western blot步骤
western blot实验流程(自己整理)
Western Blot实验步骤1.制胶2.细胞蛋白抽提步骤1.提前预冷离心机，溶解lysis buffer；2.将细胞沉淀置于冰上；1ml PBS重悬，4℃离心5min，（除去样中微量血清）；3.每107cells加裂解工作液100ul，轻轻重悬细胞沉淀；4.置冰上10min，其间振荡2-3次；5.13000rpm离心10min，4℃；6.将上清转到小离心管中；7.取出1ul，用于Bradford测定蛋白浓度（ug/ul）=（样本OD值的平均值-对照OD值平均值）*斜率100℃，5min；提前预热。
中间打开盖子1~2次。
6.上样电泳（100V，90min）向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳液浸没凝胶底部。
玻璃板内侧液面高于外侧。
然后开始上样，保证每孔总蛋白量在30-50ug,总上样量小于30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。
上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。
通常在不连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议90-110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。
电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约2-3 小时。
电泳时间根据具体情况定。
7.转膜（250mA，1h 30min）转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板湿式电转膜1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。
按“三明治”模式，打开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上，最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电转印夹，注意NC 膜与胶，NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。
2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（-20℃），确保NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
WB实验步骤
Western blot 实验步骤及注意事项1.细胞蛋白提取1)25ml培养瓶弃干净培养基，可倒置于吸水纸或正立使液流至瓶底，用枪头吸净；再用预冷的PBS清洗3次，枪头吸净。
2)配制细胞裂解液RIPA:PMSF=100:1（PMSF使用浓度为1mM，由17.4mg PMSF粉末和1ml异丙醇配制），每培养瓶加200μl细胞裂解液。
于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动。
3)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5ml 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）4)于4℃下 12000rpm 离心 15min。
（提前开离心机预冷）5)将离心后的上清分装转移至0.5min 的离心管中放于－80℃保存。
6)蛋白变性：蛋白上清与5x SDS蛋白上样缓冲液按4:1混合（即每100μl蛋白中加25μl缓冲液），置于100℃水浴箱中水浴5min使之充分变性，置于－20℃保存。
2.制胶与上样1)清洗玻璃板：扣紧玻璃板用洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水超纯水冲洗干净后立在筐里晾干。
a 测漏实验（那个玻璃板装好，再整体装在板子上）2)灌胶与上样：（从一侧加入胶液9混匀，匀速加入）①10% SDS--- SDS 10g+水100ml （将10g SDS加到90ml水中,加热溶解，然后定容至100ml，室温保存;常温放置若出现沉淀，可放37℃水浴箱中温浴）②10%过硫酸铵（AP）---过硫酸铵 0.1g+超纯水10ml (溶解后，4℃保存，保存时间为1w)③根据分离胶及浓缩胶表的浓度制胶，分离胶灌胶后用无水乙醇或水压胶，灌浓缩胶后马上放梳子。
