DNA琼脂糖凝胶电泳制备全过程图解

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生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析分析

凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
铺
胶
凝胶凝固后取出梳子
加电泳缓冲液
准备样品
点
样
电
泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照
相
DNA琼脂糖凝胶电泳
实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型凝
胶 ——分离、鉴定、纯化DNA
在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解
离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分
子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分
子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。
实验原理
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium
bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出110ng的DNA条带, 从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。
此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA
条带, 用于以后的克隆操作。
状DNA>开环DNA
DNA片段越长，泳动速度越慢
在低电压时，泳动速度与电场强度成正比
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（W/V,%）分离范围（kb）
0.3
0.6 0.7 0.9 1.2
5-60
1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6
1.5
2.0
0.2-4
0.1-3
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
胶浓（%） 0.6 溴酚蓝 b 0.15kb
2kb
1.6kb
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝

琼脂糖凝胶电泳操作步骤

实验原理、材料、方法、结果、讨论琼脂糖凝胶电泳操作步骤琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm观察：紫外灯下观察，照相PCR-SSCP聚合酶链反应单链构象多态性PCR实验原理：在微量离心管中，加入适量的缓冲液，模板DNA，dNTPs ，Taq DNA 聚合酶，一对引物，以高温变性、低温退火和中温延伸三个反应为一个循环，经过25~35次循环，最终使特异区段的DNA扩增数百万倍，满足分子生物学下游操作。

介绍：PCR-SSCP分析技术是一种DNA单链凝胶电泳技术，它根据形成不同构象的等长DNA单链在中性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳迁移率变化来检测基因变异。

该技术已被广泛用于癌基因和抗癌基因变异的检测、遗传病的致病基因分析以及基因诊断、基因制图等领域。

PCR-SSCP分析的基本程序：1、通过PCR扩增特定靶序列，2、将扩增产物变性为单链，3、进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

PCR反应体系：（单位：微升）Buffer液： 2.5引物1： 1引物2： 1dNTP: 2模板DNA： 1双蒸水： 16.5Taq DNA聚合酶： 1非变性聚丙烯酰胺凝胶:1、30%聚丙烯酰胺（交联度49:1） 4ml，2、50×TAE缓冲液 0.2ml，3、1%TEMED 1ml5、蒸馏水 4.7ml，4、10%过硫酸铵（AP） 0.1ml银染步骤：1、电泳结束，小心取出凝胶，置10%乙醇液中固定5分钟。

（防止再扩散）2、置凝胶于1%硝酸氧化3分钟。

（预处理）3、用双蒸水荡洗凝胶1分钟，换液两次。

4、置凝胶于0.012mol/L硝酸银液中20分钟。

使银离子与DNA结合。

5、弃去硝酸银，用双蒸水荡洗凝胶1分钟，换液两次。

6、用0.019%甲醛液，含0.28mol/L无水碳酸钠使胶还原，银离子变成银颗粒而显色。

直至所需的显色深度。

7、置凝胶于10%冰乙酸停止还原反应。

DNA凝胶电泳

DNA凝胶电泳
制胶，铺胶
材料工具：制胶模板，TAE或TBE缓冲液，TAE专用瓶，Aarose I-H，配DAB瓶，微波炉应用液制备：取200ml 5×TBE缓冲液到TAE专用瓶中；
向瓶中加水，使液面到1000ml处
取电泳槽内的有机玻璃内槽洗干净，晾干，放入制胶玻璃板，将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子；
取Aarose I-H 3g至“配DAB瓶”中；
向瓶中加入200ml应用液，混匀液体；
将盖子斜放于瓶口，将瓶置于微波炉中，火力设定10，时间3min；
取出瓶，加入10ul 10ug/ul EB，滴加时枪头置于液面以下，吹打几次，尽量完全打出；将瓶放置几分钟，使瓶中液体降温到65℃左右；
将琼脂糖凝胶液小心均匀地倒入内槽玻璃板，尽量一次铺胶，减少补胶行为的出现，倒入量为使液面距离板梳5mm处左右；
室温静置，待凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，铲掉多余凝胶，将制好的凝胶板放置于保鲜盒中保存；
加样：
向电泳槽中加入应用液，应用液应为制胶时使用的应用液；
将制好的凝胶板放置于电泳槽中，方向为从负极到正极即加样孔在靠近负极方向，应用液的量需要满足将凝胶板完全淹没,注意排出加样孔中气泡；
取加样板，在板上滴加2ul 6×上样缓冲液，每滴之间距离大于1cm；
取10ul DNA样品，滴加到上样缓冲液滴中，用枪吹打混匀，吸取10ul混合液垂直滴加到胶板小槽内，加样时注意不要破坏样品孔周围的凝胶；
开启电源，设置电压 120~140V
时间 30~40分钟
当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳；
取出凝胶板，置于紫外灯下观察，采用凝胶成像系统拍照保存。

