猪附红细胞体病间接ELISA诊断试剂盒的研制及初步应用
猪附红细胞体病实验室elisa法试剂盒检测血清抗体操作规程
猪附红细胞体病实验室elisa法试剂盒检测血清抗体操作规程以下是猪附红细胞体病(PRRS)实验室ELISA法试剂盒检测血清抗体的操作规程:1. 准备工作:- 所有实验操作必须在洁净的实验室条件下进行。
- 所有试剂和设备要保持干净和无污染。
- 所有操作者必须戴合适的个人防护装备,如实验手套和口罩。
2. 样品准备:- 需要测试的血清抗体必须首先经过离心,以去除任何凝块或杂质。
- 将离心后的血清抗体转移到新的离心管中,并标记好每个样品的标识符。
3. 负对照和阳性对照的准备:- 准备适量的负对照和阳性对照血清。
负对照血清应来自未感染PRRS病毒的猪,阳性对照血清应来自已感染PRRS病毒的猪。
- 将负对照和阳性对照血清转移到新的离心管中,并标记好每个样品的标识符。
4. ELISA板的准备:- 取出所需数量的试剂盒ELISA板,并将其标记以便区分每个样品。
- 将所需数量的ELISA板样品孔加装样品:每个孔加入100μl样品(血清、负对照和阳性对照),按照标识符进行分配。
- 在每个样品孔中加入相同数量的稀释缓冲液,使总体积达到200μl。
5. 孵化过程:- 用塑料封膜密封ELISA板,并在37℃孵化器中孵育1小时。
- 孵化结束后,小心地移除塑料封膜。
6. 洗涤过程:- 将ELISA板排空,但不要使吸附于底部的红细胞沉淀。
- 向每个孔中加入300μl洗涤缓冲液,轻轻搅拌板以混合液体。
- 将液体完全排出,并重复此洗涤过程3次。
7. 底物加入:- 向每个孔中加入100μl表面过氧化物酶底物溶液。
- 在室温下保护孔,避免阳光直接照射。
- 在孔中形成蓝色反应后,开始计时。
8. 反应停止:- 在20分钟的反应时间后,向每个孔中加入100μl停止液。
- 用洗涤缓冲液冲洗每个孔1-2次,以确保停止液完全混合。
9. 光密度读取:- 使用ELISA板读取器读取每个孔的吸光度值(OD)。
- 将各样品的OD值与阳性对照的OD值进行比较,以确定血清抗体的存在与否。
猪繁殖与呼吸综合征病毒间接ELISA检测方法的建立
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive andrespiratory syndrome,PRRS)又名“猪蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一种主要以妊娠母猪严重繁殖障碍以及仔猪呼吸道症状及高死亡率为特征的高度接触性传染病[1]。
PRRS于1987年在美国首次发现,1991年荷兰中央兽医研究所首次分离得到病毒,我国在1996年首次报道[2]。
在我国,猪群感染PRRSV后出现混合感染、继发感染的现象非常严重,这与PRRSV的感染机制有关。
PRRSV感染机体后以机体免疫系统细胞为靶细胞,从而抑制免疫系统功能,导致其他病原极易乘虚而入。
无论感染了传统PRRSV 还是高致病性PRRSV,被感染的猪均会表现出猪呼吸障碍等多种症状,临床上多与副猪嗜血杆菌、大肠杆菌、链球菌、支原体等有关。
试验证明,高致病性PRRSV感染可以加剧副猪嗜血杆菌感染,引发严重的临床表现[3]。
由于PRRSV可在宿主体内的巨噬细胞中进行复制,导致无症状的持续感染。
该病毒通过鼻黏膜和上呼吸道上皮细胞进入宿主体内,并在鼻黏膜、呼吸系统的巨噬细胞以及淋巴组织中进行原发性复制。
随后通过血液循环到达继发性复制部位,如大脑、心、肺、胸腺、脾、肝、淋巴结、肾、肾上腺、小肠、睾丸等。
病毒可进入易感妊娠母猪体内,跨越胎盘感染胎儿。
PRRS血清学诊断方法是应用最广泛的动物疫病诊断方法。
