链霉菌实验操作手册
发酵工程制药实验-链霉菌发酵
实验2灰色链霉菌的活化一、实验目的学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。
二、实验原理高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。
三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌；2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤1. 高氏一号培养基的制备（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。
趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。
（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。
2. 斜面接种接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。
为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。
一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。
（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。
（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。
在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。
划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。
注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。
（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。
接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。
实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、实验目的学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。
链霉菌亚甲蓝染色法实验报告
链霉菌亚甲蓝染色法实验报告实验：链霉菌亚甲蓝染色法实验一、实验目的：1.了解链霉菌的形态特征；2.掌握链霉菌亚甲蓝染色法的操作步骤；3.观察链霉菌在显微镜下的染色效果。
二、实验原理：链霉菌是一种常见的革兰氏阳性细菌，其形态特征为在培养基上形成长而曲折的链状菌丝。
链霉菌亚甲蓝染色法是一种常用的染色方法，用于观察链霉菌的形态结构。
该方法利用亚甲蓝染料，将链霉菌染色后，在显微镜下观察其形态特征。
三、实验材料与方法：1.实验材料：（1）链霉菌培养基；（2）链霉菌培养物；（3）亚甲蓝溶液（0.5%）；（4）显微镜；（5）玻璃片。
2.实验步骤：（1）取链霉菌培养物，加入适量的生理盐水进行稀释，制备菌液。
（2）取一片玻璃片，用酒精消毒并晾干。
（3）滴取一滴链霉菌菌液于玻璃片上，用火焰消毒的针头将滴液均匀涂抹于玻璃片上。
（4）将涂有链霉菌菌液的玻璃片，放置在亚甲蓝溶液中浸泡5分钟。
（5）取出玻璃片，用水冲洗干净。
（6）将玻璃片放在显微镜下，使用100倍的镜头观察链霉菌的形态结构。
四、实验结果：在显微镜下观察到的链霉菌呈现为一条条长而曲折的链状菌丝，菌丝之间相互交织，形成复杂的网络状结构。
链霉菌染色后呈现为蓝色，菌丝清晰可见。
五、实验讨论：链霉菌亚甲蓝染色法是一种简单而有效的染色方法。
亚甲蓝是一种碱性染料，具有较强的亲和力，能够与链霉菌细胞壁上的负电荷结合，使菌丝呈现出蓝色。
这种染色方法可以清晰地显示链霉菌的形态结构，有助于对其生长特征和菌株的鉴定。
在本实验中，我们观察到链霉菌在显微镜下的形态结构，即长而曲折的链状菌丝。
链霉菌的菌丝之间交织在一起，形成了复杂的网络状结构。
这种形态特征是链霉菌的重要鉴定特征之一，可以用于区分链霉菌和其他细菌。
六、实验总结：通过本次实验，我们了解了链霉菌的形态特征，并掌握了链霉菌亚甲蓝染色法的操作步骤。
链霉菌亚甲蓝染色法是一种常用的染色方法，能够清晰地显示链霉菌的形态结构。
通过染色后的链霉菌菌丝呈现出蓝色，使其在显微镜下更容易观察和鉴定。
实验室常用生化试剂配方
