8-液相与超临界流体色谱法

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整体柱
整体柱是在柱管内原位聚合或 固定化了的连续整体多孔结构, 可根据需要对整体材料的表面 作相应的衍生化,是一种新型 的用于分离分析或作为反应器 的多孔介质。多为硅橡胶结构。
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高效液相色谱的流动相
流动相溶剂的要求：
（1）纯度高：固体颗粒和杂质，会堵塞通道、引起基线不 稳，或产生“伪峰”； （2）低粘度：（粘度适中，丙酮、甲醇和乙腈等），若粘 度过高，压力增高，不利于分离。但粘度过低的溶剂 （戊烷、乙醚）也不合适，它们容易在色谱柱或检测器 内形成气泡，影响分离； （ 3 ）化学稳定性好，沸点要高于 55°C ：低沸点容易形成 气泡；
梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性 的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相 的极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果， 缩短分析时间的目的。梯度洗脱的实质是通过不断地变化流 动相的强度，来调整混合样品中各组分的K值，使所有谱带 都以最佳平均K值通过色谱柱。它在液相色谱中所起的作用 相当于气相色谱中的程序升温，所不同的是，在梯度洗脱中 溶质k值的变化是通过溶质的极性、pH值和离子强度来实现 的，而不是借改变温度（程序升温）来达到。 通常通过几个泵分别改变不同流动相流速来实现。
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8.1 高效液相色谱的固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚 性固体和硬胶两大类。 刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.0108~1.0109Pa的 高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在 二氧化硅表面键合各种官能团，可扩大应用范围，它是 目前最广泛使用的一种固定相。一般不用于pH大于8的 体系（为什么）。 硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙 烯与二乙烯苯交联而成。可承受压力上限为3.5108Pa。 可用于pH8-12的体系。
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进样装置
高效液相色谱进样普遍力工作状态，通常使用耐高压的六通 阀进样装置
六通阀.
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高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约 5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应） 较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引 起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道 及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前 和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主 要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术 要求较严。
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d.电化学检测器 选择性
安培法 选择性 电导法 通用
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蒸发光散射检测器 Evaporative Light-Scattering Detector
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8.3 液-固色谱法
固定相：固体吸附剂，如硅胶、氧化铝等，较 常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂（多孔固体）
固体吸附剂按其性质可分为极性和非极性两种类型: 极性吸附剂包括硅胶、氧化铝、氧化镁、硅酸镁、分子 筛及聚酰胺等。可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。 酸性吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、 氧化镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺 和芳香胺。碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧 和吡咯衍生物等。 非极性吸附剂最常见的是活性炭。 各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
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化学键合固定相的方法
化学键合固定相一般都采用硅胶（薄壳型或全多孔微粒 型）为基体。在键合反应之前，要对硅胶进行酸洗、中和、 干燥活化等处理，然后再使硅胶表面上的硅羟基与各种有机 物或有机硅化合物起反应，制备化学键合固定相。键合相可 通过几种途径（了解）： （1）硅酯化（≡Si-O-R） 将醇与硅胶表面的羟基进行酯化反应，在硅胶表面形成 （ ≡ Si-O-R）键合相。酯键易水解断裂。 （2）氯化（ ≡ Si-N=， ≡ Si-R） 如果用SOCl2将硅胶表面的羟基先转化成卤素（氯化）， 再与各种有机胺或有机锂、格氏试剂反应，可以得到各种不 同极性的键合相。热稳定、抗水解。可用非极性或强极性的 溶剂作为流动相。
溶剂 紫外截 止波长 /nm 正己 二硫 四氯 烷 化碳 化碳 190 380 265 苯 氯仿 二氯 甲烷 233 四氢 丙酮 乙腈 甲醇 呋喃 212 230 190 205 水 187
210 245
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二极管阵列检测器
光电二极管的排列
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b.荧光检测器（fluorescence detector）
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高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、 高速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
单向往复泵工作原理
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梯度洗脱装置（包含在高压泵装置中）
高效液相色谱仪由 贮液器、脱气装置、高压泵、进样 器、色谱柱和检测器等部分组成。