关于PRRSV的血清学诊断,国内外己建立了多种检测PRRSV抗体的方法,主要有免疫过氧化物酶单层实验(immuno peroxidase monolayer assay,IPMA)[4]、间接免疫荧光检测方法(indirect immunoin fluscent assay,IFA)[5]、血清中和试验(Serum Neutralization,SN)[6]以及酶联免疫吸附测定试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。
猪附红细胞体病实验室elisa法试剂盒检测血清抗体操作规程
猪附红细胞体病实验室elisa法试剂盒检测血清抗体操作规程猪附红细胞体病是一种常见的猪源性疾病,该病由猪附红细胞体病病毒(PRRSV)引起。
为了及时、准确地诊断和监测该病,我们可以采用ELISA法试剂盒来检测猪血清中的抗体水平。
下面是一份关于ELISA法试剂盒检测猪血清抗体的操作规程,希望能够为您提供指导意义:一、实验前的准备工作:1. 准备工作台,消毒所需仪器和试剂。
2. 恢复试剂:将试剂从-20℃的冷冻储存环境中取出,置于室温下恢复至室温。
3. 样品标签准备:使用清洁的试管或标签,准备标签,并在上面写上标本编号和日期。
4. 样品溶液准备:根据试剂盒说明书准确配制稀释液,并确保其清洁和无杂质。
5. 阴、阳性对照品准备:根据试剂盒说明书选择合适的阳性和阴性对照品,并准确配制稀释液。
二、操作步骤:1. 样品准备:将猪血清标本置于离心管中,离心10分钟(1000×g,4℃),收集上清液。
2. 样品稀释:将收集的上清液与稀释液按比例混合,均匀摇混,制备所需的稀释样品。
3. 阳性、阴性对照品处理:按照试剂盒说明书中的方法,将阳性和阴性对照品与稀释液按比例混合,制备所需的稀释样品。
4. 试剂处理:按照试剂盒说明书中的方法,向每个微孔中加入试剂,并按照要求的顺序摇晃或轻轻拍打微孔板,使试剂充分混合。
5. 样品加入:将稀释后的样品加入到微孔板中,每个孔约加入100 μl,确保每个孔都有样品。
6. 孔板封膜:使用盖膜密封微孔板,确保不留有气泡。
7. 孵育:将密封好的微孔板放入恒温孵育箱中,按照试剂盒说明书中的孵育时间和温度进行孵育。
8. 洗涤:将微孔板取出,倒掉上清液,用稀释液洗涤每个孔,重复3次,每次倒掉洗液。
9. 显色:将染色液加入到每个孔中,孵育一定时间后,观察颜色反应。
10. 停止反应:将停止液加入到每个孔中,停止反应。
11. 读板:使用ELISA阅读器读取每个孔的吸光度值,在波长为450nm处记录吸光度读数。
猪瘟间接血凝IHA诊断试剂制备及应用
试验研究猪瘟间接血凝(IHA)诊断试剂制备及应用解天珍,高华峰,姚 俊,单于乃纯(云南省畜牧兽医科学研究所,云南 昆明 650224)摘 要:猪瘟病毒细胞培养物经病毒释放、浓缩及系列纯化,致敏醛化处理绵羊红细胞不发生自凝,排除非特异抗原影响后,制备红细胞抗原。
诊断液不与其它传染病阳性血清发生交叉凝集,保存24个月效价大于1B 2048。
不同批次检测同一血清样品结果一致。
保存在4~6e 24个月以上效价不变。
该诊断液与标准诊断液同一检测不同滴度猪血清,符合率达91%。
检测四个地州市县2560份猪血清,血清保护率为6518%。
关键词:猪瘟;免疫抗体;IHA 诊断中图分类号:S852165+1 文献标识码:A 文章编号:1005-1341(2005)01-0001-02猪瘟病毒是黄病毒科瘟病毒属的成员,猪瘟病毒引起的猪瘟是目前对我国养猪业危害较为严重的一种烈性传染病[1,2]。
由于猪瘟兔化弱毒疫苗的广泛使用,其危害性已逐步降低,临床上温和型或非典型猪瘟增多[3,4]。
因而在猪场对该病进行血清学监测有助于控制猪瘟的发生,从而减轻经济损失。
猪瘟间接血凝试验简单易行,是当前较为常用的一种检测方法。
为此,本试验制备了猪瘟间接血凝抗原,以满足临床对该病诊断、监测的需要。
1 试验材料111 猪瘟细胞培养毒 牛睾丸细胞培养物,病毒兔体反应滴度为1B 50000。
112 阳性血清 猪瘟、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)、猪气喘病(SEP)、猪布氏杆菌病(SAT)及其它病阳性血清均由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室制备。