实验室常用生化试剂配方1.常用抗生素配制以及使用说明（参考链霉菌室操作手册2019版）抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml) 10025(无水乙醇配) 50 25 50 50 25(DMSO配) 100 50 3525(0.15M NaOH配) 50(DMSO配)50 50MM使用终浓度（μg/ml）链霉菌2CMYEME大肠杆菌LA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素紫霉素萘锭酮酸 TMPAmpicillin, Amp bla Chloramphenicol, Cml Hygromycin, Hyg Kanamycin, Km Spectinomycin, Spc Streptomycin, Str Thiostrepton, Thio Erythomycin, Ery Apramycin, Am Viomycin,Vio Nalidixic acid Trimethoprimcat hyg aac/aph aadA str tsr ermE aac(3)IV vph－* 10 10 2 5 10 5 100 10－－ 25 25 20 25 10 － 50－－－－－－ 2.5 － 550-100 25 － 25 50 25 25 20 10-30注意事项：(1) –表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制，配制过程请确保抗生素粉末充分溶解混匀后再分装；（2）Km 和Am有交叉抗性，同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并设置阴性对照；（3）Hyg、Vio易见光分解，配制好后应用锡箔纸包好,使用过程中建议避光操作。
有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, Vio（4）用无菌水配制的抗生素需在超净工作台内用0.22 μm一次性过滤器过滤除菌并分装；氯霉素、TMP、硫链丝菌素可以在超净工作台外配制分装，无需过滤除菌，但需确保配制贮存液所用溶剂（无水乙醇、DMSO）未遭受污染，建议配制氯霉素时使用新的无水乙醇，不要使用抽提质粒或总DNA时用的无水乙醇，以防止污染；DMSO，即二甲亚砜，易挥发，有剧毒；（5）长期不用的抗生素请置于-20℃保存，抗生素粉末按照使用说明一般置于4℃保存，经常使用时可以暂置于4℃保存；（6）抗生素的实际使用浓度请结合实验经验进行适当调整；(7)配制抗生素时应尽量一次性称取抗生素粉末，配制过程中建议穿工作服，戴一次性橡胶手套及口罩，及时清理称量配制抗生素时使用的台面及器具，以避免抗生素及溶剂对自身的损伤及对工作环境的污染。
链霉菌感受态制备
链霉菌感受态制备
链霉菌感受态制备是指培养链霉菌（ Streptomyces）细菌以产生其次级代谢产物。
次级代谢产物是链霉菌细菌在特定条件下产生的化合物，这些化合物对医药、农业和工业等领域有着重要的应用。
以下是一般的链霉菌感受态制备步骤：
1.链霉菌培养：
•选取合适的菌株：选择具有产生特定次级代谢产物潜力的链霉菌菌株。
•培养基准备：准备适宜的培养基，其中包括合适的碳源、氮源、微量元素和其他必要的营养物质。
2.发酵过程：
•接种培养基：将链霉菌接种到培养基中，培养并进行前期发酵过程。
•调控培养条件：控制发酵过程中的环境因素，如温度、pH、氧气供应和搅拌速度等。
这些条件会影响细菌的生长和次级代谢产物的生成。
•感受态诱导：在特定的生长阶段，通过改变培养条件（ 如添加特定的诱导剂或改变营养物质含量）来诱导链霉菌产生次级代谢产物。
3.次级代谢产物提取和分离：
•菌体分离：通过离心或过滤等方法分离菌体。
•次级代谢产物提取：利用化学方法或生物技术手段从菌体培养物中提取次级代谢产物。
•分离纯化：通过色谱、层析等技术对提取的混合物进行分离和纯化，得到目标产物。
4.评估和应用：
•活性评估：对获得的次级代谢产物进行活性评估和检测，确定其可能的生物学活性和潜在应用价值。
•应用研究：将获得的活性物质进行进一步研究，包括药理学、医药化学、生物学等方面，以确定其在医学、农业、工业等领域的应用潜力。
链霉菌感受态制备是一个复杂的过程，需要仔细设计实验条件和严格控制培养环境，以获得理想的次级代谢产物。
同时，对产物的提取、分离和评估也需要具备专业的技术和设备。
aa。
链霉素纯化实验报告
实验名称：链霉素纯化实验实验日期：2023年X月X日实验地点：实验室实验目的：1. 学习和掌握链霉素的提取和纯化方法。
2. 了解不同纯化步骤对链霉素纯度的影响。
3. 优化实验条件，提高链霉素的纯度和回收率。
实验材料：1. 链霉素发酵液2. 乙酸乙酯3. 无水乙醇4. 氯化钠5. 硅胶6. 重结晶溶剂（如甲醇、丙酮等）7. 分析纯试剂8. 实验器材：离心机、旋转蒸发仪、玻璃棒、漏斗、滤纸、烧杯、锥形瓶等实验方法：1. 预处理将发酵液在室温下静置，使沉淀物沉淀，取上清液备用。
2. 初步纯化将上清液用乙酸乙酯萃取，静置分层后，取下层有机相，使用旋转蒸发仪去除溶剂，得到初步纯化的链霉素。
3. 柱层析将初步纯化的链霉素用甲醇溶解，过硅胶柱，收集洗脱液。
调节洗脱液pH至6.0-7.0，以氯化钠溶液作为洗脱剂，收集目标组分。
4. 精制将收集到的目标组分用无水乙醇进行重结晶，得到精制的链霉素。
5. 分析对纯化的链霉素进行HPLC分析，测定其纯度和含量。
实验结果：1. 初步纯化通过乙酸乙酯萃取，初步纯化的链霉素纯度约为60%。
2. 柱层析经过硅胶柱层析，链霉素纯度提高至90%。
