＋H ]为４４５．１１５(图４).在野生型链霉菌S H Ｇ６２和２个异源表达菌株中均检测到[M＋H ]＝４４５．１１５的离子流信号,而对照菌株中没有.由此,初步判定所克隆到的e n t s 基因簇为肠菌素生物合成基因簇,负责合成肠菌素.3㊀讨㊀论链霉菌S H Ｇ６２基因组中含有非常丰富的天然产物合成酶的基因资源,具有开发新型活性天然产物的潜力.本研究在全基因组序列分析的基础上,通过构建及筛选基因组B A C 文库,结合异源表达的方法,证实从链霉菌S H Ｇ６２中找到的一个Ⅱ型聚酮合酶基因簇(e n t s )负责肠菌素的生物合成.肠菌素是由日本学者从S t r e p t o m yc e sc a nd i d u s v a r ．e n Ｇt e r o s t a t i c u s W S Ｇ８０９６和S t r e p t o m yc e sv i r id o c h r o Ｇm o ge n e s M Ｇ１２７这２株土壤链霉菌中分离得到的一种具有广谱抑菌活性的抗生素.２０００年,J o e r nP i e l８５㊀第６期张㊀怡等:链霉菌S HＧ６２中肠菌素生物合成基因簇的克隆及异源表达㊀图４㊀异源表达菌株的生物活性测定和L CＧM S分析F i g．４㊀B i o a s s a y a n dL CＧM Sa n a l y s e s o f h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n p r o d u c t s o f t h e e n t s b i o s y n t h e t i c g e n ec l u s t e r等[１１]从S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s中克隆得到肠菌素生物合成基因簇.与放线紫红素不同,肠菌素的生物合成基因簇属于非典型的Ⅱ型聚酮合酶基因簇.除了不包含芳香类聚酮化合物合成所需的环化酶基因以外,该基因簇还含有独特的起始单元合成酶和装载模块[１２].起始单元合成相关基因e n c P编码苯丙氨酸裂解酶,它将LＧ苯丙氨酸脱氨形成反式肉桂酸,通过E n c H I J参与的β氧化最终形成苯甲酰辅酶A,参与肠菌素的合成,是细菌中首次发现的苯丙氨酸裂解酶[１２Ｇ１３].肠菌素对大肠杆菌㊁枯草芽胞杆菌㊁金黄色葡萄球菌以及铜绿假单胞菌等均有良好的抑制作用,但对真菌和酵母不具有任何活性[１４].而链霉菌S HＧ６２的发酵产物不仅对革兰氏阳性菌具有很好的抗菌效果,还能有效抑制酵母和丝状真菌的生长.从抗菌谱可以看出,链霉菌S HＧ６２的发酵产物中除了肠菌素以外,应该还包含有其他能够拮抗真菌的活性物质.在基因组测序技术日益成熟的今天,大量链霉菌的基因组序列开始公布.科学家发现从链霉菌中分离得到的抗生素与基因组中的生物合成基因簇的数目存在着巨大的差异.如何有效利用这些基因组的信息资源来发掘新型活性天然产物,是目前许多９５㊀㊀华中农业大学学报第３４卷㊀科学家正在努力解决的问题.本研究基于全基因组和异源表达技术结合的策略,为充分利用基因组中基因簇的资源以及后续利用组合生物合成的研究来开发新型抗生素奠定基础.参考文献[１]㊀B L UM R H,C A R T E RSK,A G R EK．Ac l i n i c a l r e v i e wo f b l eＧo m y c i n a n e wa n t i n e o p l a s t i c a g e n t[J]．C a n c e r,１９７３,３１:９０３Ｇ９１４．[２]㊀A R I S T O F FPA,G A R C I AGA,K I R C HHO F FPD,e t a l．R i f aＧm y c i n sＧo b s t a c l e sa n do p p o r t u n i t i e s[J]．T u b e r c u l o s i s,２０１０,９０:９４Ｇ１１８．[３]㊀MO X N E S JF,D EB L A S I OBF,L E E G A A R D T M,e t a l．M eＧt h i c i l l i nＧr e s i s t a n t S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s(M R S A)i s i n c r e a s i n gi nn o r w a y:a t i m e s e r i e s a n a l y s i s o f r e p o r t e dM R S Aa n dm e t h iＧc i l l i nＧs e n s i t i v e S．a u r e u s c a s e s,１９９７－２０１０[J]．P l o S O n e,２０１３,８:e７０４９９．[４]㊀MA S C I N IE,B O N T E N M．V a n c o m y c i nＧr e s i s t a n t e n t e r o c o c c i:c o n s e q u e n c e s f o r t h e r a p y a nd i n fe c t i o n c o n t r o l[J]．