猪瘟阳性血清效价大于1B 2048。
113 猪瘟血清样品采自昆明、曲靖、玉溪、丽江。
2 试验方法211 猪瘟病毒抗原制备 猪瘟病毒培养物经反复冻融及超声波粉碎释放病毒,低速离心3000r/min 30min 弃细胞沉淀,病毒上清液用PEG 透析浓缩50倍经10000r/min 1h 离心弃沉淀物,取上清液用40000r/min 4h 离心,沉淀物经0101mol/L p H 712PB S 悬浮后滴入蔗糖PBS 柱上4e 超速离心,沉淀病毒用少许0101mol/L p H 712PBS 液悬浮,最终提纯浓缩500倍。
猪伪狂犬病病毒间接酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒的研制及其应用-论文
危 害我 国养猪业 的重 要疾病 之一 。该病的危害在于 病毒侵入猪体 后,可潜伏 于三叉神经节或荐神经节 造成潜伏感染 , 使病猪 终身带毒并周期性 向外排毒 , 给疾病 的防治带来 很大 困难『 l 1 。P R V属 疱疹病 毒科 ( H e r p e s v i r i d a e ) 0 【 一 疱疹 病毒 亚科 ( A l p h a — h e r p e s v 一 d a e ) 猪疱疹病毒 I 型( S u i d h e r p e s v i us r -I, S H V —I ) 圆 。 S H V —I 基 因大约编码 5 O种结构蛋 白, 有l 1 种为糖 蛋 白, 其中 g D是 P R V的主要结构 蛋 白, 它 不仅诱导 体液免疫 , 而 且诱 导细胞免疫 , 同时是病毒粒子表面 的病毒感染细胞 的主 要分子,在病 毒吸附和侵入宿 主细胞过程 中发挥 重要作用 ,为病 毒复制 的必需基 因, 是 一种 重要的中和抗原, 也是保护性抗体 的主要 目标 , 能诱导较 好 的保护 反应 , 抵抗 P R V强毒株攻 击[ 3 - 5 1 , 因此 , g D被作 为P R V特 异性抗 原研 究 的首选 蛋 白。试验 于 2 0 1 0年 1 1 月至 2 0 1 1 . 年 1 1 月在 山东 滨 州预 防兽医学与动物生物技术重 点开放 实验室进 行 。研 究对 g D基 因进行 了截短表达 , 以表达 的重组 蛋 白为包被 抗原 ,优化 酶联免疫 吸附试验 ( E L I S A ) 反应条件 ,建立 了可检测 P R 血 清 抗 体 的 间 接 E L I S A诊 断方法, 组装 了试剂盒 , 并对 实地采集 的猪 血清进 行了检 测 。
3 , P 2 : 5 一 A, I T r C !! C CC AGG AGG C GA TA C C C一
检测猪瘟抗体间接ELISA方法的建立及应用
收稿日期:2007Ο05Ο253基金项目:湖北省科技攻关项目(2004AA202B01)33通讯作者。
Tel :86-27-87282608;Fax :86-27-87282608;Email :hzauvet @作者简介:何雁南(19812),女(汉族),湖北恩施人,博士研究生,研究方向为病毒分子生物学。
E 2mail :heyannanyaya @检测猪瘟抗体间接EL ISA 方法的建立及应用3何雁南 栾后利 董晓辉 曹 毅 姚清侠 刘正飞 陈焕春33(华中农业大学动物医学院传染病学研究室,武汉430070)摘要 用猪肾传代细胞P K 215增殖猪瘟病毒(CSFV )兔化弱毒苗株(HCL V ),病毒培养上清液经硫酸铵沉淀、浓缩后作为包被抗原。
经各种条件的优化,建立了检测猪瘟血清抗体的间接EL ISA 。
所建立的间接EL ISA 抗原最佳包被浓度分22.28mg/L ,血清最佳稀释度为1:40,与猪细小病毒、O 型口蹄疫、猪衣原体阳性血清呈阴性反应,与HCV 标准阳性血清、免疫猪血清和临床发病猪血清呈明显的阳性反应;与标准阴性血清和临床未感染CSFV 的猪血清呈阴性反应;用HI 和本EL ISA 方法检测94个猪厂送检血清1455份。