DNA琼脂糖凝胶电泳制备全过程图解

精品课件
铺胶
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凝胶凝固后取出梳子
精品课件
加缓冲液
精品课件
准备样品
精品课件
点样
精品课件
电泳
精品课件
注意观察溴酚蓝染液的迁移
精品课件
紫外灯下观察电泳结果
精品课件
照相
精品课件
DNA琼脂糖凝胶电泳
精品课件
实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型
凝胶 ——分离、鉴定、纯化DNA 影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构
象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成缓冲液pH>DNA Pi，DNA带负电荷，迁移率与
分子量对数成反比 DNA分子构象影响迁移率：共价闭环DNA>线
电泳仪
缓冲液琼脂糖
凝胶槽
梳子
电泳槽
溴酚蓝
取液器
精品课件
电泳槽结构
精品课件
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝加样：加样端为负极（黑）电泳：5V/cm 观察：紫外灯下观察，照相
精品课件
溶胶
精品课件
准备胶槽
精品课件
凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
状DNA>开环DNA精品课件来自同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（%）
0.3 5-60
0.6 1-20
0.7 0.8-10
0.9 0.5-7
1.2 0.4-6
1.5 0.2-4
精品课件
分离范围（kb）
琼脂糖凝胶中DNA的观察
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下红色荧光精品课件
主要实验器材

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤

琼脂糖凝胶电泳的操作步骤琼脂糖凝胶电泳的操作步骤如下:1. 制备1%琼脂糖凝胶(大胶用70ml,小胶用50ml):称取0.7 g(0.5 g)琼脂糖置于锥形瓶中,加入70 ml(50ml)1×TAE,瓶口倒扣小烧杯.微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化,摇匀,即成1.0%琼脂糖凝胶液.2. 胶板制备:取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净,晾干,放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好,形成模子.将内槽置于水平位置,并在固定位置放好梳子.将冷却到65?左右的琼脂糖凝胶液混匀小心地倒入内槽玻璃板上,使胶液缓慢展开,直到整个玻璃板表面形成均匀胶层.室温下静置直至凝胶完全凝固,垂直轻拔梳子,取下胶带,将凝胶及内槽放入电泳槽中.添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板为止 .3. 加样:在点样板或parafilm上混合DNA样品和上样缓冲液,上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X.用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内,每加完一个样品,应更换一个加样头,以防污染,加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面.(注意:加样前要先记下加样的顺序).4. 电泳:加样后的凝胶板立即通电进行电泳,电压60-100V,样品由负极(黑色)向正极(红色)方向移动.电压升高,琼脂糖凝胶的有效分离范围降低.当溴酚蓝移动到距离胶板下沿约1cm处时,停止电泳.(5)电泳完毕后,取出凝胶,用含有0.5 ug/ml的溴化乙锭1×TAE溶液染色约20 min,再用清水漂洗10 min.(6)观察照相:在紫外灯下观察,DNA存在则显示出红色荧光条带,采用凝胶成像系统拍照保存实验原理闭合环状质粒、线性质粒和开环质粒DNA由于构形不同，在加溴化乙锭的琼脂糖凝胶电泳上呈现不同的迁移率，因而在紫外灯下观察，能区别闭合环状质粒DNA(cccDNA)、线性质粒DNA(L-DNA)和开环质粒DNA(ocDNA)。

实验材料和试剂(一)实验样品质粒pUC118(二)试剂1(l DNA/HindIII分子量标准2(溴酚蓝指示剂点样缓冲液0.2% 溴酚蓝50% 蔗糖3(1mg/ml溴化乙锭溶液4(电泳缓冲液(TAE)40 mmol/L Tris-乙酸1 mol/L EDTA(配制方法:24.2克Tris碱，5.71ml冰乙酸，10ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0)，定容至5000ml)5(0.7% 琼脂糖凝胶(配制方法:称取琼脂糖0.35克，加入50ml TAE电泳缓冲液)(三)仪器微量移液器电泳仪水平电泳槽透射紫外观察仪实验步骤1(选择合适的水平式电泳槽，调节电泳槽平面至水平。

DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤

DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤物品准备水平电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪、锥形瓶、琼脂糖、电泳缓冲液(1xTBE) 溴化乙锭(EB)溶液、上样缓冲液等实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。

在pH值为8.0- 8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。

采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。

核酸分子中嵌入荧光染料(如EB )后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

实验步骤（1）准备制胶架，用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子（2）配制琼脂糖凝胶及倒胶，琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围a.以1%的胶为例，三角瓶内0.6g琼脂糖+60ml(0.5xTBE)煮胶溶解冷却至60C(不烫手)b.加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5ug/ml）或按照1ul/30mL的比例加入DNAgreen 染料，并充分混匀。

c.倒板,小胶倒入25-30ml左右琼脂糖溶液，大胶则60-70ml左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。

d.室温下充分凝固，大约30分钟-1小时e.垂直向上拔出梳子f.将胶板放入电泳槽g.向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1-2nm.（3）加样将DNA样品(5ul)与6X上样缓冲液( 1ul)混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内，上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40ul为上限，大孔200ul为上限，具体和制胶膜规格相关）。

注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。

每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。

（4）电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为5V/cm (长度以两个电极之间的距离计算)，一般控制电压保持在110v，电流在40mA以上。

DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤

DNA的琼脂糖凝胶电泳实验原理和方法步骤脂糖凝胶泳是用于分别、定和提DNA 片段的准方法。

脂糖是从脂中提取的一种多糖，具水性，但不荷，是一种很好的泳支持物。

DNA 在碱性条件下〔pH8 0 的冲液〕荷，在中通凝胶介向正极移，不同样 DNA 分子片段由于分子和构型不同样，在中的泳速率液不同样。

溴化乙〔 EB〕可嵌入 DNA分子碱基形成光合物，紫外照射后，可分出不同样的区，到达分别、定分子量，重子的目的。

⋯一、实验目的学习和掌握琼脂糖电泳法判断DNA 的原理和方法。

二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是用于分别、判断和提纯DNA 片段的标准方法。

琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。

DNA 在碱性条件下〔的缓冲液〕带负电荷，在电场中经过凝胶介质向正极搬动，不同样DNA 分子片段由于分子和构型不同样，在电场中的泳动速率液不同样。

溴化乙锭〔EB〕可嵌入 DNA 分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同样的区带，到达分别、判断分子量，精选重组子的目的。

三、实验资料实验 14 提取的 DNA 样品，四、器具及药品电泳仪，电泳槽，紫外透射反射仪，恒温水浴锅，微波炉，微量进样器，三羟甲基氨基甲烷，盐酸，醋酸钠， EDTA，琼脂糖，溴酚蓝，溴化乙锭。

五、实验步骤1、安装电泳槽将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的张口封好，放在水平的工作台上，插上样品梳。

2、琼脂糖凝胶的制备称取琼脂糖溶解在电泳缓冲液中，〔按的琼脂糖含量，1-25kb 大小的 DNA 用1%的凝胶，20-100kb 的 DNA 用%的凝胶， 200-2000bp 的 DNA 用 %的凝胶〕置微波炉或沸水浴中加热至完好溶化〔不要加热至沸腾〕，取出摇匀。

3、灌胶将冷却到60℃的琼脂糖溶液轻轻倒入电泳槽水平板上。

4、待琼脂糖胶凝固后，在电泳槽内参加电泳缓冲液，尔后拔出梳子。

5、加样将 DNA 样品与加样缓冲液〔 loading buffer 〕按 4： 1 混匀后，用微量移液器将混杂液加到样品槽中，每槽加 10-20μl，记录样品的点样次序和加样量。