3. 精制通过重结晶，链霉素纯度达到98%以上。
4. HPLC分析HPLC分析结果显示，纯化后的链霉素纯度为98.5%，含量为1.5mg/mL。
实验讨论：1. 在初步纯化过程中，乙酸乙酯萃取效果较好，可以有效地去除发酵液中的杂质，提高链霉素的纯度。
2. 柱层析是纯化过程中的关键步骤，通过调节洗脱剂pH和氯化钠浓度，可以进一步分离和纯化链霉素。
3. 重结晶是提高链霉素纯度的有效方法，通过选择合适的溶剂和结晶条件，可以使链霉素结晶析出，从而提高其纯度。
4. 在实验过程中，应注意操作规范，避免污染和损失，以保证实验结果的准确性。
实验结论：本实验成功地从发酵液中提取和纯化了链霉素，通过乙酸乙酯萃取、柱层析和重结晶等步骤，将链霉素纯度从60%提高到98.5%，为后续研究提供了高质量的实验材料。
印片法链霉菌实验报告
印片法链霉菌实验报告
实验目的：
本实验旨在研究印片法对链霉菌进行分离和鉴定的效果，为链霉菌的研究提供实验数据和参考。
实验材料：
1. 链霉菌培养基
2. 无菌培养皿
3. 恒温培养箱
4. 实验室常用器材和试剂
实验步骤：
1. 准备工作：将链霉菌培养基培养至适宜的生长状态，确保培养基无污染。
2. 取一块无菌的培养基，倒入培养皿中，并均匀摊开。
3. 取一支火针，在火焰中消毒并冷却后，将其沾取链霉菌培养液的菌落，然后将其均匀涂抹在培养基上。
4. 用无菌的铁环或火针，在链霉菌菌落上进行串联接种，即将链霉菌菌落划过培养基表面，使菌落由密集到稀疏排列。
5. 将培养皿盖好，置于恒温培养箱中，在适宜的温度下培养一段时间，通常为24-48小时。
6. 观察菌落生长情况，并记录其形态、颜色、直径等特征。
7. 根据菌落的形态特征，进行初步的链霉菌鉴定。
8. 如有需要，可进行进一步的生化实验或分子生物学实验，以确认链霉菌的鉴定结果。
实验结果：
根据实验观察，链霉菌在培养基上形成了典型的菌落，呈现出特定的形态和颜色。
菌落直径在一定范围内，具有一定的变异性。
初步鉴定结果表明，该菌落为链霉菌。
实验结论：
本实验通过印片法成功分离和鉴定了链霉菌。
印片法是一种简单、快速且有效的方法，可用于微生物的分离和鉴定。
该实验结果可为链霉菌的进一步研究提供参考和基础数据。
农用细黄链霉菌使用说明书
农用细黄链霉菌使用说明书
农用细黄链霉菌（Bacillus subtilis）使用说明书
1. 产品介绍
农用细黄链霉菌是一种对多种病原菌有抑制作用的微生物制剂，广泛应用于农业生产中的病害防治。
2. 使用方法
2.1 喷雾
将适量的农用细黄链霉菌制剂溶解于适量的水中，按照农作物叶面的湿度和药液浓度的要求进行喷雾处理。
2.2 种植基质处理
在种植基质中添加适量的农用细黄链霉菌制剂，并与基质充分混合，确保农作物根系与制剂接触。
3. 使用剂量
根据不同的作物病害发生程度和作物生长阶段，以及制剂浓度可能的误差等因素进行适量的剂量调整。
4. 注意事项
4.1 使用前请先进行小范围试验，确保农用细黄链霉菌对目标
病原菌有有效的抑制作用，并不对作物产生明显的伤害。
4.2 适量使用，避免过量喷洒或过度浓度的种植基质处理，以
免对作物产生不良影响。
4.3 储存于阴凉、干燥的地方，避免阳光直射和高温环境，以
免降低制剂活性。
4.4 使用过程中请佩戴防护手套、口罩等个人防护装备，避免
直接接触制剂。
5. 包装和保存
农用细黄链霉菌制剂按照标准包装，密封保存，避免潮湿和温度过高的环境。
请在保质期内使用，并在开封后尽快使用完毕。
6. 效果评估
为了评估产品的效果，请在施用后一定时间内观察农作物的生长和病害的发展情况，根据实际情况进行调整并进行效果评估。
7. 技术咨询
如需了解更多关于农用细黄链霉菌的技术信息和应用建议，请咨询相关专业人士或联系产品供应商。
微生物学实验链霉菌的形态结构几种常见霉菌形态结构的观察PPT学习教案
第17页/共30页
根酶
第18页/共30页
第19页/共30页
毛霉属：无匍匐菌丝、假
根和囊托； 犁头霉属和根霉属：有匍匐 菌丝、假根和囊托； 犁头霉属：孢囊梗不与假根 相对，孢子囊梨形；
第20页/共30页
曲霉
第21页/共30页
Aspergillus
第22页/共30页
第23页/共30页
青霉
第24页/共30页
霉菌的形态观察方法
插片法 玻璃纸法 印片法 试管直接观察法
第25页/共30页
直接制片观察霉菌
在载玻片上加1d乳酸石炭 酸棉蓝染色液，用解剖针从 菌落边缘处，挑取少量菌丝 （或取很薄的一层切片）， 先于50%乙醇中浸一下，洗去 脱落的孢子，再放在载玻片 上的染液中，用解剖针将菌 丝分开。盖第上26页盖/共30页玻片，置低 倍镜下观察，必要时换高倍
第27页/共30页
结果
绘图说明放线菌与霉菌自然生长状态的个体形 态特征。
思考题
怎样才能在显微镜下观察到自然生长状态的 放线菌与丝状真菌？
第28页/共30页
下次实验
实验11. 平板菌落计数法 实验12. 光电比浊计数 实验13. 直接计数法(显微镜 )
第29页/共30页
感谢您的观看！
第30页/共30页
微生物学实验链霉菌的形态结构几种常 见霉菌形态结构的观察
会计学
1
第2页/共30页
第3页/共30页
菌落计数
(p208 页 )
1.单个菌落; 2.菌落数量; 3.分布状况.