其中血清稀释液中不含PEG6000的914份送检血清阳性率为83.7%,与HI 符合率为96.6%,HI 阳性率略高为85.7%;血清稀释液中含2%PEG6000的541份送检血清阳性率为88.72%,与HI 符合率为97.3%,HI 阳性率为88.17%。
结果表明本试验所建立的间接EL ISA 具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点,可用于临床猪瘟血清抗体的定性和定量检测。
关键词 猪瘟;EL ISA ;PEG 2EL ISA ;间接血凝抑制试验 猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV )引起的一种猪的高度接触性传染病,病死率高,传播迅速,蔓延地区广,对养猪业构成了极大威胁。
猪附红细胞体pcr检测方法的建立和初步应用
猪附红细胞体pcr检测方法的建立和初步应用文章标题:猪附红细胞体PCR检测方法的建立与初步应用在农业领域,猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用备受关注。
本文将从建立方法的过程、应用范围和未来发展等方面进行深入探讨,帮助读者全面了解这一重要的技术。
一、建立方法的过程1.1 猪附红细胞体PCR检测方法的原理猪附红细胞体PCR检测方法是一种基于多重PCR的检测技术,主要用于检测猪体内的特定病原体。
1.2 关键步骤和技术要点建立这一检测方法需要充分理解猪体内病原体的生物学特征,同时需要在PCR技术上进行优化,确保灵敏度和特异性。
1.3 方法的验证和实验数据经过大量实验和数据对比,可以确定该方法在猪体内病原体检测方面具有可靠性和准确性。
二、初步应用2.1 在疾病防控中的应用猪附红细胞体PCR检测方法可以用于疾病的早期诊断和监测,为疾病的控制和防治提供重要支持。
2.2 在饲养管理中的作用通过该方法的应用,可以及时检测病原体,避免疾病的传播,保障猪的生长和健康。
2.3 对农业生产的意义猪附红细胞体PCR检测方法的建立和应用,对农业生产具有重要意义,可以提高疾病检测的精准度,保障畜禽健康生产。
三、未来展望3.1 技术的改进和完善在未来,需要不断改进和完善猪附红细胞体PCR检测方法,提高其在现实应用中的效率和稳定性。
3.2 拓展应用领域除了用于猪体内病原体的检测,该技术还可以在其他动物的病原体检测中得到拓展,具有广阔的应用前景。
3.3 国内外研究现状与竞争优势通过了解国内外研究现状,可以为我们提供更多的启发和借鉴,提高我们的研究水平和竞争力。
个人观点和总结通过对猪附红细胞体PCR检测方法的建立和初步应用的深入探讨,我认为这一技术具有巨大的潜力和应用前景。
在未来,随着技术的不断改进和完善,相信它将在农业生产和疾病防控领域发挥更大的作用。
在撰写本文的过程中,我深刻理解了猪附红细胞体PCR检测方法的重要性和价值所在。
抗猪附红细胞体药物体内筛选模型的建立与应用
抗猪附红细胞体药物体内筛选模型的建立与应用李辉;刘聚祥;刘静;王建平;李宏娟;许亚改【摘要】为实现抗猪附红细胞体药物的高通量筛选,拟建立小鼠最优感染模型及应用其进行药物敏感性研究.采用三因素三水平的正交试验法,通过对感染率、菌血症峰期及临床症状考察,确定最佳感染方法、感染途径和接种剂量.而后应用感染模型对土霉素、四环素、贝尼尔、青蒿素、咪唑苯脲等10种抗生素和抗原虫药进行药物敏感性测试.方差分析结果显示,以0.1 mL剂量尾静脉接种猪EH提纯液,能够使处于免疫抑制状态的昆明小鼠在3 d时达到菌血症峰期.药物敏感性测试反映贝尼尔、咪唑苯脲和青蒿素对猪附红细胞体作用最强.因此,用此模型可进行体内抗猪附红细胞体药物的高通量筛选.