C l i n i c a lM iＧc r o b i o l o g y a nd I n fe c t i o n,２００５,１１:４３Ｇ５６．[５]㊀T E L E N T IA,I M B O D E N P,MA R C H E S IF,e t a l．D e t e c t i o no f r i f a m p i c i nＧr e s i s t a n c em u t a t i o n s i n M y c o b a c t e r i u mt u b e r c u l o s i s [J]．T h eL a n c e t,１９９３,３４１:６４７Ｇ６５１．[６]㊀D WY E RDJ,K O HA N S K IM A,C O L L I N S J J．R o l e o f r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s i na n t i b i o t i ca c t i o na n dr e s i s t a n c e[J]．C u r r e n t O p i n i o n i n M i c r o b i o l o g y,２００９,１２:４８２Ｇ４８９．[７]㊀N G U Y E N L,T H OM P S O N CJ．F o u n d a t i o n so fa n t i b i o t i cr eＧs i s t a n c ei n b a c t e r i a l p h y s i o l o g y:t h e m y c o b a c t e r i a l p a r a d i g m[J]．T r e n d s i n M i c r o b i o l o g y,２００６,１４:３０４Ｇ３１２．[８]㊀S C HM I E D E R R,E DWA R D SR．I n s i g h t s i n t oa n t i b i o t i c r e s i s tＧa n c e t h r o u g hm e t a g e n o m i c a p p r o a c h e s[J]．F u t u r e M i c r ob i o l oＧg y,２０１２,７:７３Ｇ８９．[９]㊀C O L E MA N RS,P E R E ZRJ,B U R KC H,e t a l．S t u d i e s o n t h e m e c h a n i s mo f a c t i o no f a z i n o m y c i nB:d e f i n i t i o no f r e g i o s e l e cＧt i v i t y a n d s e q u e n c e s e l e c t i v i t y o f D N Ac r o s sＧl i n k f o r m a t i o n a n dc l a r i f i c a t i o no f t h e r o l e o f t h e n a p h t h o a t e[J]．J o u r n a l o f t h eAＧm e r i c a nC h e m i c a l S o c i e t y,２００２,１２４:１３００８Ｇ１３０１７．[１０]B E N T L E Y S,C H A T E R K,C E R D E N OＧT A R R A G A A M,e ta l．C o m p l e t e g e n o m e s e q u e n c e o f t h e m o d e l a c t i n o m y c e t eS t r e p t o m y c e s c o e l i c o l o r A３(２)[J]．N a t u r e,２００２,４１７:１４１Ｇ１４７．[１１]P I E LJ,H E R TW E C KC,S H I P L E YPR,e t a l．C l o n i n g,s e q u e nＧc i n g a n da n a l y s i so ft h ee n t e r o c i n b i o s y n t h e s i s g e n ec l u s t e rf r o mt h e m a r i n e i s o l a t e S t r e p t o m y c e s m a r i t i m u s :e v i d e n c ef o rt h e d e r a i l m e n to fa n a r o m a t i c p o l y k e t i d es y n t h a s e[J]．C h e m i s t r y&B i o l o g y,２０００,７:９４３Ｇ９５５．[１２]H E R TW E C KC,MO O R EBS．