干扰素-α上调肝癌细胞胸苷磷酸化酶增强氟尿嘧啶类药物敏感性的实验研究

干扰素-α上调肝癌细胞胸苷磷酸化酶增强氟尿嘧啶类药物敏感性的实验研究1肖永胜，周俭，樊嘉，赵燕，孙瑞霞，刘银坤，叶胜龙，汤钊猷复旦大学附属中山医院，上海（200032）E-mail：yshxiao@摘要：目的探讨干扰素-α (IFN-α) 对肝癌细胞SMMC-7721胸苷磷酸化酶（TP）表达水平的影响以及肝癌细胞对氟尿嘧啶类化疗药物敏感性的变化。

方法利用RT-PCR检测SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平，利用MTT法检测肝癌细胞对氟尿嘧啶类化疗药物的敏感性。

结果 IFN-α上调TP mRNA表达具有时间-剂量依赖性。

10 000 U/ml的IFN-α处理SMMC-7721细胞8 h后TP mRNA表达水平开始升高，至12 h达到峰值，此后维持较高水平至72 h。

5000 U/ml与10 000 U/ml IFN-α处理肝癌细胞24 h，TP mRNA表达水平显著升高，与未用IFN-α处理组相比，差别具有统计学意义（P<0.05）。

IFN-α能明显提高SMMC-7721细胞对5′-脱氧-5-氟尿苷（5′-dFUrd）的敏感性，在10 000U/ml IFN-α作用下，5′-dFUrd的IC50由102.1µM±18.4µM降低至34.2µM±4.1µM（P<0.05）。

而IFN-α对5-氟尿嘧啶（5-FU）的敏感性影响不大，IC50与对照组 6.3µM±1.4µM相比，10 000U/ml IFN-α作用时为5.8µM±2.0µM。

结论 IFN-α通过上调肝癌细胞SMMC-7721 TP mRNA表达水平，显著增强其对5-FU前体药物5′-dFUrd的敏感性；IFN-α上调SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平具有时间-剂量依赖性。

关键词：胸苷磷酸化酶，干扰素-α，药物疗法，癌，肝细胞肝细胞癌已经成为严重危害我国人民健康的重要疾病之一，根治性切除是目前治愈肝癌的主要手段，但根治性切除术后5年复发率却高达61.5％[1]，复发和转移是肝癌病人术后死亡的主要原因[2]。

卡培他滨能够有效治疗肝癌切除术后的肺转移，疗效依赖于转移灶中高表达胸苷磷酸化酶（Thymidine phosphorylase TP）[3]。

多种细胞因子如IL-1α、TNF-α、IFN-γ[4]、IFN-α[5,6]均能上调肿瘤细胞内TP的表达或活性。

本文拟研究干扰素-α (Interferon alpha IFN-α)对肝癌细胞SMMC-7721 TP表达水平的影响，并进一步观察IFN-α对肝癌细胞化疗敏感性的影响。

1. 材料和方法1.1 材料人肝癌细胞系SMMC-7721引自第二军医大学，用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO2的培养箱中培养和传代。

干扰素-α（IFN-α）：由罗氏公司上海分公司惠赠，商品名罗扰素，水剂，450万U/ml。

5-氟尿嘧啶（5-FU）：由上海旭东海普药物有限公司惠赠，颗粒剂，纯度为99.99%。

5′-脱氧-5-氟尿苷（5′-dFUrd）：由Hoffman Roche 公司日本分公司和瑞士总公司惠赠，商品名氟铁龙（Furtulon），粉剂，纯度为99.99%。

1.2 方法1. 不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平的影响：将对数生长期的细胞铺于6孔板，培养24 h，弃去原培养液，分别加入含IFN-α的新鲜培养液，IFN-α的浓度分别为0、10、100、1000、5000、10 000 U/ml，继续培养24 h，每个浓度2个孔。

利用半1本课题得到高等学校博士学科点专项科研基金资助课题（20030246052）和上海市教委基金资助项目（02JG05035）的资助。

定量RT-PCR 方法[7]检测细胞TP mRNA 表达水平。

重复上述实验3次。

2. IFN-α作用不同时间对SMMC-7721细胞TP mRNA 表达水平的影响：将对数生长期的细胞铺于6孔板，培养24 h ，弃去原培养液，加入含IFN-α的新鲜培养液，使各孔IFN-α浓度均为10 000 U/ml ，继续培养1/2、1、2、4、8、12、16、24、36、48、72 h ，每个时间间隔2个孔。

利用半定量RT-PCR 方法[7]检测细胞TP mRNA 表达水平。

重复上述实验3次。

3. 在IFN-α的作用下，SMMC-7721细胞对氟尿嘧啶类药物敏感性的变化：96孔培养板上每孔加入含2.0×103个细胞培养液200µl ，留2孔作空白对照，培养24 h 后，加入含不同浓度的药物的培养液，每个浓度2个孔，培养120 h ，中间更换含药物培养液一次。

利用MTT 法[7]检测在不同浓度IFN-α的作用下，氟尿嘧啶类药物IC 50的变化。

4. 统计学方法：采用SPSS 10.0统计软件进行方差分析和曲线拟和。

P<0.05有统计学意义。

2. 结 果1. IFN-α对SMMC-7721细胞TP mRNA 表达水平的影响（图1）：SMMC-7721细胞应用IFN-α处理后，TP mRNA 表达水平逐渐升高，具有剂量依赖性。