（胶一定要平，不留气泡）④配制电泳液：1L纯水+3.03g Tris+18.77 Glycine+1g SDS，溶解后室温保存。
⑤将玻璃板放入电泳槽中（小玻璃板向内，大玻璃板向外）。
加入足够电泳液，最少没过小玻璃板，两手捏住梳子两边轻轻拔出。
Western Blot步骤
Western Blot步骤1、清洗，安装玻璃板，配胶（若冬天做实验，首先开水浴锅，将有结晶的SDS放入水浴锅中）首先将10%AP配好（0.1gAP+1ml纯水）最后加AP。
（每加一步均看管中液体总量与所加量是否一致）试剂的配置如下表：上层Gel Buffer 0.5M Tris-HCL,PH6.8下层Gel Buffer 1.5M Tris-HCL,PH8.82、制胶（若冬天需要在板底部包一层保鲜膜），先加入第一枪后看看是否漏胶，若不漏胶则可继续加，下层胶加至绿线下约0.5cm处（保证正丁醇压胶后，胶能再与缺口同平），管中剩下一些胶，以掌握凝胶时间。
加正丁醇，最后一枪正丁醇由左向右拖一下。
（冬天放在水浴锅中凝胶）。
凝胶后多放置一会儿，使胶稳定，将正丁醇冲洗干净，用滤纸将残余水吸干，不可碰到胶面，之后在通风处中风干一会儿，加上层压缩胶，要带水加胶，不可弄出气泡。
加满后插入梳子，若为无牙的梳子，要向左顶头，保证只坏一个孔，梳子分1.0与1.5mm的（插完梳子后，再补上几枪胶，待胶凝固）。
3、电泳液配置（两块胶500ml,四块1000ml)Tris-Base 1.51g Tris-Base 3.03g甘氨酸7.2g 500ml 甘氨酸14.4g 1000mlSDS 0.5g SDS 1.0g安好电泳槽后，先倒入电泳液看漏不漏，不漏则倒入电泳液。
4、加样，不要使蛋白溢出。
5、电泳：先60V，待Marker跑散（1小时）后改为90V.根据目的蛋白大小定电泳时间。
6、转移液配置Tris-Base 5.52g Tris-Base 2.76g甘氨酸 2.93g 甘氨酸 1.465g甲醇200ml 1000ml 甲醇100ml 500ml 10%SDS 3.75ml 10%SDS 1.875ml7、转膜准备：5*8cm膜, 在电泳液泡1-3min,之后连同胶在转移液中泡30min。
8、转膜：每附一层要赶气泡，海绵和膜可来回滚动赶气泡。
western-blot步骤
western-blot实验流程：一、裂解细胞：1、收集细胞。
1000rpm,5min.弃上清，加1ml PBS,混匀，移至EP管。
2、4℃，1000rpm,5min。
弃上清，加1ml PBS，4℃，1000rpm,5min再洗一次。
3、配制裂解液（见附录一）：WB buffer 500μlNa3VO4 5μl配方一：Na4P2O7 5μlPMSF 5μlCocktail 5μl1×107/ml裂解液，冰上孵育15min（每隔3~5分钟混匀一次），13000rpm(或16000rpm)，4℃，离心10min.分装上清液（裂解蛋白），－20℃保存。
（一般另取5μl，作蛋白定量用）配方二：RIPA配方三：Nuc Buster TM protein extraction Kit二、蛋白定量（BCA法，Bio-Rad）：1、工作液的准备每ml A试剂中加入20ul的S试剂（此工作液在1周之内稳定，但在配制1天后会形成沉淀。
若有沉淀形成，加热并旋涡混匀使沉淀溶解，勿用Tip吸取沉淀）若样品中不含去垢剂，此步骤可省略，直接使用试剂A。
2、将蛋白标准液稀释，浓度从0.2mg/ml至1.5mg/ml。
稀释液与样品的溶解液相同。
3、待测蛋白做相应的稀释。
（一般稀释2.5或5倍）4、每孔加入5ul标准蛋白溶液和待测蛋白溶液。
5、每孔加入25ul的试剂A或试剂A’6、每孔200ul试剂B，轻轻混匀，室温放置15分钟，650-750NM检测吸光度。
三、配胶：10% (10ml，1小板) 8% (50ml，1大板) 分离胶：40% Acr-Bis 2.5ml 10. ml1.5M Tris-HCl PH8.82.5ml 12.5 mlH2O 4.8ml 26.5 ml10%SDS 100ul 500ul10% AP（H2O现配）100ul 500ulTEMED 4ul 30ul 注：大板——> 0.3cm梳子（大齿）50ml;0.5cm梳子（小孔）65ml.浓缩胶：(5ml, 1小板)40% Acr-Bis 625ul1.0M Tris-HCl PH6.8 625ulH2O 3.7ml10%SDS 50ul10%AP 50ulTEMED 5ul四、样品处理：配方一：sample buffer：0.5M Tris-HCl, PH6.8 1.0ml5×Glyceral 0.8ml（8ml）10%SDS 1.6ml二巯基乙醇0.4ml0.05%溴酚兰（用水配）0.4mlH2O 3.8ml配方二（常用）：电泳样品：25μg/孔。