A p l a n tＧl i k e b i o s y n t h e s i s o f b e nＧz o y lＧC o Ai n t h em a r i n eb a c t e r i u m S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s [J]．T e t r a h e d r o n,２０００,５６:９１１５Ｇ９１２０．[１３]X I A N G L,MO O R E B S．I n a c t i v a t i o n,c o m p l e m e n t a t i o n,a n dh e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o no f e n c P,an o v e lb a c t e r i a l p h e n y l a l aＧn i n e a mm o n i a l y a s e g e n e[J]．J o u r n a l o fB i o l o g i c a lC h e m i s t r y,２００２,２７７:３２５０５Ｇ３２５０９．[１４]M I Y A I R IN,S A K A IH,K O N OM IT,e ta l．E n t e r o c i n,an e wa n t ib i o t i ct a x o n o m y,i s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n[J]．T h eJ o u r n a l o fA n t i b i o t i c s,１９７６,２９:２２７Ｇ２３５．C l o n i n g a n dh e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o no f t h e e n t e r o c i nb i o s y n t h e t i cg e n e c l u s t e r i n S t r e p t o m y c e s s p．S HＧ６２Z H A N G Y i㊀L UZ h o u㊀HU A N GS h e n g㊀H EJ i n gS t a t eK e y L a b o r a t o r y o f A g r i c u l t u r a lM i c r o b i o l o g y,H u a z h o n g A g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y,W u h a n４３００７０,C h i n aA b s t r a c t㊀B i o i n f o r m a t i c sa n a l y s i so f S t r e p t o m y c e s s p．S HＧ６２g e n o m es e q u e n c es h o w e dt h a t t h e r e w a s a t y p eⅡp o l y k e t i d e s y n t h a s e g e n e c l u s t e r(e n t s)h a v i n g h i g hh o m o l o g y w i t ht h e e n t e r o c i nb i o s y nＧt h e t i c g e n e c l u s t e r i n S t r e p t o m y c e sm a r i t i m u s．T h ee n t i r e e n t s c l u s t e rw a sc l o n e db y c o n s t r u c t i n g a n d s c r e e n i n g t h e g e n o m i c b a c t e r i a l a r t i f i c i a l c h r o m o s o m e(B A C)l i b r a r y o f S t r e p t o m y c e s s p．S HＧ６２．T h e e nＧt s c l u s t e rw a s i n t r o d u c e d i n t o S t r e p t o m y c e s a l b u s f o r h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n．T h e r e s u l t s o fH P L Ca n d L CＧM Sa n a l y s i s c o n f i r m e d t h a t t h e e n t s c l u s t e r i s r e s p o n s i b l e f o r t h e e n t e r o c i nb i o s y n t h e s i s i n S t r e p t oＧm y c e s s p．S HＧ６２．K e y w o r d s㊀S t r e p t o m y c e s s p．S HＧ６２;e n t e r o c i n;b a c t e r i a l a r t i f i c i a l c h r o m o s o m e(B A C);S t r e p t oＧm y c e s a l b u s;h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n(责任编辑:张志钰)０６。