10-5 358
352
363
10-6 35
33
38
第4页/共30页
发酵工程制药实验链霉菌发酵
发酵工程制药实验：链霉菌发酵发酵工程制药实验是制药技术中的重要环节，通过对发酵过程的研究和实验，可以获得制造高质量药品的关键信息。
本文将介绍在实验室中进行链霉菌发酵的方法和步骤，并分析其中的关键因素。
实验目的链霉菌（Streptomyces）是一种广泛存在于自然界中、能够产生许多重要生物活性分子的细菌。
它们具有产生抗生素、抗肿瘤剂、免疫抑制剂等药物的能力，因此被广泛用于制药和医疗领域。
链霉菌的发酵实验可以帮助我们掌握其生长和代谢规律，了解影响链霉菌生长的因素如何调控，探索最优的发酵条件以提高目标产物的产量和纯度等。
因此，本实验的主要目的是：通过链霉菌发酵的实验，掌握发酵工程制药实验的基础理论和操作技巧，探索链霉菌发酵的优化条件。
实验步骤1. 配置培养基链霉菌生长需要适当的培养基，因此我们需要配置基于木质素和琼脂的培养基，其中需添加铁、镁等元素和麦芽糊精等营养成分。
将制备好的固体培养基加入烧过的三角瓶中，用自来水洗净后，用酒精灯加热瓶口和瓶颈，使其不受污染。
2. 实验前消毒和预先培养试管将消毒瓶（80%乙醇）放在洁净桌面上，将三角瓶紫外线灯消毒30分钟，然后将三角瓶横放在洁净桌面上，从洁净试管中取出玻璃珠，放入三角瓶内，用酒精灯烘干瓶口后盖上。
将预备菌株（常见的链霉菌菌株如海洋链霉菌、链霉菌菌株NRRL2234）在木质素琼脂平板上通过接种的方式进行预先培养。
3. 移液接种在曝气装置中注入适量空气使溶液震荡，将链霉菌菌液铸在劳氏肉汤培养基中，在摇床上进行培养。
培养过程中要定时观察并调节培养条件如温度、曝气速率和PH值等。
通过留取一定量的液体给种管，在适当的体积下移液接种，使样品达到合适的菌落密度。
4. 发酵条件的优化掌握适宜的链霉菌发酵条件对于产品的质量和产量至关重要。
在实验的不同时间点，进行样品的收获和检测，并结合实验室提供的分析工具和技能对链霉菌发酵进行分析和诊断，探寻出最适宜的发酵条件，从而可提高产品产量和质量，开发出更多的新药品。
链霉菌RNA提取
5.5.10 转录谱的测定5.5.10.1 链霉菌总RNA的提取①液体培养基中生长的菌体经离心收集并用吸水纸洗干（固体培养时，应在培养基表面铺上玻璃纸，刮取生长在玻璃纸表面的菌体），迅速放入用液氮预冷的研钵中，研磨至粉末状；②取50-100 mg菌体放入预冷的无RNase污染的离心管中（15磅灭菌1小时），迅速加入1 ml Trizol试剂，用微量移液器吹匀并在振荡器上振荡2分钟，室温放置5分钟后12,000 g，4°C离心10 min；③将上清转移至一新的离心管中，加入200 μl氯仿，充分混匀，室温放3分钟后于12,000 g，4°C离心15 min；④将上清转移至一新的离心管中，再加入200 μl氯仿抽提一次，12,000 g，4°C离心10 min；⑤将上清转移至一新的离心管中，加入500 μl异丙醇，-20°C或-70°C沉淀30 min，12,000 g，4°C离心10 min；⑥弃上清，加入1 ml 70％乙醇洗两次，室温干燥后加入适当体积的DEPC处理过的H2O溶解，-70°C冻存，或用甲酰胺溶解RNA沉淀贮存于-20°C。
5.5.10.2 DNase处理RNA样品RNA样品用RQ-RNase free DNase（50 μl体系加1 μl 酶）处理1 h，加水至500 μl，酚、氯仿抽提后，加1/10体积的3 M醋酸钠（pH 5.0），2倍体积的无水乙醇沉淀，最后溶解于适量的水中。
PCR是否有DNA污染。
5.5.10.3 RNA浓度和纯度的检测①利用紫外分光光度计测定所提取RNA在260和280 nm的光吸收值，确定RNA的纯度和浓度。
纯净RNA样品的OD260/OD280比值应介于1.9和2.05之间，比值小于1.8表明蛋白污染，大于2.1可能是降解严重。
根据OD260为1相当于40 μg/ml RNA来计算浓度。
链霉素发酵实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 掌握链霉素发酵的基本原理和操作步骤。
2. 了解发酵过程中关键参数的调控对发酵效果的影响。
3. 通过实验，优化链霉素发酵培养基配方，提高发酵效率。
二、实验原理链霉素是一种重要的氨基糖苷类抗生素，由灰色链霉菌发酵生产。
发酵过程中，灰色链霉菌将葡萄糖等碳源转化为链霉素，同时产生一定的热量和二氧化碳。
发酵过程中，温度、pH值、通气量等参数对发酵效果有显著影响。
三、实验材料1. 菌种：灰色链霉菌2. 培养基：黄豆饼粉培养基、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等3. 仪器：锥形瓶、移液管、pH计、生物传感仪、分析天平、发酵罐等四、实验步骤1. 菌种活化：将灰色链霉菌接种于黄豆饼粉培养基中，37℃恒温培养24小时，活化菌种。
2. 培养基配制：按照实验设计，将黄豆饼粉、葡萄糖、硫酸铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等原料称量，加入适量水，搅拌均匀，制成发酵培养基。
3. 发酵：将活化后的菌种接种于发酵培养基中，置于发酵罐中，控制温度、pH值、通气量等参数，进行发酵实验。
4. 发酵过程监测：定时取样，测定发酵液中的链霉素浓度、pH值、残糖等指标，分析发酵过程的变化。
5. 发酵终止：当发酵液中的链霉素浓度达到预定目标时，终止发酵，收集发酵液。