Western Blot实验详细步骤
Western Blot实验技术一、制胶SDS-PAGE分离胶配方表1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL 停止加胶。
3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。
二、上样1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。
2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。
3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。
4、上样时从左到右依次上样。
5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。
6、要预留Marker的上样孔。
三、电泳四、转膜PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
（转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。
）1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。
需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。
3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。
4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。
否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。
三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白）转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。
装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。
装置运行时需冰浴。
）五、封闭在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。
封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。
western blot步骤整理
Western Blot（免疫印迹）【配胶】#玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
#10%分离胶在加入1.2.3.5.6后，取200ul于干净EP管中，再向EP管中加3ul TEMED，立即加入电泳槽中，用来封底，防止漏胶。
#按上表配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，胶要沿玻璃一端流下。
待分离胶胶面上升到合适高度（用梳子比量一下，大约离梳子下缘一指位置）。
#然后向分离胶上加一层水压胶，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需要高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
如果有小气泡，加水至水溢出，气泡便可随溢出的水而被带出。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形.）#当水和胶之间有一条折线时，说明胶已凝。
再等3min使胶充分凝固就可倒去分离胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（封胶大约需要30min）#按上表配5%浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中（梳子光面朝向自己，插梳子时要使梳子保持水平）。
（灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
）#由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程要经常在两边补胶（其实说经常有点过了，补1—2次就行了，不补胶问题也不大。