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主要部件与作用
1.溶剂贮存器 溶剂贮存器一般由玻璃、不锈钢或氟塑料制成， 容量为1到2 L，用来贮存足够数量、符合要求的流动相。同 时配有过滤器防止流动相中的颗粒进入泵中。 2.脱气装置 防止流动相从高压柱内流出时，释放出气泡进入 检测器。 3.高压输液泵 高压输液泵是高效液相色谱仪关键部件之一， 其功能是 将溶剂贮存器中的流动相以高压形式连续不断地送 入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。
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8.4 化学键合相色谱 （液液色谱）
将固定液机械地涂渍在担体上组成固定相。尽管选用与 固定液不互溶的溶剂作流动相，但在色谱过程中固定液仍 会有微量溶解。以及流动相经过色谱柱的机械冲击，固定 相会不断流失。 70年代初发展了一种新型的固定相—化学键合固定相。 这种固定相是通过化学反应把各种不同的有机基团键合到 硅胶（载体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固 定相。这不仅避免了液体固定相流失的困扰，还大大改善 了固定相的功能，提高了分离的选择性，化学键合色谱适 用于分离几乎所有类型的化合物。分离机理上吸附于分配 机制兼有。
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按空隙深度分为表面多孔型和全多孔型
1. 表面多孔型固定相 基体是实心玻璃球， 外面覆盖一层多孔活性 材料，如硅胶、氧化硅、 离子交换剂、分子筛、 聚酰胺等。死体积小， 传质阻力小，出峰快 2. 全多孔型固定相 由直径为10nm的硅胶微 粒凝聚而成。出峰快， 柱压高
材料科学、材料化学的发展与 色谱发展密切相关
DNA+Fc‐DNA
Pump
Fc‐DNA
DNA
Column C18 Column C 18
Photo Diode photodiode Injector A d t t
Solution Solution
UV
UV lamp 260 nm Waste We collect
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高效液相色谱仪的组成
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流动相溶剂的要求：
（4）溶剂对于待测样品必须具有合适的极性和良好的溶解 性和选择性。 （5）溶剂与检测器匹配 紫外吸收检测器——溶剂在检测器响应范围内无吸收 折光率检测器——溶剂与组分的折光率差别大
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8.2 高效液相色谱仪
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一个液相分离的实例
SH-DNA-NH2 + Fc SH-DNA-Fc + SH-DNA-NH2 + Fc 剩余 剩余
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正相和反相色谱
根据键合相与流动相之间相对极性的强弱，可将键合相 色谱分为极性键合相色谱和非极性键合相色谱。 当流动相极性小于固定相极性时，称作正相色谱（正相 键合相色谱）。其与传统的以硅胶、氧化铝等极性材料为固 定相，以普通非极性有机溶剂为流动相的色谱柱组分流出规 律相似。当流动相极性大于固定相极性时，称作反相色谱 （反相键合相色谱）。反相色谱在现代液相色谱中应用最为 广泛。
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（3）硅烷化（ ≡ Si-O-Si-R3）键合相 将硅胶与有机氯硅烷或烷氧基硅烷反应制备。这类键合 相具有相当的耐热性和化学稳定性，是目前应用最为广泛的 键合相。三个共价链接位点，稳定性好。
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化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；
色谱与电泳
Chromatography and Electrophoresis
色谱分析导论 气相色谱法 高效液相色谱法及超临界流体色谱法 毛细管电泳法
第八章 高效液相色谱法
high performance liquid chromatograph（HPLC)
高效液相色谱法是在经典液相色谱中引入气相色谱理论 与技术发展起来的以液体为流动相的色谱方法。 经典液相色谱：固定相颗粒大、性质单一、人为分辨条 带。 高效液相色谱：颗粒细而规则，孔浅，高压输液，高灵 敏检测器 与气相色谱的区别：组分和固定相、流动相间均有相互 作用；气相色谱中主要是组分与固定相间的作用。
高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素 B 、 黄曲霉素、卟啉类化合物、 农药、药物、氨基酸、甾类 化合物等有响应；
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c. 示差折光检测器（differential refractive index detector） 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。 差值与浓度呈正比； 通用型检测器（ 每种物质具有不同的 折光指数）； 灵敏度低、对温 度敏感、不能用于梯 度洗脱； 偏转式、反射式 和干涉型三种；
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高效分离柱
柱体为直型内部抛光的不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm,内部充满微粒固定相。柱温一 般为室温或接近室温。发展趋势是减小填料粒度和 柱径以提高柱效。
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液相色谱检测器
a. 紫外检测器(UV detector)
应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小
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正相键合色谱法
一般键合极性的有机基团，最常用的有氰基（-C N）、 氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比 键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或 其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调 节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。 一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分 配比k’值，随其极性的增加而增大，但随流动相中极性调节 剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的 极性越大，组分的保留值越大。（自行练习组分k’值大小与 其保留值关系）