6. 发酵产物提取：采用适宜的提取方法，从发酵液中提取链霉素。
五、实验结果与分析1. 发酵过程中关键参数的调控：（1）温度：发酵过程中，链霉素产量随温度升高而增加，但过高温度会导致菌体死亡，降低发酵效果。
实验结果表明，发酵温度以28-30℃为宜。
（2）pH值：发酵过程中，pH值对链霉素产量有显著影响。
实验结果表明，pH值以6.5-7.0为宜。
（3）通气量：发酵过程中，通气量对链霉素产量有显著影响。
实验结果表明，通气量以0.5-1.0L/h为宜。
2. 发酵培养基配方优化：通过正交实验，优化发酵培养基配方，结果表明，最佳培养基配方为：黄豆饼粉2.0%、葡萄糖2.0%、硫酸铵1.0%、磷酸二氢钠0.5%、磷酸氢二钠0.5%。
5406链霉菌
上海保藏生物技术中心
Shanghai Bioresource Collection Center
菌种说明
一菌种简介
菌种名称5406链霉菌
编号
规格冻干粉
菌种主要应用
二保存条件
斜面、穿刺菌和冻干粉应在4-10度保存，甘油菌在-80度保存。
三培养条件
培养基高氏合成一号培养基
培养温度28-30度
培养时间5-7天
培养条件
四活化步骤
冻干粉首次活化，将菌粉甩至底部，将尖头一侧用酒精消毒后敲开，取0.2-0.3ml溶解液加入至菌种管中，轻轻弹至菌粉混合均匀，用无菌吸头全部吸出溶解液，全部接种至2支斜面上培养。
注意真空菌种管一旦敲开里面的冻干粉就必须全部被用掉，留着也没用。
五注意事项
1 微生物菌种应保存于低温、清洁和干燥的地方，室温放置时间过长会导致菌种衰退；
2 菌种操作在无菌条件下进行，接种完毕应该灭菌再做丢弃处理；
3 斜面菌种和穿刺菌种保存时间通常为3-6个月，应根据菌种状况及时结转；冻干粉保存时间通常是2-25年；甘油菌保存时间为2-5年。
高氏合成一号培养基：
硝酸钾1g；可溶性淀粉20g；磷酸氢二钾0.5g；七水合硫酸镁0.5g；氯化钠0.5g；硫酸亚铁0.01g；琼脂20g；蒸馏水1000ml；pH 7.2-7.4
版权归上海保藏生物技术中心所有。
1-1-4 实训 链霉菌的鉴定技术
各种色调的蓝 色
褐至黑 各种色调的黄 色 多种多样
轮生一级或二级 直形，波曲形， 钩形或螺旋形
柱形，长圆形，卵圆 形或球形，表面光滑 ，个别小短刺或长刺
（五）实训结果 观察并绘制放线菌的孢子丝形态，并指 明其着生方式。 通过对每种链霉菌进行归类鉴定，实验 中各个菌种各分属于哪个种群？ （六）思考题 用显微镜观察链霉菌的气生菌丝时，有 哪些注意事项？
还可观察菌株的生长状况，如生长好坏，气生菌丝 呈现的状态—绒状、粉状或棉絮状等作为参考特征。
2．形态特征观察 气生菌丝、孢子丝及孢子的观察 （1）将培养3～4天的链霉菌的培养皿打开，放 在显微镜低倍镜下寻找菌落的边缘，直接观察 气生菌丝和孢子丝的形态(分枝情况、卷曲情况 等)。 （2）取清洁的盖玻片一块，在菌落上面轻轻按压 一下，然后将印有痕迹的一面朝下放在有一滴 美蓝染液的载玻片上，将孢子等印浸在染液中， 制成印片。用油镜观培养及 形态特征，与下表进行对比，将每种链 霉菌进行归类鉴定，各分属于哪个种群。
表 放线菌不同种群的形态及培养特征
类群名称 白孢类群 黄色类群 球孢类群
气生菌丝颜色
白色 黄白或黄 淡绿灰黄
基内菌丝颜色
各种颜色 各种色调的黄 色
可溶性色素 有或无 有或无 有或无 有或无
有或无 在蛋白质培养 基产生黑色素 有或无，多数 在蛋白质培养 基产生黑色素 有或无 有或无 有或无 有或无 有或无
淡紫灰类群
表面光滑
多数带刺或有发状物 ，个别种孢子表面光 滑 表面结构多种多样 表面结构多种多样 表面有的光滑，有的 带刺 表面结构多种多样
青色类群 绿色类群 蓝色类群 灰褐类群 金色类群 轮生类群
（三）材料和用具 链霉菌不同类群的纯培养物（培养物可 在高氏一号合成培养基、察氏琼脂合成培养 基、葡萄糖天门冬素琼脂等合成培养基上， 接种培养10~14天左右。）
链霉菌基因实验操作
LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用蔗糖103gK2SO4 0.25gMgCl2·6H2O 10.12g葡萄糖10gDifco酪蛋白氨基酸0.1g微量元素溶液2mlOxoid酵母提取物5gTES 5.73g加蒸馏水至1000ml称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。
使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH2PO4(0.5%) 2.5mlCaCl2·2H2O(5M) 1mlL-脯氨酸(20%) 3.75mlNaOH(1M)调pH至7.3对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌）Oxoid酵母提取物3gOxoid蛋白胨Tryptone 5g麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g葡萄糖10g蔗糖＊340g蒸馏水至1000ml高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。
）MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L制备原生质体时，还要加入：甘氨酸（20%）＊25ml/L＊蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