）#套上塑料袋，4度过夜。
或室温下1h左右胶便可凝固。
【加样】#隔夜取出或室温1h胶凝固后，将梳子垂直拔出。
#用水冲洗几次浓缩胶。
（注意动作要轻柔）#将胶放入到电泳槽中#测完蛋白含量后，计算含20--50ug蛋白的溶液体积即为上液量。
取出上样样品至200ul的EP管中，加入5*SDS加样缓冲液至终浓度为1* .（上样总体积一般不超过15ul,加样孔的最大限度可加20ul样品）。
上样前要将样品于沸水中煮5min—10min使蛋白变性。
（在水中煮蛋白有2个弊端：（1）EP管容易炸开，样品丢失；（2）容易进水，使样品体积增加，超过电泳最大上样量。
Western Blot步骤
Western Blot步骤
1. 将得到的样品上样，聚丙烯酰胺凝胶电泳;
2. 电泳后，去掉积层胶（也可留），用剪刀剪下与分离胶大小相同的滤纸6张、硝酸纤维素膜1张，大小为5.5x8.5 cm。
（裁减NC膜时带手套）
3. 滤纸、NC膜、凝胶及海绵在1X转移缓冲液中浸泡5分钟后，按负极板、海绵、3张滤纸、凝胶、NC膜、3张滤纸、海绵、正极板的顺序组装成“三明治”结构(在浸泡时，用镊子将它们摆放整齐)；然后在100V的电压下，冰水中转膜0.5-2小时。
根据目的蛋白大小而定，小分子蛋白需要时间短。
1X转移缓冲液（10xbuffer :ddH2O:甲醇＝80ml:720ml:200ml）
4. 卸下转膜装置，将NC膜转到培养皿，用TBST溶液洗3次，各5分钟；
7. 用含5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭膜上空白位点，30分钟（可过夜）；多余的含5%脱脂奶粉的TBS溶液可以用来配制后面所需的1%脱脂奶粉的TBS溶液。
9. 一抗孵育：（用含1%脱脂奶粉的TBS溶液将一抗稀释1000倍）与NC膜温育1小时；反应液量是NC膜面积的1/10，如40cm加4-6ml。
10. TBST溶液洗膜三次，每次5分钟；
11. 二抗反应液（含1%脱脂奶粉的TBS溶液将二抗稀释2000倍）与NC膜温育1小时；
12. TBST溶液（TBS含0.05% V/V Tween-20）洗NC膜三次，每次5分钟；
13. 化学显色：按华美公司或其它公司的NBT/BCIP试剂盒说明书配置AP显色液；与NC膜在黑暗处反应，至有清晰的条带出来后，ddH2O洗三遍，终止反应。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min 后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
Western blot实验步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）原理
• 蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ SDS-PAGE ）是蛋白质 分析过程中最常用的技术。
• 蛋白质在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本 身所带的电荷多少、分子量大小和形态。但如在 PAGE 中加入阴离子去污剂 SDS, SDS 将蛋白质的二硫键、氢 键及疏水键打开，使蛋白质变性， SDS 将包裹在变性 蛋白表面，使蛋白质成为刚性分子，同时，由于SDS带 有大量负电荷，使蛋白质本身带有的电荷可忽略。这 样，不同蛋白质分子的迁移率主要决定于蛋白带有的 SDS 量，而 SDS 与蛋白结合的量与蛋白的分子量成正比， 即迁移率决定于蛋白质分子量大小 。因此利用 SDSPAGE可测定蛋白质的分子量。
SDS-PAGE 蛋白电泳试剂
1. 丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺单体溶液（Acr和Bis)：
丙烯酰胺30g ，甲叉双丙烯酰胺0.8g，加水100ml ，滤 纸过滤后储存于棕色瓶中，4℃避光保存，pH不得超过 7.0。（光催化或碱催化其发生脱氨基反应）
• 2. 4x分离胶缓冲液 ：Tris 18.17g, 10% SDS 4ml, HCl调pH至8.8, 定容到100ml。
• 5. 10×电极缓冲液：称取Tris 30g、甘 氨酸144g，加入10％SDS 100ml，定容至 1000ml, pH8.8
• 6. 2X样品缓冲液:甘油2ml（或称取蔗糖2g ），加 入10％SDS 2ml，溴酚蓝0.25mg，浓缩胶缓冲液2.5ml、 ß －巯基乙醇0.5ml，加水定容至10ml。 • （加入溴酚蓝染料, 溴酚蓝指示剂是一个较小的分子, 可以自由通过凝胶孔径, 所以它显示着电泳的前沿位 置,当指示剂到达凝胶底部时, 即可停止电泳）