链霉菌表达系统作业
DNase印记法 印记法
DNA 结合 蛋白
45bp 与原核生物典型启动子-10和 区相类似 与原核生物典型启动子 和-35区相类似
硫链丝菌素
Hg2+
MerR蛋白 蛋白
tipAL
N端 端 螺旋—转角 螺旋 螺旋 转角—螺旋 转角
SoxR蛋白 蛋白
同源性
TipAL具有DNA结合蛋白活性 具有 结合蛋白活性
不产生黑色素， 不产生黑色素，重组菌落变为白色
五、链霉菌作为表达系统的特点
• 优点： 优点：
1.链霉菌工业化发展成熟，适于大规模产业化。 链霉菌工业化发展成熟，适于大规模产业化。 链霉菌工业化发展成熟 2.链霉菌基本为非致病菌，不产生内毒素。 链霉菌基本为非致病菌， 链霉菌基本为非致病菌 不产生内毒素。 3.可以进行高密度培养，并能在相当长的一段时间保持其代 可以进行高密度培养， 可以进行高密度培养 谢活性。在稳定期，细胞仍能合成次级代谢产物。 谢活性。在稳定期，细胞仍能合成次级代谢产物。 4.可分泌胞外酶，可将分泌信号肽序列纳入载体，使外源蛋 可分泌胞外酶， 可分泌胞外酶 可将分泌信号肽序列纳入载体， 白可以分泌到胞外。 白可以分泌到胞外。在胞外分泌的异源蛋白能正确折叠的 可能性大，且易被纯化。 可能性大，且易被纯化。 5.链霉菌中有许多可利用的转录起始信号，利用来自链霉菌 链霉菌中有许多可利用的转录起始信号， 链霉菌中有许多可利用的转录起始信号 的能充分产生及分泌蛋白的转录和分泌信号肽基因， 的能充分产生及分泌蛋白的转录和分泌信号肽基因，可以 轻易地在链霉菌中进行基因产物的高表达。 轻易地在链霉菌中进行基因产物的高表达。
链霉菌表达系统与方法
主要内容： 主要内容：
一、生物学特性以及目前应用简介 二、链霉菌表达系统的组成 三、表达的一般步骤 四、应用实例 五、链霉菌表达系统特点及前景展望
链霉菌次级代谢产物生物合成基因簇异源表达研究进展
链霉菌次级代谢产物生物合成基因簇异源表达研究进展王苗;王倩【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2018(042)007【总页数】3页(P803-805)【关键词】链霉菌;次级代谢产物;异源表达;生物合成【作者】王苗;王倩【作者单位】遵义医学院/贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室,贵州遵义563003;遵义医学院/贵州省微生物资源及药物开发特色重点实验室,贵州遵义563003【正文语种】中文【中图分类】R394天然活性物质的合成、调控和抗性基因都是成簇的排列在微生物基因组内，通过基因工程等技术，将目的基因转移至不同的宿主菌内异源表达，不仅能够激活沉默基因簇，且可将异源表达体系作为一个非常有用的工具，通过生物合成或组合生物合成的方法生产出更多结构新颖且功能独特的实用天然产物或其衍生物[1-2]。
本文针对近年来在链霉菌体内次级代谢产物生物合成基因簇的异源表达研究进展进行综述，着重介绍了链霉菌次级代谢产物非核糖体肽酶(NRPSs) 、聚酮合酶(PKSs)和杂合NRPS/PKSs基因簇异源表达研究的方法及研究过程中需解决的问题，进而对近些年异源表达天然产物的新研究思路进行汇总及展望，以期为新药的研发及合成药的高效表达提供良好的来源和途径。
1 微生物异源表达体系功能介绍及应用近年来，微生物来源基因簇异源表达的研究逐步成为医药、生物和化学界长期的研究内容。
随着对微生物基因簇研究的深入，特别是一些不可培养微生物基因或沉默基因的激活表达研究，技术水平上迫切需要强大的功能齐全的异源表达体系来生产这些化合物，从而获得更多结构新颖且功能独特的实用新型活性物质 [3-4]。
将整个或部分抗生素的基因簇插入与其原始产生菌不同源的适宜宿主菌内表达，使其产生该抗生素完整结构或部分结构的过程，主要策略包括：生物信息学预测、克隆基因簇、修饰基因簇、转移基因簇、功能性表达基因、比较分析代谢产物图谱等，这种研究手段称为异源表达,生产这些活性化合物即建立基因簇异源表达体系 [5]。
链霉菌实验操作技术
链霉菌实验操作技术
一、抗生素培养基
常用抗生素及其使用浓度
培养基
二、DNA基本操作
大肠杆菌质粒提取
酶连反应
DNA片段凝胶回收
DNA纯化
DNA片段末端补平
DNA片段去磷酸化处理
碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA
碱裂解法提取链霉菌质粒DNA
碱裂解法提取链霉菌基因组DNA
醇沉法回收DNA
三、PCR及相关技术
PCR
引物设计（常规引物设计、重叠PCR引物设计、RT-PCR引物设计）
PCR定点诱变
四、基因片段转移技术
大肠杆菌CaCl2 法制备感受态细胞及DNA 转化
DNA 转化.
