DNA琼脂糖凝胶电泳原理

琼脂糖凝胶电泳进行DNA/RNA定量原理

DNA（RNA）定量分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致表示DNA （RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准。

琼脂糖凝胶的配制

根据所需凝胶的浓度秤取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量 EB 混匀，适当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔，如有气泡产生则用玻璃棒驱除，不能过早拔除梳子，应待凝胶完全凝结后才能拔除梳子。

3．P1、P2、P3的配制P1 的配制：在 800ml 去离子水中溶入 Tris 碱 6.06g，

Na2EDTA?2H2O 3.72g，用 HCl 调整 pH 至 8.0，用去离子水调整容积至1升，每升P1内加入RNaseA100mg。

P2 的配制：在 950ml 去离子水中溶入 NaOH 8.0g，20％SDS 50ml，调整容积至 1 升。

P3 的配制：在 500ml 去离子水中溶入醋酸钾 294.5g，用冰醋酸调整 pH 值至 5.5，用去离子水调整容积至1升。

4．常用缓冲液：

TE

pH 7.4

10mmol/LTris?Cl （pH7.4）

1mmol/L EDTA（pH8.0）

pH 7.6

10mmol/LTris?Cl （pH7.6）

1mmol/L EDTA（pH8.0）

pH 8.0

10mmol/LTris?Cl （pH8.0）

1mmol/L EDTA（pH8.0）

STE（亦称 TEN）

0.1mmol/L NaCl

10mmol/LTris?Cl （pH8.0）

1mmol/L EDTA（pH8.0）

STET

0.1mmol/L NaCl

10mmol/LTris?Cl （pH8.0）

1mmol/L EDTA（pH8.0）

5%Triton X-100

TNT

10mmol/LTris?Cl （pH8.0）

150mmol/L NaCl

0.05% Tween 20

电泳缓冲液

Tris-乙酸（TAE）：50×浓贮存液（每升）：242g Tris 碱

5 7.1ml 冰乙酸

100ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0）

使用时再稀释50倍。

Tris-磷酸（TPE）：10×浓贮存液（每升）：108g Tris 碱15.5ml 85％磷酸（1.679g /ml）

40ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0）

使用时再稀释10倍。

Tris-硼酸（TBE）：5×浓贮存液（每升）：54g Tris 碱27.5g 硼酸20ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0）

使用时再稀释10倍。

碱性缓冲液：1×使用液（每升）：5ml10mol/L NaOH 2ml 0.5mmol/L EDTA（pH8.0）

Tris-甘氨酸：5×浓贮存液（每升）：15.1g Tris 碱

94g 甘氨酸（电泳级）（pH8.3）

50ml 10%SDS（电泳级）

2×SDS 凝胶加样缓冲液

100mmol/L Tris?HCl（pH6.8）

200mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）

4%SDS（电泳级）

0.2％溴酚蓝

20％甘油

30％丙烯酰胺：

将29g 丙烯酰胺和1gN,N’－亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加

水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45孔径）过滤除菌查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中

保存于室温。

10mol/L 乙酸铵：

把770g 乙酸铵溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。

1mol/LCaCl2：

在200ml纯水中（Milli-Q水或相当级别的水）溶解54gCaCl2?6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于－20℃。

2.5mol/LCaCl2：

在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2?6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于－20℃。

1mol/L 二硫苏糖醇（DTT）：

用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于－20℃。

0.5mol/LEDTA（pH8.0）：

在 800ml 水中加入 186.1g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na?H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1升，分装后高压灭菌备用。

溴化乙锭（10mg/ml）：

在100ml水中加入1g 溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保存于室温。

1mol/LMgCl2：

在800ml水中溶解203.3gMgCl2?6H2O，用水定容至1升，分装成小份并高压灭菌备用。

酚：氯仿：

把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/LTris?Cl（pH7.6）抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积的0.01mol/LTris?Cl（pH7.6）液层，保存于4℃。

磷酸缓冲盐溶液（PBS）：

在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4，用HCl调节溶液的pH 值至 7.4，加水定容至 1 升，高压蒸汽灭菌 20min。保存于室温。