• 蛋白质样品在上样电泳前均需变性。
WesternBlot操作步骤
WesternBlot操作步骤1.样品处理：-收集样品：从细胞培养物中收集细胞或从组织中收集组织样品。
-破碎细胞：使用合适的细胞破碎缓冲液将细胞破碎并释放蛋白质。
-甲醇沉淀：向破碎细胞中加入冷甲醇，以沉淀蛋白质，并将混合液冷冻在-20℃或-80℃下，使形成沉淀物。
-洗涤：使用冷丙酮洗涤蛋白质沉淀物，去除甲醇等杂质。
-干燥：在室温下或低真空下干燥蛋白质沉淀物，以去除水分。
2.SDS-：-制备凝胶：根据待分离蛋白的大小范围选择合适的凝胶浓度，如8%-12%聚丙烯酰胺凝胶。
- 制备样品：将样品加入样品缓冲液，如Laemmli缓冲液，并将其煮沸，以使蛋白质样品被变性和解聚。
-样品加载：将样品以适当的体积加载到凝胶孔中。
-电泳：将凝胶浸泡在预冷的电泳缓冲液中，并进行电泳（通常为100-200V），直到样品达到所需的分离程度。
-目视观察：在电泳结束后，可以通过染色或蛋白质染色来可视化分离的蛋白质带。
3.电转印：-制备膜和垫纸：将两张蛋白质转移膜和一片垫纸切割成与分离凝胶相同大小的形状。
-准备电转印池：将电转印池中的电转印缓冲液注满，并将蛋白质转移膜、垫纸和凝胶按顺序放入电转印池中，保持它们之间的紧密接触。
-转印：应用恒定的电流（通常为300mA）进行电转印，以将蛋白质从凝胶转移到膜上，通常需要1-2小时。
-验证电转印的效果：将凝胶和膜进行一致性染色或蛋白质染色，以判断蛋白质是否转移到膜上，是否均匀。
4.膜上抗体反应：-阻断：将膜放在牛血清蛋白（如5%脱脂奶粉）或胶原蛋白（如2%BSA）的阻断缓冲液中，以阻止非特异性的抗体结合。
-一次抗体：加入适当稀释的一次抗体，针对待检测蛋白的抗体。
将膜和一次抗体一起在冰箱中孵育，使二者结合。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除非特异性结合的抗体。
-二次抗体：添加适当稀释的二次抗体，该抗体与一次抗体结合，并标记有辅助酶或荧光标记物。
-洗涤：用洗涤缓冲液洗涤膜，以去除未结合的二次抗体。
Western Blot 步骤
Western Blot 步骤：1、样品处理（细胞样品的处理）：1）培养细胞或药物处理2）弃上清，1*PBS漂洗细胞2遍，去尽残留培养基3）加入1*SDS电泳缓冲液，刮落细胞，转移到EP管中（注意冰上操作）4）4摄氏度下搅拌30分钟5）4摄氏度离心，转速和时间根据细胞不同进行改变，一般是12000转/分，20min。
6）离心管取出，置于冰上，吸取上清，其余丢弃。
7）测定蛋白浓度（BSA、BCA、Lowry、Bradford法），-20摄氏度或-70摄氏度冻存备用。
8）加入Loading Buffer， 95~100摄氏度煮沸5min，若测多种蛋白时，70摄氏度加热5~10分钟更为合适。
2、配胶：将两块玻璃清洗干净，先用洗洁精，再用70%乙醇，最后用ddH20，有Bio-Bad字样朝上，完成后加入H2O，约10分钟，确认无漏水后倒出H20，残留的用滤纸吸干（不要伸到里面去，倾斜后在边缘吸）。
3、根据分子量大小配分离胶:在干净的15mL离心管内配制（过硫酸铵APS最后加入，且需分装），混匀，用1mL枪加至绿线下方1~2mm处，注意不要将液体全打出来，防止气泡产生，从一边到另一边缓缓加入无水乙醇，ddH20溢出后，室温放置25~30分钟，可看到分离胶与ddH20之间有一条清晰的分界线，倒出上层的乙醇，并用ddH2O洗涤两遍，用滤纸吸去残留的水。
（Tris pH：8.8，配制10mL的量）4、配制浓缩胶：APS最后加入，快速加至液体溢出，将清洗干净的梳子水平插入，擦干外面，静置60分钟后应用于下一步试验；或4摄氏度冰箱过夜。
（Tris pH：6.8，一般配制4mL的量）分离胶与浓缩胶的pH一定要调准，否则严重影响实验结果。
APS1周内使用。
5、加样：将配制好胶的玻璃板轻轻取出，不可分离，放入电泳仪，矮面朝内，放平加紧，倒入1*电泳缓冲液，最好内外液面基本持平，或外液面稍矮，放置检查有无漏电泳液，电泳液配制约1000mL，如果电泳仪有漏液情况，则配制1200mL，使内外液面基本持平。
Western Blot 详细实验步骤
Western Blot protocol1，制样：将获得的细胞用PBS洗涤，300gx4℃x5min,弃去上清。
加SDS loading buffer 搅拌转移到1.5ml离心管。
放到干浴锅100℃煮10min，放入冰上5min，最后存入-20℃冰箱待用。
2，将样品取出待用，可100℃煮2min，待上样。