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2010(025)00z【总页数】5页(P290-294)【关键词】猪附红细胞体;小鼠模型;药物筛选;药效评价【作者】李辉;刘聚祥;刘静;王建平;李宏娟;许亚改【作者单位】河北农业大学,动物科技学院,河北,保定,071001;河北农业大学,动物科技学院,河北,保定,071001;河北农业大学,动物科技学院,河北,保定,071001;河北农业大学,动物科技学院,河北,保定,071001;秦皇岛市畜牧产业发展协会,河北,秦皇岛,066300;河北农业大学,动物科技学院,河北,保定,071001【正文语种】中文【中图分类】S852.62附红细胞体病(Eperythrozoonosis)是由专性血液寄生的附红细胞体(Eperythrozoon,EH)寄生于红细胞表面、血浆及骨髓中而引起的以溶血性贫血、发热、黄疸等为主要症状的人兽共患病[1-3]。
1928年Schilling等首次在啮齿类动物中发现附红体样小体,当时将其命名为球状血红体,随后国内外学者陆续报道了绵羊附红体、牛温氏附红体和猪附红体、人附红体等[4,5]。
附红细胞体病的出现在我国已经有20多年的历史,但近年来猪附红细胞体病有趋于严重的态势,很多猪场因此也损失惨重。
IHA法和间接ELISA法检测猪附红细胞体抗体结果对比分析
IHA法和间接ELISA法检测猪附红细胞体抗体结果对比分析俞鹏;朱珍珍;贾杏林【摘要】为了寻求适用于基层实验室对猪附红细胞体抗体的检测方法,文章试验用间接血凝试验(IHA)和间接ELISA两种方法分别检测了402份临床送检猪血清,并对这两种方法的敏感性和符合率进行比较研究.结果表明,IHA和ELISA法结果符合率为80.1%,且ELISA方法比IHA敏感性更高,更适合批量检测和群体普查.【期刊名称】《湖南畜牧兽医》【年(卷),期】2016(000)002【总页数】3页(P35-37)【关键词】猪附红细胞体;抗体;间接ELISA;IHA;对比【作者】俞鹏;朱珍珍;贾杏林【作者单位】湖南省常德市畜牧兽医水产局,湖南常德415400;湖南省常德津市市畜牧兽医水产局,湖南常德415400;湖南农业大学动物医学院,湖南长沙410128【正文语种】中文【中图分类】S854.43猪附红细胞体病在世界范围内对所有日龄猪均有危害,常与猪瘟、猪肺疫、猪链球菌病、猪流感等疾病混合感染,病愈后的猪可终生携带病原[1-2]。
该病的流行不但对畜牧业造成重大经济损失,而且对人类健康构成威胁,因此,急需一种对猪附红细胞体病准确、快速、简便的检测方法。
一直以来,由于尚无对附红细胞体成熟的体外培养方法,难以获取大量原始抗原,阻碍了血清学检测附红细胞体的发展以及快速诊断试剂盒的研制[3]。
湖南农业大学动物医学院李晓云博士[4]改进了猪附红细胞体的培养体系,做到除首次接种外不添加任何红细胞且连续培养达280d以上,染虫率维持近100%。
本实验全菌病原均由李晓云老师提供,为实验的顺利完成提供了重要保障,同时也证明了附红细胞体培养的可行性。
目前国内对猪附红细胞体病的检疫常采用传统的染色镜检法,该法敏感度较低。
血清学方法最适合群体检测,酶联免疫吸附试验(ELISA)和IHA是临床上较常用的一种血清学检测方法[5]。
为了寻求适用于基层实验室对猪附红细胞体病抗体检测方法,将血清学检测方法广泛的应用于临床诊断,本文将进一步探讨两种试验方法的敏感性及特异性。
猪附红细胞体PCR诊断试剂盒的研制及应用的开题报告
猪附红细胞体PCR诊断试剂盒的研制及应用的开题报告一、研究背景和意义非洲猪瘟(ASF)是一种极具传染性的、致死性很高的猪类疾病,已经被认为是全球最为致命的猪病之一。
随着全球经济的发展和国际贸易的增加,ASF也越来越受到人们的关注。
当前,非洲猪瘟在我国已经出现多次,给我国畜牧业生产、贸易以及社会经济带来了巨大的影响。
猪附红细胞体PCR诊断试剂盒在非洲猪瘟的检测中发挥着重要的作用。
病毒基因组中的附红细胞体基因具有高度保守性和特异性,因此是猪附红细胞体PCR检测的重要靶基因。
通过PCR方法检测附红细胞体基因可以快速、准确地诊断非洲猪瘟,为猪类疾病的防控和猪肉产品的安全提供有力的支持。