＊甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。
《生物制药技术》实验指导-实验一
《生物制药技术》实验指导-实验一第一篇：《生物制药技术》实验指导-实验一《生物制药技术》实验指导实验一金霉素链霉菌培养基的制备（验证型）实验目的：1、学会培养基的配制2、掌握灭菌方法。
实验原理：金霉素链霉菌（Streptomyces aureofaciens）亦称“金色链霉菌”，放线菌门(Actinobacteria)，放线菌纲(Actinobacteria)，放线菌目(Actinomycetales)，链霉菌科(Streptomycetaceae)，链霉菌属(Streptomyces)。
在固体培养基上产生金色色素，故名。
其菌落为草帽型, 菌落直径一般为3～5毫米, 表面较平坦, 中间有隆起。
菌落开始为白色，长孢子后变青色。
在显微镜下可以看到短杆状的菌丝。
抗菌素工业上用以生产金霉素。
放线菌是一类介于细菌与真菌之间的单细胞微生物。
放线菌在土壤中分布最多，大多数生活在含水量较低、有机质丰富和微碱性的土壤中。
多数情况下，泥土中散发出的“泥腥味”就是由放线菌中链霉菌产生的土腥素造成的。
放线菌大都好氧，属于化能异养，菌丝纤细，分枝，常从一个中心向周围辐射生长。
因其生长具辐射状，故名放线菌。
放线菌能像真菌那样形成分枝菌丝，并在菌丝末端产生外生的分生孢子，有些种类甚至形成孢子囊，因而曾被误认是真菌。
但其菌落较小而致密，不易挑取。
不少菌种在医药、农业和工业上广泛应用，可产生抗菌素，现已发现和分离出的由放线菌产生的抗生素多达4 000多种，其中，有50多种抗生素已经广泛地得到应用，如链霉素、红霉素、土霉素、四环素、金霉素、卡那霉素、氯霉素等用于临床治疗人的多种疾病；有些可生产蛋白酶、葡萄糖异构酶；有的用于农业生产，如灭瘟素、井冈霉素、庆丰霉素等。
四环素类抗生素是由链霉菌生产或经半合成制取的一类广谱抗生素。
抗菌谱极广，包括革兰氏阳性和阴性菌、立克次体、衣原体、支原体和螺旋体。
品种主要包括金霉素、四环素和土霉素。
四环素早在1948年即开始用于临床，至今已有50余年历史。
灰色链霉菌实验室培养流程
灰色链霉菌实验室培养流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!灰色链霉菌是一种广泛应用于生物制药、生物农药和生物化工等领域的微生物。
灰色链霉菌实验室培养流程
灰色链霉菌实验室培养流程下载温馨提示：该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
本文下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用。
并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Downloaded tips: This document is carefully compiled by the editor. I hope that after you download them, they can help yousolve practical problems. The documents can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!灰色链霉菌（Alternaria alternata）是一种常见的真菌，广泛存在于自然环境中，尤其是在土壤和植物表面。
《具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立》
《具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的分离鉴定及其接合转移方法的建立》一、引言稻瘟病是一种对水稻生产造成严重威胁的病害，而链霉菌因其抗稻瘟病菌活性被广泛研究。
为了有效应对稻瘟病病害，本文通过深入研究，成功分离并鉴定了具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株，并建立了其接合转移方法。
二、材料与方法（一）材料本实验所使用的材料包括：稻瘟病感染的水稻叶片、土壤样品、培养基等。
（二）方法1. 链霉菌的分离与纯化采用涂布法在选择性培养基上分离链霉菌。
经过多次划线纯化，得到纯种链霉菌。
2. 链霉菌的鉴定通过形态观察、生理生化试验及分子生物学方法（如16S rRNA基因序列分析）对链霉菌进行鉴定。
3. 接合转移方法的建立采用原生质体接合转移技术，通过电击等方法诱导链霉菌原生质体的形成，然后进行DNA的接合转移。
三、实验结果（一）链霉菌的分离与纯化经过多次尝试和优化，成功从稻田土壤中分离出链霉菌ⅠT2和ⅡW1两个菌株，并在选择培养基上纯化。
（二）链霉菌的鉴定通过对ⅠT2和ⅡW1菌株的形态观察、生理生化试验及分子生物学方法鉴定，确认其均为链霉菌属。
其中，ⅠT2和ⅡW1菌株具有抗稻瘟病菌活性。
（三）接合转移方法的建立我们成功建立了链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株的接合转移方法。
通过原生质体接合转移技术，实现了DNA的高效接合转移。
其中，电击等物理方法被证明能够有效地诱导原生质体的形成。
通过多次实验，我们优化了接合转移的条件，提高了接合转移的效率。