3，配胶：浓缩胶5%，分离胶8%，10%或12%（分子大用低浓度，分子小用高浓度Caspase3 35kD，12%浓度(活性形式17kD)；DAPK1/p-DAPK1 160KD 18%浓度）：ddH2O，30%Acrylamide, 1.0M/1.5MTris-HCL, 10%SDS, 10% AP, TEMED按比例加。
1）夹好板子，用ddH2O捡漏，5min。
2)按照顺序加入试剂配胶配分离胶（50ml管子），混匀。
3）加胶7ml，大致与夹子的门平齐。
随后轻轻加3ml乙醇液封页面。
静置30min。
4）将乙醇倒掉，用ddH2O清洗3遍。
5）制备浓缩胶，加入3ml左右只玻璃板界面，插入梳子。
6）静置30min后拔掉梳子。
取下玻璃板用ddH2O 冲洗边缘。
7）若不立即使用可用保鲜膜将其包好放在4℃冰箱。
（TEMED在灌胶前加入）4，上样：1）固定好玻片，加入running buffer 没过底板，盖上盖子。
2）浓缩胶75-80V 30min左右，分离胶100V-120V 1h左右。
5，转膜：1）取出玻璃板，用切胶器轻轻撬动取掉小玻片，切去浓缩胶（将分离胶放入放入ddH2O水中浸泡5min，重复三次）再放入trans buffer中放置10min。
2）剪一块与胶一样大的PVDF膜放在甲醇中浸泡，使其带正电。
3）将PVDF，海绵垫，滤纸放入trans buffer浸泡几分钟。
4）在黑色面板依次放入海绵垫，至少3层滤纸，胶，转移膜，注意不能有气泡，再放滤纸，海绵垫形成夹心结构。
(大分子用0.4 um PVDF 膜，小分子用0.25um PVDF膜)。
western blot 超详细步骤
一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂 10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
Western_Blot过程步骤详解
做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．蛋白提取：１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。
每次30秒,重复3-5次.（2）离心机1000rpm，4℃离心10min 后，所得上清液转入超速离心管。
(去掉大块组织及结缔组织)（3）100000g，4℃离心1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可)。
沉淀用适量的Buffer B重悬，4度过夜后，分装至EP管，Eppendorf 台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
（4）收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。
冰上预冷。
所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。
western blot步骤
提取细胞蛋白步骤：1、配蛋白裂解液（蛋白酶抑制剂：RIPA裂解液=1:100）2、培养瓶弃去培养液，用PBS冲洗2遍3、用枪吸干PBS，加入80μl裂解液4、用刮刀刮下壁上细胞，吸入置于1.5ml EP管中5、超声，每次6-8下，间隔5min，2次-3次6、裂解30min，离心，13500转，10min7、铺96孔板中测蛋白浓度，每孔19μl裂解液，1μl样品，200μl工作液（A液：B液=50:1）8、96孔板于培养箱中孵育30min9、放入酶标仪中测浓度10、剩余蛋白吸入0.6ml EP管于-80℃中冻存提取组织总蛋白：取材时，应涮去组织表面的血，影响吸光度。
步骤：1、配裂解液（裂解液：10%SDS：蛋白酶抑制剂=60:40:1）2、研磨组织块，加300μl裂解液3、超声，3次，每次间隔5min4、冰中静置30min，裂解5、4℃离心13500转25min，吸取上清液至1.5mlEP管6、配工作液：BCA试剂A液：B液=50:17、铺入96孔板，依次加入19μl RIPA裂解液/PBS、1μl样品、200μl工作液，混匀（枪头在液面下，不产生气泡）放入37℃孵育20min8、放入酶标仪中测蛋白浓度：96孔板放入酶标仪中，进板—开始检测—bca562—read plate—Read—完成—结果（不能时间过长，否则检测的OD值偏高）9、剩余样品分装（避免蛋白降解）于0.6ml EP管，50μl/管10、保存于-80℃Western blot步骤：一、配胶，准备样品（10%的胶）1、胶板中倒入去离子水，静置5min，观察是否漏水，并用滤纸垫脚调平2、弃去去离子水，加入分离胶（10%），用去离子水封口3、40min左右，分离胶凝固，倒去去离子水，加入积层胶4、快速插入梳子（以免积层胶凝固，梳子要用去离子水冲洗干净，并将去离子水甩掉，否则会在胶板上留下不能用的孔道）5、20min左右，将胶板置于去离子水中4℃保存，防止胶中的水分蒸发，发生缩胶现象。