二、研究内容和方案本研究旨在开发一种快速、准确、可靠的猪附红细胞体PCR诊断试剂盒,用于非洲猪瘟的检测和诊断。
具体包括以下研究内容:1. 附红细胞体基因序列分析和选择:通过对已公布的多个非洲猪瘟病毒基因组进行比对和分析,确定最适合的附红细胞体基因序列。
2. 试剂盒设计与优化:根据附红细胞体基因序列设计引物和探针,优化PCR反应体系,确定最佳的扩增参数。
3. 试剂盒的评价:对PCR试剂盒进行体外和体内评价,包括专一性、敏感性、特异性、重复性等指标。
在实验室内进行试剂盒的验证,使用各种来自不同来源的非洲猪瘟样本进行检测。
4. 试剂盒的应用:将PCR试剂盒应用于实际样本中进行试验,并比对其它已有的非洲猪瘟诊断方法,如酶联免疫吸附测定(ELISA)和病毒分离等方法的检测结果,验证试剂盒的诊断灵敏度和特异性。
三、预期结果预计研究出一套可靠、快速、简便的猪附红细胞体PCR诊断试剂盒,具备以下特点:1. 高度特异性和敏感性:该试剂盒对非洲猪瘟的诊断准确率高,能够快速、准确的检测出非洲猪瘟的存在。
2. 快速简便:使用简单,操作容易,样品处理简单,反应时间短。
3. 低成本:合理利用试剂盒,低成本的快速检测非洲猪瘟。
四、研究进度计划和预算估算研究进度计划:1. 第一年:样品采集、附红细胞体基因序列分析和选择、试剂盒设计与优化。
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收稿日期:2009 08 08基金项目:公益性行业(农业)科研专项资助项目(200903036 13) 作者简介:张守发(1954 ),男,教授。
猪附红细胞体病间接ELISA 诊断试剂盒的研制及初步应用张守发,齐 楷,贾立军,梁晚枫,丛艳昭 (延边大学农学院,吉林延吉133002)摘要:以纯化的猪附红细胞体特异性抗原为包被抗原,在建立猪附红细胞体病间接EL ISA 检测方法的基础上对各反应参数进行了优化,并初步组装成试剂盒。
组装的试剂盒抗原最佳包被质量浓度为30mg /L ,被检血清稀释度为1 100,酶标二抗的最适工作滴度为1 4000,底物T M B 最适反应条件为室温15min;检测血清的判定标准为D 450值 0.13定为阳性反应,D 450值!0.11定为阴性反应,0.11~0.13定为疑似反应;该试剂盒不与猪大肠杆菌病、猪弓形虫病及猪瘟等阳性血清发生交叉反应,具有较好的特异性;在不同时间对阴阳性样品重复检测8次,阴阳性血清的D 450值变异系数均未超过10%,说明该试剂盒具有良好的重复性;通过对组装试剂盒中各组分的稳定性和保存时间的测定结果证实,该试剂盒的保质期暂定为6个月;应用保存6个月的试剂盒通过对吉林省延边地区的60份猪血清样本检测,并与间接EL ISA 比较,其阳性符合率达100%,说明该试剂盒具有较好的稳定性。
关键词:猪附红细胞体;间接EL ISA;试剂盒中图分类号:S852.61;R535 文献标识码:A 文章编号:1005 4545(2010)12 1642 04Development and validation of indirect ELISA test kit for detecting eperythrozoo nosisZH ANG Shou fa,Q I Kai,JIA Li jun,LIANG Wan feng CONG Yan zhao (Colleg e of A gr iculture,Yanbian Univ ersity ,Yanj i,J ilin 133002,China)Abstract :In this research,E.s uis antig en which w as purified and protected as envelope antig en w as made.T he opti mal reactio n co nditio ns w ere determined and the