生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析分析

凝胶冷却至50°C，加EB至终浓度0.5μg/ml
铺
胶
凝胶凝固后取出梳子
加电泳缓冲液
准备样品
点
样
电
泳
注意观察溴酚蓝染液的迁移
紫外灯下观察电泳结果
照
相
Biblioteka Baidu
琼脂糖凝胶中DNA的观察
溴化乙锭（EB）—DNA：紫外光下 桔红色荧光
主要实验器材
电泳仪
缓冲液 琼脂糖
凝胶槽
梳子 电泳槽
取液器
溴酚蓝
电泳槽结构
缓冲溶液配制表
电泳指示剂
核酸电泳常用的指
示剂有两种: 溴酚蓝 (bromophenol blue, Bb )呈蓝紫色；二甲 苯腈( xylene cyanol, Xc ）呈蓝色，它携 带的电荷量比溴酚 蓝少，在凝胶中的 迁移率比溴酚蓝慢。
胶浓（%） 0.6 溴酚蓝 1kb 二甲苯腈
1
1.4 2
0.6kb
0.2kb 0.15kb
2kb
1.6kb
操作步骤
琼脂糖凝胶的制备：溶化，冷却，EB 凝胶板的制备：加梳子，倒胶 样品的制备：样品+1/5体积溴酚蓝
加样：加样端为负极（黑）
电泳：5V/cm
观察：紫外灯下观察，照相
溶 胶
准备胶槽
嵌入染料的存在
荧光染料溴化乙啶用于检测琼脂糖凝胶中的 DNA, 染料会嵌入到堆积的碱基对之间并拉长线 状和带缺口的环状DNA，使其刚性更强, 还会使 线状DNA迁移率降低15％。
离子强度影响
电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的 电泳迁移率。在无离子存在时(如误用蒸馏水配制 凝胶), 电导率最小, DNA几乎不移动; 在高离子强 度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液), 则电导很 高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。
状DNA>开环DNA
DNA片段越长，泳动速度越慢
在低电压时，泳动速度与电场强度成正比
不同浓度琼脂糖分离DNA分子的范围
琼脂糖浓度（W/V,%） 分离范围（kb）
0.3
0.6 0.7 0.9 1.2
5-60
1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6
1.5
2.0
0.2-4
0.1-3
DNA电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。
DNA琼脂糖凝胶电泳
实验原理
琼脂糖为链状多糖 →绳状琼脂糖束→大网孔型凝
胶 ——分离、鉴定、纯化DNA
在 pH 值为 8.0～8.3 时，核酸分子碱基几乎不解
离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时 向正极移动。
采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分
子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分
子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片 段检测其大小的目的。
实验原理
当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium
bromide, EB)染色, 在紫外光下至少可以检出110ng的DNA条带, 从而可以确定DNA片段在凝胶 中的位置。
此外, 还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA
条带, 用于以后的克隆操作。
该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如
密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。
影响DNA迁移率的因素
影响DNA迁移率的因素：DNA分子的大小、构
象，凝胶浓度，电压，电泳缓冲液的组成等
缓冲液pH>DNA pI，DNA带负电荷，迁移率与
分子量对数成反比
DNA分子构象影响迁移率：共价闭环DNA>线