质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳

TBE（5×） 54gTris 27.5硼酸 20ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0) TPE （10×） 108g Tris 15.5ml 磷酸 (85%，1.679g/ml) 40ml 0.5mol/L EDTA (pH8.0)
袱演芒厌弱磨箍溃蚁乙芹挝鸵亥圣龚引帐哪屹哺桔指致艳怕甭宰毫扎戊爸质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
（3）胶浓度（4）电场强度：根据需要选择合适电压。为了尽快得到实验结果，所用电场强度约为5V/cm，但分辨率不高。精确测定DNA分子大小时，电压1V/cm。（5）溴化乙锭简称EB，电泳中的染色剂。
5、 DNA电泳的标准分子量（DNA Marker）目前各厂商开发了各种类型的标准分子量。
室减减态夫载凹拆滚狼枢挠钎育酷支防趾兢让郊匈腰惺刘望垛件伴几变托质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
毛初市薪负龄硼吗植篡畸泪财础炬甩叭巍嫡锅旷恼疙戚煎八剧卵伺压快胀质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
3.0
500bp~1kb
500bp~1kb
4.0
100bp~500bp
6.0
10bp～100bp
抑殷上共缴袄鹃洱弥晾明柞稠硫雇淤剃柯溯山线经堰滨俩桅无国砌享裁竹质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
2、DNA电泳影响因素主要分两方面：DNA分子特性和电泳条件。（1）DNA分子大小 DNA分子越大在胶中摩擦阻力就越大，泳动也越慢，迁移速率与线状DNA分子质量的对数值成反比。（2）DNA分子构型相同分子量质粒DNA，构型不同电泳时受的阻力不同，泳动速率不同。常规电泳中质粒DNA分子的3种构型泳动速率：超螺旋最快、线状次之，开环最慢。

如何分析琼脂糖凝胶电泳图

凝胶电泳结果分析常见问题原因对策DNA条带模糊DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。

电泳缓冲液陈旧电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。

TBE建议使用10就更换。

所用电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃，巨大DNA链电泳，温度<15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。

DNA上样量过多减少凝胶中DNA上样量DNA含盐过高电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分。

有蛋白污染电泳前酚抽提去除蛋白。

DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

出现片状拖带或涂抹带PCR扩增时出现涂抹带、片状带或地毯样带，往往由于酶量多或者酶的质量差，dNTP浓度高，Mg2+浓度高，退火温度过低，循环次数多。

减少酶量或更换酶，减少dNTP浓度，适当降低Mg2+浓度，增加模板量，减少循环次数。

不规则DNA 带迁移电泳条件不合适电泳时电压不应超过20V/cm，温度<30℃，巨大DNA链电泳，温度<15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。

DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

带弱或无DNA 带DNA上样量不够增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低。

DNA降解实验过程中应避免核酸酶污染。

DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。

EB染色的DNA所用光源不合适应用短波长（254nm）的紫外光源。

DNA带缺尖DNA跑出凝胶缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。

分子大小相近的DNA带不易分辨增加电泳时间，核准正确凝胶浓度DNA变性电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀释DNA。

DNA链大，常规电泳不合适。

在脉冲凝胶电泳上个分析。

电泳时ladder 扭曲配胶的缓冲液与电泳的缓冲液不是同时配制。

同时配制，电泳缓冲液高出胶的1-2mm即可。

电泳时电压过高电泳时电压不应超过20V/cm。

DNA的琼脂糖凝胶电泳分析

❖ 3、琼脂糖
❖ 4、溴化乙锭（EB）10mg/ml：取EB0.10g完全溶解100ml水中，避光室温保存。
❖ 5、DNA分子量标准品
实验操作
❖ 1、制备琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖粉，放入锥形瓶中，加入100ml×TAE电泳缓冲液，置微波炉或水浴内加热熔化，取出摇匀即为1％琼脂糖凝胶液。待凝胶液冷却至60℃后加入溴化乙锭5ul，使其终浓度为0.5ul/ml。
性DNA大小 60~5 20~1 0.8 0.7 0.4 0.2 0.1 范围（kb）
❖ 3、DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要是分子筛效应。在 pH8.0~8.3时，核酸分子剪辑几乎不解离，磷酸解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。
❖ 一般情况下，梳子越薄而长，条带越好看；
❖ 上样量不宜过多，会造成条带的相互挤压；
❖ 如果点样孔多余，将样点到中间，尽量避免边缘效应，中间电场比较均匀；
❖ 做胶的缓冲液和跑胶的缓冲液浓度应该一致；
❖ 加样时不要太快，让其自然沉底，均匀分布在电泳孔内；
❖ 电泳开始时可以采用低电压使其跑出孔后，再调高电压。
其中的溴酚蓝在不同浓度琼脂糖凝胶和不同电泳缓冲液中的迁移率不同其迁移位置可作为dna条带电泳位置的参照11加样缓冲液可以增大样品密度以确保dna均匀进入样品孔内还可以使样品呈现颜色从而使加样操作更为便利
DNA的琼脂糖凝胶电泳分析
制作小组：杜金红王成强汪强

