人间充质干细胞治疗肝病研究进展及前景

作者单位：１０００３９北京，解放军第三。二医院生物治疗研究中心 （施明、王福生）；３０００２０天津，中国医学科学院血液学研究所（刘拥 军）
通信作者；王福生，Ｅｍａｉｌ：ｆｓｗａｎｇ＠ｐｕｂｌｉｃ．ｂｔａ，．ｎｅＬ．ｃｎ
万方数据
二、人ＭｓＣｓ体外诱导培养 有研究者利用ＨＧＦ、ＦＧＦ来诱导ＭｓＣｓ向肝细胞的分 化Ｈ Ｊ。还有研究者发现在ＭＳＣｓ单独培养或与肝细胞共培养 体系中，均需要有肝细胞生长因子（ＨＧＦ）、ＦＧＦ－４以及表皮牛 长因子（ＥＧＦ）才出现肝细胞的基因表达［５卅。有报道，ＭＳＣｓ在 与正常肝细胞或受损肝细胞培养时町诱导分化为肝细胞。而不 需要额外的生长因子【７］。体外一定条件下利用２步法可诱导 成具有肝细胞形态和功能的肝细胞样细胞。第１步，Ｍｓｃｓ在 ＩＭＤＭ培养基，内含ＨＧＦ、ｂＦＧＦ、烟碱中培养７ ｄ。第２步，在 ＩＭＤＭ的培养基中加入制瘤索Ｍ（ｏｎｃｏｓｔａｔｉｎ Ｍ）、地塞米松以 及ＩＴＳ＋的混合物中培养。２周后培养的ＭＳＣｓ逐渐出现肝细
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人间充质干细胞治疗肝病研究进展及前景
施明 刘拥军 王福生
阃充质干细胞（ＭＳＣｓ）是干细胞的一类，因能分化为间质 组织得名，是属于中胚层的一类多能干细胞，主要存在于结缔 组织和器官问质中，骨髓中含量最丰富。ＭＳＣｓ可以向多种中 胚层和神经外胚层来源的组织细胞分化，可分化为成骨细胞、 软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、平滑肌细胞、骨髓基质细胞、成 纤维细胞及多种血管内皮细胞，甚至神经系统的神经元和神经 胶质细胞，使之成为治疗多系统疾病的“实用型干细胞”。
应用致步匕剂量的四氯化碳（ＣＣＩ，４）建证Ｎ（）Ｄ－ＳＣＩＤ小鼠急 件肝脏损伤模型。２４ ｈ后予高剂量（１．４～４．２ ｘ １０７ ＭＤＨｓ／ｋｇ） 的人骨髓来源的ＭＳＣｓ（ＢＭ～Ｍｓ（：）诱导的肝细胞（ＭＤＨｓ）可使 １／３（４／１２）的鼠暴发型肝衰竭得到有效恢复，而低剂量（１．４～ ４．２ ｘ １０６ ＭＤＨｓ／ｋｇ）则元效。而应用未经诱导的ＭＳＣｓ进行 移植治疗，低剂量的ＭＳＣｓ（１．４～４．２ｘ １０６ ＭＳＣｓ／ｋｇ）可使２／３ （４／６）的鼠暴发型肝衰竭得到有效恢复。高剂量（１．４～４．２ ｘ １０７ ＭＳＣｓ／ｋｇ）可使１００％的鼠暴发型肝衰竭能得到有效的恢 复，囚此，应用未经诱导的ＭＳＣｓ似乎比诱导成肝细胞样细胞 后的效果要好【ｌ“。此外，通过静脉移植效果要好于脾内移植。 移植后的ＭＳＣｓ町在体内分化为肝细胞。然而急性肝损伤所造 成的疾病进展快，肝功能恢复不依赖于ＭＳＣｓ分化为肝细胞的 过程，而更大程度上依赖其他机制。研究认为，ＭＳＣｓ有很强 的抗氧化应激反应能力（比ＭＤＨｓ强），其效应方式是旁分泌 效应，即分泌众多的生长因子和细胞凶子，发挥局部效应。从而 减轻肿脏的急性损伤【１“。