大肠杆菌质粒的快速检测
接合转移
Fosmid文库构建
PCR-Targeting 技术中E.coli 电转化感受态的制备及电转化五、RNA 操作技术
链霉菌总RNA 的抽提
链霉菌的RT-PCR
六、蛋白质基本操作技术
SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色
大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG 诱导的表达体系）
链霉菌总蛋白抽提
大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7 表达系统如BL21 菌株中的pET 系列表达体系）
七、其他技术
链霉菌孢子悬液的制备
链霉菌菌种保藏。
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链霉菌S.albogriseolus S-325 链霉菌 SSI信号肽序列 信号肽序列 目的基因 ：SSI基因 基因 载体：pIJ702 载体： 宿主： ． 宿主：S．lividans 66 选择性标记： 选择性标记：mel、tsr基因 基因 mel基因失活 基因失活
蛋白质
碱性蛋白酶活性
SSI分泌产物 分泌产物 其蛋白活性与天然产物 相同
链霉菌的目前应用
目前，70%以上抗生素产生菌是链 霉菌。此外，许多细胞因子和真核基因 产物已在链霉菌中获得表达，如nIFNα1、 hIL-2、hTNF、前胰岛素原、牛生长激 素和牛卡介素等。其中，前四种已获得 分泌性表达。
二、链霉菌表达系统的组成
＊常用宿主：变铅青链霉菌、天蓝色链霉 常用宿主 菌等 ＊载体：高拷贝载体（pIJ101、pIJ702) 、 载体 低拷贝载体（pIJ922、pIJ940）、穿梭载 体（pHJL197）、柯斯载体、接合转移载 体、 噬菌体载体（KC304、KC505）、表 达载体、分泌载体
不产生黑色素， 不产生黑色素，重组菌落变为白色
五、链霉菌作为表达系统的特点
• 优点： 优点：
1.链霉菌工业化发展成熟，适于大规模产业化。 链霉菌工业化发展成熟，适于大规模产业化。 链霉菌工业化发展成熟 2.链霉菌基本为非致病菌，不产生内毒素。 链霉菌基本为非致病菌， 链霉菌基本为非致病菌 不产生内毒素。 3.可以进行高密度培养，并能在相当长的一段时间保持其代 可以进行高密度培养， 可以进行高密度培养 谢活性。在稳定期，细胞仍能合成次级代谢产物。 谢活性。在稳定期，细胞仍能合成次级代谢产物。 4.可分泌胞外酶，可将分泌信号肽序列纳入载体，使外源蛋 可分泌胞外酶， 可分泌胞外酶 可将分泌信号肽序列纳入载体， 白可以分泌到胞外。 白可以分泌到胞外。在胞外分泌的异源蛋白能正确折叠的 可能性大，且易被纯化。 可能性大，且易被纯化。 5.链霉菌中有许多可利用的转录起始信号，利用来自链霉菌 链霉菌中有许多可利用的转录起始信号， 链霉菌中有许多可利用的转录起始信号 的能充分产生及分泌蛋白的转录和分泌信号肽基因， 的能充分产生及分泌蛋白的转录和分泌信号肽基因，可以 轻易地在链霉菌中进行基因产物的高表达。 轻易地在链霉菌中进行基因产物的高表达。
方法并不通 用或者仅限 于某种特定 的链霉菌 单基因操作方面更加方便
应用
在链霉菌中的 变铅青链霉菌和生二素链霉菌等对 应用实例比较 外源DNA 无限制修饰作用的菌种 外源 少