western-blot标准步骤
Western-blot检测a. 将制胶玻璃板和样品梳用水冲洗干净，安装好制胶板。
b. 按照制胶体系配置5mL 10%分离胶，充分混匀后吸取4mL灌入玻璃板间隙中，留出灌注浓缩胶所需空间（梳子齿长再加1cm），最后向分离胶中加入1mL 蒸馏水。
将凝胶放置于室温40min后聚合。
c. 倒出覆盖层水，用去离子水洗去未聚合的丙烯酰胺，排去凝胶上的液体，用滤纸吸干残留液体。
d. 按照制备浓缩胶体系配置3mL 5%浓缩胶，充分混匀后加入到玻璃板间隙，立即在浓缩胶中插入干净的样品梳，避免混入气泡，将凝胶放置室温约40min 后聚合。
e. 小心移出梳子，用去离子水吸取未聚合的丙烯酰胺。
把凝胶固定于电泳装置上，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液。
f. 按顺序向加样孔中加入15μL样品。
将电泳装置与电源接通，恒压80V电泳，当染料前沿进入分离胶时，将电压调至100V，待溴酚蓝到达分离胶底部，关闭电源。
g. 从电泳装置上卸下玻璃板。
戴上手套，根据胶大小，裁剪8张滤纸和1张PVDF膜。
将PVDF膜用甲醇浸泡3~5s，随后将其与滤纸放入转移缓冲液中浸泡3~5min。
h. 转膜装置从上到下依次按阳极碳板→4层滤纸→PVDF膜→凝胶→4层滤纸→阴极碳板顺序放置，尽量避免气泡的产生。
i. 将500g的阳极盖子压上，接通电源，恒流1mA/cm2，转移1.5h。
j. 断开电源，从上到下拆卸转移装置，将凝胶转移至盛有考马斯亮蓝的容器中染色；在PVDF滤膜左上角做标记。
用TBS/T洗膜3次，每次5分钟。
用含有5%脱脂奶粉的封闭液将膜封闭2h。
k. 弃封闭液，用TBS/T洗膜，5min×3次。
l. 加入合适浓度的一抗（用封闭液将一抗稀释到合适比例），4℃孵育过夜。
m. 弃一抗，用TBS/T洗膜，5-10min×4次，加入合适浓度的二抗，室温放置2h。
n. 弃二抗，用TBS/T洗膜，5min×4次。
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Western blot protocol
步骤：
1. 分离胶和积层胶，制胶板；
注意：灌分离胶时不要加太多。
2. 蛋白变性：准备蛋白样本，加入等体积的2×上样Buffer稀释，置于沸水中煮10min（预染marker煮5min）
3. 加样：每孔加入20～40μl样品
4. 电泳：置于电泳槽中电泳45min，恒定电流90mA（2块板），如为1块板则电流为50mA；
5. 取出胶板，用切割刀修好胶；
6. 将胶置于转膜液中浸泡；
7. 按顺序放好下列物质：黑面→海绵→滤纸→胶→NC膜→滤纸（用吸管赶去气泡）→海绵；
8. 置于转膜槽中于，黑面对黑面，加上冰块，加入转膜液；
9. 装好电极，于恒定电压100V下，90min；
10. 丽春红染膜；
11. 用TBST洗去丽春红；
12. 封闭：加入5％脱脂奶粉＋TBST，常温摇床摇1h；
13. 回收封闭液，加入一抗【一抗用5％BSA＋TBS稀释】；
14. 置于4℃摇床摇过夜；
15. 回收一抗，TBST洗膜，10min，共3次；
16. 加入二抗【二抗用5％脱脂奶粉＋TBS稀释】，常温摇床摇1h；
17. 回收二抗，TBST洗膜，10min，共3次；
18. 将膜置于发光液中浸泡约1min；
19. 将膜铺于曝光盒中，于暗室中曝光，洗胶片。
常用溶液配制：
Ⅰ细胞裂解液（PLC Lysis Buffer）
Final concentration 100ml 500ml
1M Hepes(pH7.5) 50mM 5ml 25ml
5M NaCl 150mM 3ml 15ml
Glycerol 10% 10ml 50ml
50mM MgCl2 1.5mM 3ml 15ml
Triton×100 1% 1ml 5ml
1mM 200μl1ml
0.5M
EDTA(pH8.0)
0.1M NaPPi 10mM 10ml 50ml
0.5M NaF 10Mm 2ml 10ml
每次提取蛋白前加入1％蛋白酶抑制剂
Ⅱ. SDS-PAGE胶配方及其它常用溶液的配制
1．30%丙烯酰胺
丙烯酰胺29g
N-N’-亚甲双丙烯酰胺1g
溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃使其溶解，补加水至终体积为100ml。