三，ＭＳＣｓ分化为肝细胞的体外及动物模型研究 终末期肝病的唯一有效疗法是肝移植，然而肝源的缺乏以 及终身应用免疫抑制剂而导致严重的不良反应，使整体肝脏器 官移植的临床应用受到限制，人们开始寻求另一种途径，即应 用肝细胞进行移植治疗，有些治疗取得了一定疗效。由于肝细 胞移植同样需要有肝源提供质量良好的肝细胞，且体外培养肝 细胞的条件苛刻，效率不高，因此肝细胞移植并不是一个可供 选择的适合方法。基于干细胞的强大分化潜能，人们开始尝试 应用干细胞治疗各种疾病，包括肝病特别是肝衰竭或终末期肝 病。千细胞包括ＭＳＣｓ分化为各种组织细胞的潜能，包括肝细 胞。由于ＭｓＣｓ很容易从成人的骨髓及其他组织中获取，在体
有研究者将诱导培养后的ＭＳＣｓ消化洗净，用无血清的 ＤＭＥＭ培养基加０．０５％的牛血清ＡＩ。Ｂ培养２４ｈ，收集培养的 上清液，用超滤方式浓缩２５倍成为ＭＳＣｓ的条件培养基 （ＭｓＣ—ＣＭ）¨Ｊ。应用此ＭｓＣ—ＣＭ可减轻由肛半乳糖胺（Ｄ－ ｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ）诱发的大鼠暴发型肝炎的肝细胞坏死，减轻肝 细胞的凋亡（能使凋亡的细胞减少９０％），促进受体鼠肝细胞 的再生（使再生速度增加３倍），小鼠生存时间明显延长。
脂肪组织来源的ＭＳＣｓ（ＡＴ－ＭＳＣ）［１”４】和脐带来源的 ＭＳＣｓ（ＵＣ－ＭＳＣ）Ｌ１５］与骨髓米源的ＭＳＣｓ（ＢＭ—ＭＳＣ）非常相 似．可在体外诱导成肝细胞样细胞。此种细胞有肝细胞形态，还 有肝细胞标志，如ＡＩ。Ｂ，ＡＦＰ、Ｔ【）（）２，ＣＹＰ７Ａ１等，ＨＮＦ－４一ａ、 ＴＴＲ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＫｌ８和ＣＫｌ９表达阳性，且贮存糖原。将此 ＡＴ—ＭＳＣ来源的肝细胞通过尾静脉输注到ＣＣＬ４肝损伤模型 的小鼠体内，发现此细胞町整合入宿主肝脏中，部分小鼠肝脏 功能凶此得到改善。
但也有研究表明，ＭＳＣｓ不能在体外诱导为成熟的肝细 胞。如有研究者应用ＵＣ—ＭＳＣ在体外诱导成肝细胞样细胞， 其ＡＩ。Ｂ、ＡＦＰ、ＣＫｌ９、ＣＸ３２表达阳性，同时具有糖元贮存、产生 尿素等肝细胞的功能，但成熟肝细胞特异性标志ＨｅｐＰａｒｌ或 ＨＮＦ一４－ａ为阴性，说明体外诱导的ＭＳＣｓ不能分化为成熟的肝 细胞。将未分化的ＵＣ—ＭＳＣ直接注入肝部分切除的ＳＣＩＤ鼠
（㈥ｎｓｆｅｒａｓｅ）于４周开始表达。ＣＫｌ８、白蛋白 胞样形态。随着诱导时间的延长，细胞质中出现丰富的颗粒物
质，并能持续保留至１２周。２周时甲胎蛋白（ＡＦＰ）、ｔａｓｅ）出现表达，酪氨酸氨基转移酶
（ＡＩ，Ｂ）以及色氨酸２，３一过氧化物酶（ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ２，３－ ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ）在培养期间均能检测出。此外，细胞色素Ｐ４５０ ２８６、肝细胞核因子一４（ＨＮＦ－４）的表达分别在第４周和第６周 检测出。功能实验，肝细胞样细胞还能摄取低密度脂蛋白 （ＬＤＬ）。４周后贮存糖原，６周后合成尿素。并晕时间依赖方式 递增。胆小管抗原９１５２旱阳性。用此二步法诱导肝细胞样细胞 有几点优势：（１）增加细胞来源；（２）过程简单；（３）细胞寿命长； （４）数量充足；（５）所需时间短¨Ｊ。
