DNA的琼脂糖凝胶电泳

加样
用移液器将DNA 样品液5μL与 用移液器将 DNA样品液 5μL 与 6× 上样缓冲液 1μL混匀后加入加样孔，记录点样顺序。其中一 μL混匀后加入加样孔，记录点样顺序。 个加样孔中加入DNA分子量标准品6 个加样孔中加入DNA分子量标准品6
电泳
加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极， 加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极，另 一端连接正极（千万不要搞错） 接通电源， 一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开 始电泳。在样品进胶前可用略高电压， 始电泳。在样品进胶前可用略高电压，防上样品 扩散。 样品进胶后， 应控制电压降不高于5 扩散 。 样品进胶后 ， 应控制电压降不高于 5 V／ cm(电压值 V 电泳板两极之间距离比 ) cm( 电压值V／ 电泳板两极之间距离比) 。 当染料 条带移动到距离凝胶前沿约lcm时 停止电泳。 条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。
五、思考题
（1）琼脂糖与琼脂有什么不同？本次实验 为何选琼脂糖作为电泳介质？ （2）上样缓冲液由哪些成分组成？各有何 作用？ （3）常用的DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液有 ）常用的DNA琼脂糖凝胶电泳缓冲液有 哪些？为何在这些电泳缓冲液中要加入 EDTA？ EDTA？
琼脂和琼脂糖
琼脂是由琼脂糖和琼脂果胶组成的。琼脂糖是线性的多 聚物，基本结构是1,3连结的β 半乳呋喃糖和1,4连结的 聚物，基本结构是1,3连结的β-D-半乳呋喃糖和1,4连结的 3,6-脱水α-L-半乳呋喃糖。琼脂果胶是由许多更小的分子 3,6-脱水α 组成的异质混合物。它们的结构相似，但带硫酸根和羧 基组分，凝胶能力差。 琼脂糖具有亲水性，并几乎完全不存在带电基团，对敏 感的生物大分子极少引起变性和吸附，是理想的惰性载 体。在琼脂糖制备过程中需要把琼脂果胶尽量去除，否 则琼脂糖有可能存在极微量硫酸根和丙酮酸取代电离基 团，就会造成电内渗（EEO），电内渗对质点的移动产 团，就会造成电内渗（EEO），电内渗对质点的移动产 生影响。质量较好的琼脂糖硫酸根含量比较低，通常在 0.2%以下，电内渗比较小，通常在0.13以下。这也就是琼 0.2%以下，电内渗比较小，通常在0.13以下。这也就是琼 脂糖比琼脂贵那么多的原因了。
观察与拍照 小心地取出凝胶置托盘上， 小心地取出凝胶置托盘上 ， 并用水轻轻冲洗 胶表面的溴化乙锭溶液， 胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板推至预先 浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内， 浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长 254nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现 254nm紫外灯下进行观察。DNA存在的位置呈现 橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带． 橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带．荧光在 4-6小时后减弱，因此，初步观察后，应立即拍照 小时后减弱，因此，初步观察后， 记录下电泳图谱． 记录下电泳图谱．观察时应戴上防护眼镜或有机 玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害。 玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害。
上样缓冲液
含0.25％溴酚蓝：指示剂 0.25％溴酚蓝：指示剂 0.25％二甲苯青：示踪染料 0.25％二甲苯青：示踪染料 30％甘油的TBE缓冲液：增加密度 30％甘油的TBE缓冲液：增加密度
电泳缓冲液
电泳缓冲液在电泳过程中的一个作用是维 持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生 持合适的pH。电泳时正极与负极都会发生 电解反应，正极发生的是氧化反应（4OH-电解反应，正极发生的是氧化反应（4OH-4e->2H2O+O2)，负极发生的是还原反应（ 4e->2H2O+O2)，负极发生的是还原反应（ 4H++4e->2H2)，长时间的电泳将使正极变 4H++4e->2H2)，长时间的电泳将使正极变 酸，负极变碱。一个好的缓冲系统应有较 强的缓冲能力，是溶液两极的pH保持基本 强的缓冲能力，是溶液两极的pH保持基本 不变。 电泳缓冲液的另一个作用是使溶液 具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁 具有一定的导电性，以利于DNA分子的迁 移，
实验十 DNA的琼脂糖凝胶电泳 DNA的琼脂糖凝胶电泳
实验目的
掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方 法。
一、实验原理
DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷， DNA分子在pH值高于其等电点的溶液中带负电荷， 在电场中向阳极移动。 在电场中向阳极移动。 DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动， DNA分子在电场中通过琼脂糖凝胶而泳动，除了 电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子 电荷效应以外，还有分子筛效应。由于DNA分子 可片段的相对分子质量不同， 移动速度也不同 ， 可片段的相对分子质量不同 ， 移动速度也不同， 所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分 所以可将相对分子质量不同或构象不同的DNA分 离。
三、操作方法
琼脂糖胶液的制备：称取0.6g 琼脂糖胶液的制备：称取0.6g 琼脂糖，置于锥形瓶 中，加入60ml0.5×TBE电泳缓冲液，置于微波炉或 中，加入60ml0.5×TBE电泳缓冲液，置于微波炉或 水浴中加热融化，取出摇匀即为1 水浴中加热融化，取出摇匀即为1％琼脂糖凝胶液。 待凝胶液冷却却至60℃后加入溴化乙锭3µL，使其 待凝胶液冷却却至60℃后加入溴化乙锭3µL，使其 终浓度为0.5µg/mL。 终浓度为0.5µg/mL。