实验2-2 DNA琼脂糖凝胶电泳

（4）既可用于DNA也可用于RNA的检测。
（5）EB可加到样品中，也可加到凝胶中，可随时用紫外灯检测电泳的进程和效果。
（6）EB-DNA复合物中的EB发出的荧光比游离的EB强10倍，
因此不需洗净凝胶中游离的EB也可检测出DNA的条带。
3、缺点：
溴乙啶是一种强的致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒入下水道，应进行处理。（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭；（2）室温下放置1小时，不时的摇动；（3）用新华一号滤纸过滤，弃滤液；（4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物处理。
（1）核酸大小与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
凝胶中，DNA片段迁移率与DNA分子大小成反比(≤ 20kb) ，因此通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离时行比较，便可测出未知片段的大小。
（2）核酸构象与琼脂糖凝胶电泳分离的关系
不同构型DNA的移动速度次序为：闭环DNA>直线DNA>开环的双链环状DNA(当琼脂糖浓度太高时，环状DNA不能进入胶中)。
中具有分子筛效应。
DNA分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动（电荷效应）。 DNA分子泳动速率的大小除与DNA分子的带电量有关外，还与DNA分子的大小和空间构象有关（琼脂糖凝胶
的分子筛效应）。
电泳时，用溴酚蓝做前沿指示剂，指示DNA样品在凝胶中的确切位置。溴乙啶是一种荧光染料，可插入DNA双螺旋结构的两个碱基对之间，与DNA分子形成络合物，在紫外光的激发下发出橙黄色的荧光。
凝胶电泳分离生物大分子
◦ 迁移率
电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA 分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸

琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA

琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。

普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

琼脂糖凝胶电泳操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。

注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。

低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。

电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。

注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。

琼脂糖凝胶电泳详细过程与步骤

琼脂糖凝胶电泳的优点
1. 因不含硫酸根和羧基,几乎消除了琼脂的电渗 2. 对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。 3. 凝胶结构均匀，孔径较大，可用来分离酶的复合物、
核酸、病毒等大分子物质。 4. 透明度较好，可直接或干燥成薄膜后进行染色。 5.不吸收紫外光，可直接利用紫外光吸收法作定量测定 6. 样品易回收，常用于制备。
四、实验步骤 ⑴ 1g 琼脂糖加入100ml 1×TAE电泳缓冲液中,摇匀。在
微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。（冷却到60℃，加入
100μl的0.5mg/ml EB，并摇匀。）
⑵ 用胶带将制胶板两端封好,插入适当梳子，将溶解的琼脂糖（约50℃）倒入，室温冷却凝固。
⑶ 充分凝固后撕掉两端的胶布,将凝胶置入电泳槽中，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶1-2mm，小心垂直向上拔出梳子。
都是常用电泳缓冲液,二者相比： 1）TAE的缓冲容量较低，如长时间电泳会被消耗，此时凝胶的
阳极一侧将发生酸性化； 2）TBE比TAE花费稍贵，但有高得多的缓冲容量； 3）双链线状DNA片段在TAE中比在TBE中迁移快10%； 4）对于高分子质量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE，对于低分
子质量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。
贮存温度 4℃ 室温 4℃ 4℃
琼脂糖凝胶中DNA的检测
通过染色, 紫外灯下检测。
主要采用溴化乙锭（ethidium bromide, EB）染色法。
使用EB染色注意事项
（1）EB被认为是一种强致癌物质（2）EB可用来检测单链或双链核酸（3）EB使用时的配制、贮存及使用
EB常用水配制成10 mg/ml的贮存液,于室温保存在棕色瓶或用铝箔包裹的瓶中，使用终浓度为0.5 μg/ml 。（4）当要知道DNA片段准确大小时，凝胶应在无EB情况下电泳，电泳结束后再用EB染色。