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脾内，发现受体鼠的肝脏中人线粒体检测阳性。在肝门静脉周 围内出现表达人ＡＩ，Ｂ及ＡＦＰ的细胞，而ＵＣ－ＭＳＣ结构性表达 的ＣＫｌ９却转阴，说明ＵＣ—ＭＳＣ可在体内分化为肝细胞，并且 免疫原性很低，是ＭＳＣ治疗肝病的良好细胞来源ｆ１“。
有研究表明，在人ＭＳＣｓ培养的体系中不加生长因子。将 ＭＳＣｓ移植于免疫抑制的大鼠体内，其分化成肝细胞的比例极 少［１“。也有报道，即使ＭＳＣｓ在ＨＧＦ和ＥＧＦ培养的条件下， 输注小鼠体内后分化成肝细胞的比例仍非常低［１…。有研究将 人骨髓来源的ＭＳＣｓ直接注入免疫抑制的肝脏损伤的大鼠中， 发现人ＭＳＣｓ的分布只限于注射部位周同。虽然可分化成肝细 胞，但分化效率很低，移植４周后分化为肝细胞的比例低于 ０．５％。效率很低的原因日ｒ能是受体人鼠为免疫抑制状态，但 还可能对异种ＭＳＣｓ产牛免疫排斥反应．使大多数的人ＭＳＣｓ 遭到排斥而凋亡。此外，小鼠的肝细胞不能提供合适的细胞与 细胞问及细胞与基质间的信号交流，而这些信号交流是ＭＳＣｓ 融合入受体肝脏所必须的¨“。研究还发现，供体的ＭＳＣｓ并 不与受体肝细胞融合，ＭＳＣｓ分化的肝细胞单纯来源十供体的 ＭＳＣｓ，而）ｔ－ｔＥ供体细胞与受体肝细胞的融合细胞』ｌ…。
明、ＭＳＣｓ治疗与肝脏纤维化 在ＭＳＣｓ抗肝纤维化方面，研究也取得了一些进展，但也 存在争议。国内外一些研究首先应用ＣＣＬ４建立动物肝脏损 伤模型，将人或动物来源的ＭＳＣｓ植入肝脏损伤的动物体内 后，“ｒ减少肝组织内的胶原沉积和羟脯氨酸含量，抑制肝细胞
内转化生长因子一Ｂ１（ＴＧＦ－ｐ１）、ｒ平滑肌肌动蛋白（ａ－ＳＭＡ）表 达。降低血清Ⅲ型前胶原氨基未端肽（Ｐ１１Ｐ）、透明质酸和层黏 连蛋白水平，并持续表达和分泌ＡＩ，Ｂ，减轻肝纤维化。降低 ＡＬＴ，提高动物牛存率∽ｏ ２“。肝纤维化模型第４～６周进行 ＭＳＣｓ移植仍具有较好的抗纤维化效果【２“２’２”。有的研究进一 步报道【２“，ＭＳＣｓ在有ＨＧＦ培养条件下，可上调ＡＬＢ的分泌， 减轻肝细胞损伤以及肝纤维化，但在缺乏ＨＧＦ的培养条件下， ＭＳＣｓ无此功能。ＭＳＣｓ移植抗肝纤维化的机制尚不清楚，可 能主要包括２方面：一是ＭＳＣｓ通过分化为功能性肝细胞，促 进受体内源性肝细胞增殖［２“，分泌多种生长因子如ＨＧＦ［２“、 碱性成纤维细胞生长因子（ｂＦ（汀）等促进肝再生［２”叼；二是 ＭＳＣｓ通过直接诱导肝星状细胞凋己或抑制其激活，分泌抗纤 维化物质如ＨＧＦ、Ｇ－ＣＳＦＥ２“、基质金属蛋白酶－９（ＭＭＰ一９）Ｌ２７３ 等减少ＥＣＭ沉积，抑制肝组织纤维化的形成。
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外可大量扩增，长时间培养可使ＭＳＣｓ保持分化成各种组织的 潜能，且能分化为肝细胞样细胞，并具备肝细胞功能。ＭＳＣｓ 此种能力使其在临床治疗Ｅ具有较好的前景，在肝病临床治疗 中的应用越来越受关注［Ｊ…。