kit was assembled initially.T he result sho wed that the optimal con centration of antig en w as 30mg /L;the o pt imal co ncentration o f ser um dilution was 1 100;the optimal co nditio n o f HR P labeled rabbit anti sw ine Ig G w as 1 4000;the optimal reactio n co ndition of T M B was r oom tem per at ur e for 15m inutes.D 450 0.13was po sitiv e,D 450!0.11was neg ativ e,and 0.11 0.13was suspected.T he method has no cr oss reactio n w ith sw ine E.coli ,swine fever and sw ine to xo plasmo sis ser um.Co efficient of var iatio n of negative and po sitive ser um at D 450w as no t ex ceed 10%after det ecting for differ ent 8t imes.T his sho wed that the kit had a go od repeat abilit y.T he kit s could be kept fo r 6months by the determinatio n o f stability.60samples of ser um in Yanbian area wer e detected by the kit which had sav ed fo r 6mo nt pared with indirect EL ISA ,the result sho wed the the posit ive coincidence w as 100%.T his study pro vides a new effect ive w ay fo r diagnosis o f eper ythro zo onosis.Key words :E p ery thr oz oon suis ;indir ect EL ISA ;kit附红细胞体病(Eperythrozo ono sis)是附红细胞体(Ep ery thr oz oon )寄生于红细胞表面、血浆及骨髓中以红细胞压积降低、血红蛋白浓度下降、白细胞增多、贫血、黄疸、发热为主要临床特征的人兽共患病[1 2]。
该病已在南非、美国、法国、荷兰等近30个国家和地区发现,我国继江苏省首先发现本病后,浙江、上海、吉林等近30个省、市、自治区相继发生了本病。
该病是一个严重的公共卫生问题,近年来随着人类附红细胞体临床病例的增加,已给畜牧业生产及人类的身心健康带来严重威胁,越来越引起国内外学者的广泛关注。
目前,国内外针对该病已建立多种分子生物学及血清学诊断方法,但至今仍无商品化的试剂盒应用于该病的诊断[3 6]。
间接ELISA 具有特异性强,敏感性高,重复性好等优点。
因此,研制快速有效、操作简便的间接ELISA 诊断试剂盒对大型养猪场和基层兽医单位诊断猪附红细胞体病显得尤为重要。
1 材料与方法1.1 材料 H RP 标记兔抗猪IgG 购于北京博奥森生物技术有限公司;T MB 购于北京华美转导科技有限公司;96孔可拆酶标板购于凯基生物科技发展有限公司;猪附红细胞体病阳性血清、阴性血清、感染附红细胞体病猪及猪大肠杆菌、猪弓形虫、猪瘟等阳性血清由延边大学农学院预防兽医学实验室提供; 60份猪血清样本采自延边地区某养猪场。
1.2 间接ELISA方法的优化1.2.1 酶标板均一性测定 从不同酶标板中随机取出3个,用4000倍稀释的酶标抗体直接包被酶标板,100 L/孔,4∀过夜。