最常用方法： 介导的质粒转化原生质体法。 最常用方法： PEG- 介导的质粒转化原生质体法。在进 行转化实验之前, 首先要制备原生质体, 行转化实验之前 首先要制备原生质体 要求原生质体有较高 的形成率和再生率。 的形成率和再生率。
链霉菌 nIFNα1、hIL-2、hTNF、前胰岛素原 、 、
不同于大肠杆菌，它们只具有单层细胞外膜， 不同于大肠杆菌，它们只具有单层细胞外膜，分泌的 蛋白质常常能直接分泌到培养基中，利于分离纯化。 蛋白质常常能直接分泌到培养基中，利于分离纯化。
与大肠杆菌对比展望
前景展望
基因表达的研究方面链霉菌还远远落后 于大肠杆菌，但是链霉菌在表达和分泌 表达和分泌有活 于大肠杆菌，但是链霉菌在表达和分泌有活 性的蛋白质方面则远远优于大肠杆菌。 性的蛋白质方面则远远优于大肠杆菌。实践 证明链霉菌能产生多种多样的可溶性的具有 生物活性的蛋白质。我们有理由相信，随着 生物活性的蛋白质。我们有理由相信， 研究的深入， 研究的深入，越来越多的真核基因将比较容 易地在链霉菌中得到高水平的表达， 易地在链霉菌中得到高水平的表达，链霉菌 亦必将成为外源基因表达最具潜力的宿主。 亦必将成为外源基因表达最具潜力的宿主
Thank you!
优点
应用范围广, 应用范围广 可被用于鸟枪克隆和 阻断变株随机互补实验, 阻断变株随机互补实验 这在快速 筛选目的基因方面着无法比拟的 优势
程序相对简 方便、 单、方便、 快捷
可以克服宿主对 外源DNA 的限制 外源 性障碍。 性障碍。
缺点
因涉及到原生质体的制备与再生相 对耗时且工作环节多 存在限制性障碍
链霉菌表达系统与方法
主要内容： 主要内容：
一、生物学特性以及目前应用简介 二、链霉菌表达系统的组成 三、表达的一般步骤 四、应用实例 五、链霉菌表达系统特点及前景展望
一、链霉菌生物学特征
链霉菌是一类好氧、丝状能形成孢子的 革兰氏阳性细菌，其主要特点为： 1.G+C含量73%，高于其他类宿主菌 56%~65%。 2.是一种非严格广谱宿主菌。 3.可识别多种外源原核启动子。 4.包膜缺乏分泌障碍，可以得到蛋白的分泌 产物，易纯化，可用于工业生产。
三、外源蛋白在链霉菌中表达的一般步骤
（1）将编码外源蛋白的DNA序列克隆到含有 链霉菌启动子和转录终止子的表达框中； （2）转化及在宿主中稳定维持该DNA融合产 物； （3）外源蛋白在特定培养条件下合成； （4）外源蛋白的纯化及其与天然产物的比较
Байду номын сангаас
方法
转化 PEG- 介导的质粒转化原生质体法 电穿孔法 噬菌体转导法 不仅可以转导 对外源DNA 无 对外源 限制性的链霉 菌，也可以转 导已被确认具 有限制性系统 的链霉菌 结合转移法
DNase印记法 印记法
DNA 结合 蛋白
45bp 与原核生物典型启动子-10和 区相类似 与原核生物典型启动子 和-35区相类似
硫链丝菌素
Hg2+
MerR蛋白 蛋白
tipAL
N端 端 螺旋—转角 螺旋 螺旋 转角—螺旋 转角
SoxR蛋白 蛋白
同源性
TipAL具有DNA结合蛋白活性 具有 结合蛋白活性
硫链丝菌素
tipAS tipA
tipAL
＞＞
tipAS
人体中转化生长因子TGF-α在链霉菌中的表达 在链霉菌中的表达 人体中转化生长因子 转化生长因子：肿瘤细胞能产生一 种刺激静止性生长的细胞呈非静止性生 长的多肽因子。TGF-α是一种多功能肽 类物质，可与表皮生长因子受体结合发 挥一系列的生物学功能，与肿瘤发生关 系甚为密切，是反映肿瘤细胞恶变具有 指示意义的分子指标。