在体外，ＭＳＣｓ能诱导分化为肝细胞样及胆管上皮细胞， 但在体内他们的功能目前还缺乏证据。人骨髓来源的ＭＳＣｓ 在体外麻用人肝细胞维持培养慕（ＨＨＭＭ），ＨＧＦ、ＥＧＦ等条 件卜Ｉ叮诱导成功能性肝细胞的表型和具备相应的功能．如红培 养的第７天。肝细胞日．期分化的标志ＡＦＩ’、ＣＫｌ９、ＣＫ７表达上 调，之后缓慢Ｆ降至消失；相反，肝细胞分化成熟的标志如细胞 色素Ｐ４５０亚型３Ａ４（ＣＹＰ３Ａ４），尿素循环酶一氨甲酰磷酸合成 酶（Ｏｌ’ｓ）、肝细胞特异的间隙连结蛋白一３２（ＣＸ３２）、ＣＫｌ８、ＡＩ。Ｂ 和转铁蛋白的表达却逐渐卜－凋。此外．培养液中尿素含量不断 增加。存在时间剂量效应。将此ＭＳＣｓ植入行肝脏部分切除术 的免疫缺陷小鼠脾脏内，１２周后发现肝脏局部内有米源于人 ＭＳＣｓ分化的肝细胞，但转化成肝细胞的比例却很低ｆ１“。总 之，人骨髓来源的ＭＳＣｓ可在体内长期行使宿主肝细胞的功 能，是肝细胞移植治疗的细胞来源之一。
一、人ＭＳＣｓ表型特征和功能特点 目前对ＭＳＣｓ免疫表型的研究结果并不完全一致，这可能 是由于分离方法不『司所致。多数研究通过ＭＳＣｓ与造血细胞对 塑料黏附能力的不同来分离ＭＳＣｓ，但也有一些通过特定的表 面标记如ＳＴＲＯ－１、神经生长因子受体（ＮＧＦＲ）来分选扩增…。 人ＭＳＣｓ表面存在着一些与造血细胞不同的特异性抗原如 ＳＴＲ０１、ＳＨ３／ＣＤ７３、ＳＨ４／ＣＤ７３等，许多黏附分子如活化的白 细胞黏附分子（ＡＬＣＡＭ）、细胞问黏附分子（］ＣＡＭ－１，２。３）、整合 素家族ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ等也为阳性，同时还 表达许多细胞生长因子受体如白细胞介素１受体（ＩＩ，１Ｒ）、 ＩＬ－３Ｒ、ＩＩ。一４Ｒ、ＩＬ一６Ｒ、ＩＬ－７Ｒ、碱性成纤维细胞生长因子受体 （ｂＦＧＦＲ）、肿瘤坏死因子ａ受体（ＴＮＦａＲ）和血管内皮细胞生 长因子（ＶＥＧＦ）受体胎肝激酶１（ＦＩＫ－一１／ＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２），其他 如ＣＤ９０、ＣＤｌ０５、ＣＤＴｌ、ＣＤ２９和ＣＤ４４等表达也阳性，其中的 ＣＤ２９和ＣＤ４４被认为是ＭＳＣｓ重要表面标志物，ＣＤ７１被认为 是成熟问充质干细胞的标志，而大多数造血细胞标志如ＣＤ３４、 ＣＤ４５、ＣＤ３８、ＣＤｌ４、Ｃ：Ｄ１１等均为阴性，此外，ＨＬＡ２ＤＲ、ＣＤ８０、 ＣＤ８６、Ｃ【）４０亦为阴性［１。］，但迄今为止尚未发现具有高度特异 性的表面标记。 体外培养时ＭＳＣｓ可表达许多生长因子和细胞因子如 ＩＩ，１、ＩＬ－－６、ＩＩ；７、ＩＬ－８、ＩＬ－１１、ｌＬ－１２、ＩＬ－１４、ＩＬ－１５、粒细胞集落刺 激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、巨噬细胞集落刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、白血病抑 制因子（Ｉ．ＩＦ）、Ｆｍｓ样酪氨酸激酶３（Ｆｈ－３）、干细胞因子（ＳＣＦ）、 促血小板生成素（ＴＰ０）和ＴＮＦ－ａ等；ＩＬ－一１ａ诱导町使ＩＬ－１ｄ、ＩＬ－ ６、ＩＬ－８、ＩＬ－１ １、ＬＩＦ、Ｇ－ＣＳＦ和Ｍ—ｃＳＦ表达增加，而地塞米松则 使ＩＩ，６、ＩＬ．１１和ＬＩＦ表达下调［２］。ＭＳＣｓ除了参与构成造血 微环境外，还具有广泛的分化潜能，如ＭＳＣｓ不仅可分化为成 骨细胞、肌肉细胞等间质组织细胞。还可跨越胚层界限，分化为 外胚层的神经元、神经胶质细胞及内胚层的干细胞等。