用浓度5000 U/ml 与10 000 U/ml IFN-α处理细胞，TP mRNA 表达水平显著升高，与未用IFN-α处理组相比，差别具有统计学意义（P <0.05）。

图1 不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞TP mRNA 表达水平的影响2. IFN-α作用不同时间对SMMC-7721 TP mRNA 表达水平的影响（图2）：应用浓度为10 000 U/ml 的IFN-α处理SMMC-7721细胞，应用后随时间变化细胞TP mRNA 表达水平呈上升趋势。

在应用后8 h 开始升高，至12 h 达到峰值，此后维持较高水平至72 h 。

在IFN-α作用72 h ，TP mRNA 表达水平为起始时的2倍左右。

其中第8 h ～72 h ，细胞TP mRNA 表达水平较IFN-α作用起始时TP mRNA 表达水平相比，差别具有统计学意义（P<0.05）。

图2 IFN-α作用不同时间对SMMC-7721细胞TP mRNA 表达水平的影响β1.100bp -actin991bpTP 344bp1 2 3 4 5 6 7marker, 2.IFN 0, 3.IFN 10U/ml, 4.IFN100U/ml, 5.IFN 1000U/ml, 6.IFN 5000U/ml,7.IFN 10,000U/ml500bpMarker 0 0.5 1 2 4 8 12 16 24 36 48 72h3. IFN-α对SMMC-7721细胞对氟尿嘧啶类药物敏感性的影响（表1）：不同浓度的干扰素单独应用对SMMC-7721细胞增殖作用无明显影响（结果未显示）。

应用IFN-α能明显提高SMMC-7721细胞对5′-dFUrd的敏感性。

5′-dFUrd IC50随着IFN-α浓度的增加而下降，IFN-α浓度为10 000U/ml时，细胞对5′-dFUrd的敏感性增加2倍，与未用IFN-α组及低浓度IFN-α组相比，差别均具有统计学意义(P<0.05)。

而IFN-α对5-FU的敏感性影响不大，各组差别无统计学意义。

结合IFN-α对SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平的影响，发现细胞对5′-dFUrd敏感性的增加与IFN-α上调TP mRNA呈正相关，相关系数为0.6（Pearson检验P=0.008）。

表1 不同浓度IFN-α对SMMC-7721细胞化疗敏感性的影响IC50(µM)组别IFN-α(U/ml)5-FU 5′-dFUrd102.1±18.4A 0 6.3±1.462.6±8.4*B 10 5.9±2.157.9±18.7*C 100 6.1±2.1D 1000 5.6±2.042.5±6.8*34.4±11.8**E 5000 5.8±2.334.2±4.1**F 10000 5.8±2.0*与A组相比，差别具有显著统计学意义(P<0.01)；**与A相比差别具有显著统计学意义(P<0.01)，与B、C组相比差别亦具有统计学意义(P<0.05)。

（n=3）3. 讨论5-氟尿嘧啶（5-FU）作为许多恶性肿瘤特别是消化道肿瘤（包括肝癌）的主要化疗药物已有40多年历史，但有效率仅15%左右[8]。

卡培他滨(capecitabine，商品名：希罗达)是一个新型的氟尿嘧啶前体药，具有口服后迅速吸收、在肿瘤内部优先转化为5-FU的特点，较直接静脉应用5-FU相比，具有更强的肿瘤选择性和更少、更轻的副作用。

已被美国FDA批准用于紫杉醇抵抗的乳腺癌的临床治疗[9]。

卡培他滨本身无细胞毒作用，需在体内经过序列酶解反应才能生成具有化疗作用的5-FU。

胸苷磷酸化酶（thymidine phsphorylase,TP）是其发挥作用的关键限速酶[10]。

但由于肿瘤具有异质性，不同肿瘤之间，同一肿瘤内部不同部位，TP表达水平差别都很明显[11]，如何提高TP低表达或无表达的肿瘤对氟尿嘧啶前体药物的敏感性，是进一步提高其疗效的关键。

干扰素可通过TP基因中的干扰素激活反应元件促进肿瘤细胞TP基因的转录[12]。

本研究结果亦显示，较高浓度IFN-α作用24 h能使SMMC-7721细胞TP mRNA表达水平升高3倍。

应用IFN-α后TP mRNA在8 h后即明显升高，并可在高水平持续至72 h，从而推测IFN-α除在转录水平调节TP基因的转录外，可能还具有稳定TP mRNA的作用。

TP mRNA分析表明，在其mRNA转录末端第40个核苷酸处存在富含嘧啶核苷酸的序列（92％），该序列与位于鼠VEGF mRNA的3’非翻译区具有稳定mRNA的顺式反应元件[13]具有同源性。

IFN-α可能通过影响该嘧啶核苷酸富集序列而稳定TP mRNA。

由于卡培他滨发挥作用需要多种酶的参与，体外实验无法保证全部酶的存在，因此我们选择了卡培他滨的一个中间代谢产物5′-脱氧-5-氟尿苷（5′-dFUrd）作为体外研究的对象，该物质仅需要TP一步催化反应即可生成有细胞毒性作用的5-FU。

本研究观察到，在较高浓度的IFN-α作用下，肝癌细胞TP mRNA表达水平显著升高，同时细胞对5′-dFUrd敏感性显著增加，而对5-FU的化疗敏感性影响不大。

这与许多其它的研究结果相似[14,15]，主要原因在于5′-dFUrd、卡培他滨等5-FU前体药物更具有TP依赖的肿瘤选择性。