四、讨论本研究成功分离并鉴定了具有抗稻瘟病菌活性的链霉菌ⅠT2和ⅡW1菌株，并建立了其接合转移方法。
这为进一步研究链霉菌的生物学特性及其在稻瘟病防治中的应用提供了重要的基础。
在链霉菌的分离与纯化过程中，我们采用了多种方法进行优化，以提高分离纯化的效率。
在鉴定过程中，我们不仅进行了形态观察和生理生化试验，还采用了分子生物学方法进行鉴定，以确保鉴定的准确性。
此外，我们还研究了不同因素对接合转移效率的影响，为提高接合转移效率提供了重要的参考依据。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
链霉菌实验室操作手册第一章培养基抗生素生长因子 (3)常用抗生素及其使用浓度 (3)LB（Luria-Bertani）培养基 (3)LA (3)基本培养基（MM） (3)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用 (4)YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌） (4)TSBY （1L）（液体培养链霉菌） (4)MS培养基 (5)2CMY培养基（用于井岗的接合转移） (5)YMS培养基（阿维，井岗产孢） (5)YD培养基 (5)生长因子补充物的使用浓度 (6)第二章DNA基本操作 (7)大肠杆菌质粒的抽提 (7)酶连反应 (7)DNA片段凝胶回收 (8)DNA纯化 (9)E.coil总DNA的提取 (9)链霉菌质粒DNA的小量提取（还需改进） (10)去磷酸化处理（详见分子克隆实验指南以及Takara的CIAP使用说明） (10)AT克隆（详见说明书） (10)Southern Blot (11)第三章PCR及相关技术 (13)PCR (13)PCR重组（详见《PCR技术实验指南》p429 重叠延伸技术） (14)PCR定点诱变（DpnI法） (14)第四章基因片段转移技术 (15)大肠杆菌CaCl2法制备感受态细胞及DNA转化 (15)DNA转化 (15)大肠杆菌质粒的快速检测 (15)接合转移（详见英文《手册》249页） (16)链霉菌原生质体的制备 (16)链霉菌原生质体的转化 (17)PCR-Targeting技术中E.coli电转化感受态的制备及电转化 (17)第五章RNA操作技术 (19)链霉菌总RNA的抽提 (19)链霉菌的RT-PCR（promega RT kit） (19)第六章蛋白质基本操作技术 (21)SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色 (21)大肠杆菌可溶性蛋白表达及抽提（用于由IPTG诱导的表达体系）： (21)链霉菌总蛋白抽提： (22)大肠杆菌目标蛋白的诱导及总蛋白检测（含T7表达系统如BL21菌株中的pET系列表达体系）： (22)Western Blot (23)第七章遗传作图相关技术 (25)链霉菌孢子悬液的制备 (25)链霉菌中NF的证明 (25)孢子杂交 (25)在遗传图谱上两个标记基因之间定位新的基因 (25)第八章其他技术 (27)链霉菌菌种保藏 (27)检测链霉菌淀粉酶的活性 (27)第一章培养基抗生素生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌M M2CM Y E M E L A或L B氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrerm Eaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?5010510010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-50*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为 1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
配置MM的琼脂有lab agar、Ice agar(IA)R5（1L）链霉菌原生质体转化时用蔗糖103gK2SO4 0.25gMgCl2·6H2O 10.12g葡萄糖10gDifco酪蛋白氨基酸0.1g微量元素溶液2mlOxoid酵母提取物5gTES 5.73g加蒸馏水至1000ml称取5.5g Difco琼脂放入500ml三角瓶中，倒入250ml上述溶液，然后塞上塞子后8磅灭菌（114度15分种）。
使用时，将培养基融化，每瓶中加入：KH2PO4(0.5%) 2.5mlCaCl2·2H2O(5M) 1mlL-脯氨酸(20%) 3.75mlNaOH(1M)调pH至7.3对营养缺陷型菌株加入适当的营养因子（请参考《手册》）YEME(酵母膏-麦芽膏培养基) 1L（液体培养链霉菌）Oxoid酵母提取物3gOxoid蛋白胨Tryptone 5g麦芽提取物（BD公司原Difco公司218630）3g葡萄糖10g蔗糖＊340g蒸馏水至1000ml高压灭菌后加入：（8磅灭菌，113－114゜C，15min，自动灭菌锅一次不能灭过多东西，否则会灭不彻底。
）MgCl2·6H2O(2.5M) 2ml/L制备原生质体时，还要加入：甘氨酸（20%）＊25ml/L＊蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