人胰岛素、 大肠杆菌 人胰岛素、IFN-α2、生长激素 在大肠杆菌中， 在大肠杆菌中，外源基因的表达量可达总蛋白的 10%~30%。然而许多在大肠杆菌中表达出来的真核基因 。 产物常常是不可溶的、无生物活性的、或者是不能形成正 产物常常是不可溶的、无生物活性的、或者是不能形成正 不可溶的 确二硫键的蛋白质 的蛋白质。 确二硫键的蛋白质。 尽管分泌型的表达载体可用来部分解决上述问题， 尽管分泌型的表达载体可用来部分解决上述问题，但 是在分泌型的大肠杆菌表达系统中， 是在分泌型的大肠杆菌表达系统中，被运送到细胞的周质 中的外源基因产物时常只有极少量的是具有正确三维折叠 和二硫键连接的蛋白质，其含量常常只有0.1~1.0mg·L-1。 和二硫键连接的蛋白质， 含量常常只有
链霉菌作为表达系统的特点
• 缺点： 缺点：
1.在链霉菌中表达的真核异源蛋白往往产量均 在链霉菌中表达的真核异源蛋白往往产量均 较低，达不到工业化生产水平。 较低，达不到工业化生产水平。 2.使外源蛋白糖基化能力有限。 使外源蛋白糖基化能力有限。 使外源蛋白糖基化能力有限
与大肠杆菌对比： 与大肠杆菌对比：
四、应用实例
一、表达载体： 表达载体： 人体中谷胱甘肽硫转化酶在链霉菌中的表达 分泌载体： 二、分泌载体： 人体中转化生长因子TGF-α在链霉菌中的表达 人体中转化生长因子 在链霉菌中的表达
人体中谷胱甘肽硫转化酶在链霉菌中的表达： 人体中谷胱甘肽硫转化酶在链霉菌中的表达： 使谷胱甘肽分子上的 巯基(SH)与广泛的亚 硝基苯类化合物结合， 使这类致癌物转化成 无毒的化合物 能与细胞内源的一些 阴离子化合物(如胆 红素和亚铁血红素) 结合并参与运输
过程： 过程：
Step1.构建质粒 构建质粒
Step2.大肠杆菌感 大肠杆菌感 受态细胞的制备
转化
Step3.链霉菌原生 链霉菌原生 质体制备、 质体制备、再生
Step4.转化结果检验 转化结果检验
提取
Step5.蛋白提取及纯化 蛋白提取及纯化
PtipA
硫链丝菌素
DNA 结合 蛋白
tipAL tipAS
谷胱甘肽硫 转化酶活性 谷胱甘肽硫转化酶 (GST) 过氧化物酶 活性
GST在癌症及肿瘤的治疗以及保护生物体过氧化 在癌症及肿瘤的治疗以及保护生物体过氧化 反应中起着重要的作用。 反应中起着重要的作用。
材料: 材料
1.菌株和质粒:大肠杆菌(E.coli) ，变铅青链霉菌TK54及质粒 Bluescript M13-。大肠杆菌正选择质粒pKRV。 2.培养基:大肠杆菌用LB培养基，链霉菌液体生长培养基(YEME)， 原生质体再生培养基(R2YE)及基本培养基(MM) 。 3.抗生素:苄氨青霉素贮存液浓度为50mg/ml，使用浓度为 50µg/ml。硫链丝菌素(Thio，thiostrepton)贮存液浓度为 50mg/ml，在MM中使用浓度为7µg/ml，在R2YE培养基中使 用浓度为50µg/ml，上述抗生素贮存液均置20℃冰箱保存。 4.酶和试剂:所用限制性内切酶EcoRV、BamHΙ及Ndel，BglII和 T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶，异丙基-β-D-硫代半乳糖昔 (IPTG) 亲合层析柱用谷胱甘肽琼脂糖(Glutathione-Agarose)