充分洗涤后,加入封闭液100 L/孔,37∀2h后洗涤,再加入TM B底物100 L/孔显色,测定D450值,计算各孔间的标准偏差和变异系数,以检测不同酶标板的均一性。
1.2.2 包被抗原的制备 按张守发等[7]方法进行猪附红细胞体的体外培养,按贾立军等[8]方法提纯猪附红细胞体特异性抗原,以此作为间接ELISA的包被抗原。
1.2.3 包被抗原最适稀释度确定 按贾立军等[9]方法,将特异性抗原按120,60,30,15,7.5mg/L稀释包被酶标板,进行间接ELISA测定,重复2次,并设阴性对照和空白对照,测D450值,以P/N值最高的为抗原最适包被质量浓度。
1.2.4 血清最适稀释度确定 按照抗原最佳包被质量浓度包被酶标板,将血清进行倍比稀释,做2个重复并设阴性对照,进行间接ELISA测定。
测D450值,以P/N值最高的为血清最适稀释度。
1.2.5 酶标二抗最适稀释度确定 在抗原和血清最适稀释度确定的情况下,将酶标抗体在推荐使用浓度基础上做4个稀释度,即1 2000,1 3000, 1 4000,1 5000,做2个重复并设阴性对照和空白对照,对结果进行分析选择最适稀释度。
1.2.6 间接ELISA判定标准的确定 随机取20份猪附红细胞体病阴性血清,用已确定的最适反应条件进行间接ELISA试验,并对每份血清做2个重复,然后计算这些血清D450值的平均值(x#)和标准差(s)。
阴阳性临界值=猪附红细胞体阴性血清平均D450值(x#)+3s。
1.3 试剂盒总体性能评价1.3.1 特异性试验 阻断试验:将猪附红细胞体阳性血清、阴性血清倍比稀释后,加入适量的抗原液,于37∀反应2h,然后做间接ELISA测定,同时以未做任何处理的阳性血清作对照。
交叉性试验:用猪附红细胞体最适浓度包被酶标板,以猪附红细胞体阳性血清作对照,与猪大肠杆菌、猪弓形虫、猪瘟等阳性血清,按照所优化的间接ELISA条件进行检测,重复2次。
1.3.2 重复性试验 用3批试剂盒对2份猪附红细胞体阳性血清(分别为已知的强阳性和中阳性血清)和1份阴性血清在不同时间重复测定8次,按照已优化的间接ELISA方法进行测定,计算每份血清样品的批内变异系数及批间平均值和变异系数。
1.4 试剂盒各组分的保存期试验1.4.1 包被酶标板的处理及保存 将猪附红细胞体提纯抗原包被酶标板,37∀反应2h,用PBST洗涤,重复3次,3%脱脂乳封闭2h后,分成2组,分别置于4∀和室温条件下保存。
用标准阳性血清定期检测D450值,记录每次检测的平均D450值,以变异系数小的为最佳条件。
1.4.2 洗液稳定性及保存试验 配制1∃PBST、5∃PBST和20∃PBST,高压灭菌后贮存于4∀和室温,于不同时间取出稀释成工作液浓度进行间接ELISA检测。
1.4.3 标准阳性、阴性血清的稳定性及保存试验 将标准阳性血清和阴性血清,分别按最适工作浓度稀释,分别置于4∀和室温条件下保存,定期测定D450值。
1.4.4 酶标抗体保存试验 将酶标抗体稀释成工作液浓度,置4∀和室温下保存,在不同时间取出与新配制的酶标抗体作比较试验,测定保存期。
1.4.5 底物保存试验 将底物A液和B液,置棕色瓶中4∀避光保存,定期按优化的间接ELISA方法进行检测,测定D450值。
1.5 试剂盒的保存期测定 将组装好的试剂盒(抗原包被板1块,H RP兔抗猪Ig G1瓶,阳性对照血清1瓶,阴性对照血清1瓶,样品稀释液2瓶,洗涤液2瓶,TM B底物1支,底物A液1瓶,底物B液1瓶,使用说明书1份)分别置于4∀、室温及-20∀条件下,测定试剂盒的保存期。
1.6 试剂盒的初步应用 用组装好最佳保存期的试剂盒,对随机选取的吉林省延边地区60份猪血清样品进行检测,同时进行间接ELISA检测。
2 结果2.1 酶标板均一性测定 检测的酶标板经统计学分析,各孔D450值的变异系数为5.8%,小于10%,说明此种酶标板的各孔均一性良好,能够满足ELISA试验的要求。