谢谢
EDTA
电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓 电泳缓冲液还有一个组分是EDTA，加入浓 度为1 2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 度为1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等离子 ，防止电泳时激活 DNA酶，此外还可防止 DNA酶，此外还可防止 Mg2+离子与核酸生成沉淀。 Mg2+离子与核酸生成沉淀。
拍照时， 拍照时 ， 照相机加上近摄圈和红色滤光 铺头， 用全色胶卷 。 56光圈 ， 铺头 ， 用全色胶卷。 56 光圈， 曝光时间 根据条带，荧光的强弱进行选择，10-60s 根据条带，荧光的强弱进行选择，10-60s。 将电泳图谱底片适当放大为照片。 将电泳图谱底片适当放大为照片。
四、注意事项
3丶琼脂糖 4、溴化乙锭（EB）10mg/mL:取EB 0.10g， 溴化乙锭（EB）10mg/mL: 10g 完全溶解于10mL水中，避免温室保存。 完全溶解于10mL水中，避免温室保存。 5丶DNA分子量标准品（DNA Marker)。 DNA分子量标准品（ Marker)。 6丶DNA样品液 DNA样品液
TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋 TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋 在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中 在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中 电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量 ），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两 ），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两 种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用 种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用 TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收 TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收 DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。TAE 的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不 可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液硼酸（TBE） Tris-硼酸（TBE） 使用液：0.5X： 使用液：0.5X：0.045mol/L Tris-硼酸 ，0.001mol/L TrisEDTA 储存液：5X： 储存液：5X：54g Tris碱 ，27.5g硼酸，20ml 0.5mol/L Tris碱 27.5g硼酸，20ml EDTA（pH8.0） EDTA（pH8.0） Tris-乙酸（TAE） Tris-乙酸（TAE） 使用液：1X： 使用液：1X：0.04mol/L Tris-乙酸， 0.001mol/L EDTA Tris储存液：50X： 储存液：50X：242g Tris碱， 57.1ml冰乙酸，100ml Tris碱， 57.1ml冰乙酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0） EDTA（pH8.0）
0.6~1.4%琼脂糖凝胶适用于3*106~11*106相对分子 琼脂糖凝胶适用于3 11* 质量的DNA分子或片段的分离，所需DNA样品量 质量的DNA分子或片段的分离，所需DNA样品量 为0.5~1.0ug。 ug。 琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色。 琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶染色。 溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基 溴化乙啶分子可插入DNA双螺旋结构的两个碱基 之间， 形成一种荧光络合物。 254nm 波长紫外 之间 ， 形成一种荧光络合物 。 在 254 nm波长紫外 光照射下， 呈现橙黄色的荧光 。 光照射下 ， 呈现橙黄色的荧光。 用溴化乙啶检测 DNA，可检出10 以上的DNA含量。 DNA，可检出10-9g以上的DNA含量。
胶板的制备
在制胶槽内插入样品梳， 在制胶槽内插入样品梳，将凝胶液倒入制 胶槽中。待胶凝固后，取出梳子 ， 胶槽中。待胶凝固后，取出梳子，讲内槽 放入电泳槽内， 加入0 放入电泳槽内 ， 加入 0.5×TBE 电泳缓冲液 TBE电泳缓冲液 至电泳槽中，使其没过凝胶表面1 mm， 至电泳槽中，使其没过凝胶表面1~2mm， 排除加样孔中的气泡。 排除加样孔中的气泡。
溴乙锭是DNA诱变剂，配制和使用EB染色液时， 溴乙锭是DNA诱变剂，配制和使用EB染色液时， 应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地 面上。凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品，必须经 专门处理后，才能进行清洗或弃去。 为使DNA完全酶解，需加入适量、足够的酶。太 为使DNA完全酶解，需加入适量、足够的酶。太 少反应不完全，太多则很费。由于每次购进的酶 浓度不可能相同，因此酶和DN A加入的体积不能 浓度不可能相同，因此酶和DN A加入的体积不能 固定，合适的酶量应该通过预试验来定。
DNA酶解过程中，使用的器具都应干净， DNA酶解过程中，使用的器具都应干净，并经消 毒 。 配制试剂需用灭菌的双蒸水还要防止限制性 内切酶被污染。 内切酶被污染。 加样量的多少决定于加样槽最大容积。可以采用 大小不同样品糟模板以形成容积不同的加样槽。 加人样品的体积应略少于加样槽容积。为此，对 于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。