用Nalgene 滤器（0.45μm孔径）过滤除菌或Whatman 1号滤纸过滤，查证该溶液的pH值不大于7.0，置棕色瓶中保存于RT。
注：（1）丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，丙烯酰胺的作用具累积性。
（2）称取时，必须戴手套、口罩；取溶液时也要戴手套。
（3）贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺缓慢转化为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨反应是光催化和碱催化的。
应检查丙烯酰胺溶液的pH值是否在7.0或更低，并应在RT下避光保存。
每隔数月应重新配制溶液。
2．3M Tris-HCl,pH8.8（用于分离胶）
Tris碱分子量为121.1。
将72.66gTris碱溶于重蒸水（不超过200ml）中，加浓盐酸调节pH 至8.8，让溶液泠却至RT，再最终调至所需pH值。
加重蒸水定容至200ml，1.034×105 Pa，20min 高压灭菌，RT贮存。
注：(1)如溶液呈现黄色，应予丢弃，并置备质量更好的Tris.
(2)Tris溶液的pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。
3．2M Tris-HCl,pH6.8（用于积层胶）
同上方法，将48.44gTris碱加重蒸水定容至200ml，加浓盐酸调节pH至6.8。
4．10%十二烷基硫酸钠（SDS）
在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。
注：SDS的微细晶粒易于扩散，因此称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作区和天平上的SDS，10%SDS溶液无须灭菌。
5．TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺)
TEMED通过催化过硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺与双丙烯酰胺的聚合。
由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。
6．10%过硫酸胺
过硫酸胺提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所必需的自由基。
可用去离子水配制小量10%（W/V）的贮存液于保存于4℃。
由于过硫酸铵会缓慢分解，故应隔新鲜配制。
方法：把1gAPS溶解于终量为10ml水溶液中，4℃保存数周。
7. 电泳缓冲液SDS buffer: 10X（running buffer）
Tris base 30.3g
Glycine 144.0g
SDS 10.0g
ddH2O to 1L
(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 0.1%SDS,)
8. 转膜缓冲液Transfer Buffer(10×) pH8.3
Tris base 30.3g
Glycine 144.0g
20%v/v methanol (Fresh!)
ddH2O to 1 L
(1X conc: 25mM Tris base, 192mM glycine, 200ml methanol)
9. TBST(10X) pH: 7.5
Tris base 24.2g
NaCl 80.0g
Tween-20 10 ml
ddH2O to 1L
(1X conc: 100mM Tris base, 150mM NaCl, 0.1%Tween20)
10．Tris缓冲盐溶液（1X TBS，25mmol/L Tris）
NaCl 8.0g
KCl 0.2g
Tris碱 3.0g
溶解于800ml蒸馏水中，加入0.015酚红并用HCl调pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在15lbf/in2(1.034×105 Pa)，高压下灭菌20min，RT贮存。
11．发光剂
100mM Tris Base（pH8.5）10 ml
250mM Luminol (in DMSO) 50 μl
90mM P-Coumaric Acid (in DMSO) 22 μl
30%H2O2 2.75 μl
SDS-PAGE Mini-Gel Recipes
10%Running Gel。