＊甘氨酸被认为能干扰链霉菌细胞壁的形成，使菌丝体片段更短，利于溶菌，有利于外源DNA的导入。
TSBY （1L）（液体培养链霉菌）Oxoid胰胨豆汤粉（TSB）30g蔗糖＊340gOxoid酵母抽提物5g蒸馏水至1000ml*不同菌株培养需要不同浓度的蔗糖，蔗糖的主要作用是维持链霉菌生长时的渗透压。
MS培养基将黄豆饼粉加蒸馏水煮2到3小时，用纱布过滤得到滤液，将每250ml滤液分装到装有5g 琼脂，5g 甘露醇的500ml三角瓶中，10磅灭菌，使用时调pH7.2-7.3。
2CMY培养基（用于井岗的接合转移）可溶性淀粉10g胰蛋白胨2gNaCl 1g(NH4 )2SO4 2gK2 HPO4 1gCaCO3 2g无机盐溶液* 1 ml琼脂20g蒸镏水1000 mlPH7.2无机盐溶液(每升)FeSO4 .7H2 O 1gMgCl.6 H2 O 1gZnSO4. 7H2 O 1gYMS培养基（阿维，井岗产孢）酵母抽提物4g可溶性淀粉4g麦芽糖10gCoCl. .6 H2 O 5mg琼脂20g蒸镏水1000 mlPH7.2YD培养基酵母抽提物4g麦芽糖10g葡萄糖4gMgCl 2gCaCl 1.5g琼脂15g蒸镏水1000 mlPH7.2生长因子补充物的使用浓度天蓝色链霉菌1258 、J1501等都是营养缺陷型菌株，培养这些菌株时一般需向培养基中补加营养因子，使用浓度如表生长因子补充物的使用浓度表化合物储存液（mg/ml）1终作用浓度（μg/ml）组氨酸（Histidine）10 50其它氨基酸27.5 37腺嘌呤，鸟嘌呤，1.5 7.5胸腺嘧啶，尿嘧啶维生素0.1 0.51.储存液用无菌去离子水配置，8磅灭菌后4o C保存。
2.对于半胱氨酸营养缺陷型菌株，补充光氨酸。
第二章DNA基本操作大肠杆菌质粒的抽提苯酚/氯仿溶液抽提法1.接种5ml LB，37℃摇床过夜培养（12小时）2.离心，3000rpm，5min去上清3.振荡混匀沉淀，分装在2个离心管中，spin一下，吸去上清，加入150μl的溶液I（50mmol/L葡萄糖, 25mmol/L Tris·Cl(PH8.0), 10mmol/L EDTA(PH8.0) 在10lbf/in2（6.895×104Pa）高压蒸气下灭菌15min（8磅），贮存于4℃），剧烈振荡5分钟打散菌体（菌体不打散容易在产物中出现较多蛋白）。
4.加入300μl溶液II（0.2mol/LnaOH, 1%SDS, 用2倍的溶液现配现用）后立即振荡混合均匀，处理2分钟后加入225μl溶液III（5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml）混合均匀，12000rpm离心5min，取上清液中于新的离心管。
5.加120μl酸性苯酚/氯仿溶液，振荡混匀，12000rpm离心5min，再取上清液中于新的离心管中。
6.用120ul氯仿重复操作5。
7.加等体积的异丙醇或2倍体积的乙醇，混匀，12000rpm离心7min。
8.沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。
50℃烘干后加适量无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
氯化锂抽提法1.前四部同苯酚/氯仿溶液抽提法（用Solution I II III处理）2.加等体积的异丙醇，混匀，沉淀DNA，12000rpm离心7min。
去上清，尽量去干净。
3.用少量70％乙醇洗一下（洗去异丙醇），离心去尽酒精，50℃烘干沉淀，用适量ddH2O（100ul）充分溶解（可在50度水浴中助溶）后加入4/5体积的氯化锂溶液（浓度约10mol/L）处理1min沉淀RNA和蛋白。
4.12000rpm离心5min，取上清液于新的离心管中，用等体积的异丙醇混匀，12000rpm离心8min，去上清。
5.将沉淀用70%乙醇洗涤两次,每次10min。
50℃烘干后加一定量的无菌去离子水（ddH2O）溶解，-20℃保存。
酶连反应一般采用10μl反应体系：T4连接酶1μl ，连接酶缓冲液1μl ，外源片段与载体按DNA 摩尔含量3:1加入即可。
如果是粘端连接，则需把外源片段和载体的混合物在50度处理10分钟使粘端变性，然后立即放入冰中5分钟。
平端连接采用14度，粘端连接采用16度，连接4小时以上（一般可过夜）。
＊外源片段与载体按DNA 摩尔含量为3:1或外源更多。
DNA片段凝胶回收1试剂盒回收 (离心法)（详见说明书）(1)在长波紫外灯下切下含有目标DNA的琼脂糖凝胶,用纸巾吸干凝胶表面的液体并切小.计算凝胶的重量,该重量作为一个凝胶体积(如1oomg=1ooul)(2)根据凝胶的浓度,加DE-A 液凝胶浓度DE-A溶液体积≤1.0% 3个凝胶体积≤1.5% 4 个凝胶体积≤2.0% 5 个凝胶体积混匀后于75o C加热,(低熔点琼脂糖凝胶于45o C加热),间断混合,直到凝胶熔化(6-8分钟). (3)加0.5个DE-A体积的DE-B溶液,混匀(是否需调整PH值,见注意事项1);当分离的DNA片段小与400bp 时,加入异丙醇至终浓度为20%;(4)吸3中的混合液,转移到DNA制备管,3600rpm离心1分钟.如制备管中有残留,适当提高速度,再离心1分钟,去滤液;(5)将制备管置回离心管,加0.5ml W1溶液,3600rpm离心30,弃滤液;(6)将制备管置回离心管,加0.7ml W2溶液,3600rpm离心30,弃滤液,重复一次; （W2中含有酒精，应保证瓶子密封。