用基因芯片技术测定健康人群P4502C9基因多态性[1]
合集下载
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
( 1. M a rin D rug and Food Institu2
te, O cean U n iversity of Ch ina,
Q ingdao 266003, Ch ina; 2, D e2
pa rtm en t of C lin ica l Pha rm acology,
Ch inese PLA Genera l Hospita l, B ei2
经测序确证重组质粒为野生型 。以野生型重组 质粒为模板 ,用突变引物 PCR扩增产生定点突变的方 法 [ 5 ] ,在目标片段的特定位点引入突变碱基 ,纯化目 标片段 ,用 T4 DNA 连接酶连接至 PGEM ( r) T4 - vec2 tor,转化感受态大肠杆菌 JM109。经测序确证重组质 粒为突变型 。
3. 3 杂交和信号检测
Cy3 - 标记的单链 PCR 产物与杂交液 ( 5 ×SSC, 0. 1% SDS, 1 ×Denhart试剂 ) 混合 ,将混合液 10μL 转 移至芯片的杂交区域 。芯片置于杂交盒中 ,在 45℃水 浴中保温 1 h。杂交后的芯片依次在洗液 A (1 ×SSC, 0. 2% SDS) 、洗液 B ( 0. 2 ×SSC) 和洗液 C ( 0. 1 × SSC)中各洗涤 1 m in。芯片用共聚焦扫描仪在激发波 长 540 nm、发射波长 570 nm 扫描 。产生并分析精度 为 10 μmo l·L - 1的 16 位 TIFF图象 。在扣除背景值 后 ,信号强度以每条探针的重复 2点的均值计算 。
Ta b le 1. Com p a riso n o f co nd itio n o f the 63 he a lthy p a rtic ip a n ts
Item P450 2C93 1 / 3 1 P450 2C93 1 / 3 3 P450 2C93 3 / 3 3
Sex ( M / F) 159 ( 113 /36)
2 试验对象
筛选 169 名健康志愿者 ,男女不限 ,年龄 18 ～43 岁 ,身高 150～183 cm ,体重 50～84 kg,均在标准范围 内 。受试者自愿签署知情同意书 。
3 用基因芯片法测定 P450 2C9基因型
3. 1 D NA纯化及质粒构建
用 DNA 纯化试剂盒从全血中提取 DNA; 用紫外 分光光度计定量后冻存于 - 20℃备用 。寡核苷酸 (引 物或探针 )用标准亚磷酰胺化学方法在自动合成仪上 合成 。所有荧光引物在合成中用 Cy3 亚磷酰化试剂 在 5′端进行标记 。以基因组 DNA 为模板的 PCR扩增 产物纯化后用 T4 DNA 连接酶连接至 PGEM ( r) T4 vector,转化感受态大肠杆菌 JM109。
3. 2 寡核苷酸芯片制备
标准载玻片用重铬酸洗液浸泡过夜 ,蒸馏水清 洗 ,依次用 25%氨水溶液和 1mol·L - 1的盐酸水溶液 浸泡 8 h,蒸馏水清洗 。将洁净的载玻片浸入氨丙基 三甲氧基硅烷的 95%的乙醇溶液中 ,冰醋酸调节 pH 至 4. 5,室温处理 30 m in。95%乙醇超声清洗 ,蒸馏水 超声清洗 , 115 ℃烘干 。将氨基化载玻片浸入 5%的 戊二醛水溶液 ,室温处理 30 m in。M illi - Q 超纯水清 洗 。室温干燥备用 。将探针用点样液〔3 ×NaC1 /柠檬 酸缓冲 液 pH 7. 0 ( SSC ) , 0. 01% 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ( SDS) 〕稀释至终浓度为 30 μmol·L - 1 ,并取 10 μL 转移至 96 孔板 。用芯片点样仪点至醛基化玻片上 , 每点体积约为 0. 5 nL ,直径约为 200 μm ,重复点 2 次 。点样时保持湿度 70% ,温度 23℃ 。点样后的芯 片在使用前室温放置至少 24 h。
材料 、对象与方法
1 材料与仪器
DNA 纯化试剂盒 , PCR 产物纯化试剂盒 ,均购自 美国 Promega公司 ; DNA 测序试剂盒 ,购自德国 B eck2 man公司 ;其余试剂均为国产分析纯 。
紫外分光光度计 , 购自德国 B eckman Coulter公 司 ; AB i 8909 自动核酸合成仪 ; 2000XL DNA 测序仪 , 均购自德国 Beckman公司 ; PCR 扩增仪 ,购自意大利 MJ. Reseach公司 ; 3000 GSI共聚焦扫描仪 ,购自美国 Lumonics公司 。
4 DNA 测序
对于变 异 和 部 分 正 常 志 愿 者 的 DNA 样 本 , 用 DNA 测序法验证基因芯片测定的结果 。取 PCR 反应 产物 50μL ,用 PCR产物纯化试剂盒得 DNA 样品 ,用 DNA 测序仪 ,按 DNA 测序试剂盒操作说明进行 。
结 果
1 基本情况
169例志愿者完成 ,本试验均为中国汉族志愿者 , 男性 121 例 ( 71. 6% ) ,女性 48 例 ( 29. 4% ) ,年龄为 (32. 2 ±6. 3)岁 ,身高 ( 166. 1 ±6. 6) cm ,体重 ( 63. 7 ± 7. 2) kg。比较不同 P450 2C9基因型志愿者的基本情 况 ,经 t检验和 χ2 检验无统计学差异 (表 1) 。
陈 马昆 1 , 王 睿 2 , 文思远 3 , 李 健 3 , 王升启 3
(1. 中国海洋大学 海洋药物与食品研究 所 ,山东 青岛 266003; 2. 解放军总医院 临床药理室 ,北京 100853; 3. 军事医学 科学院 放射医学研究所 ,北京 100850)
CHEN Kun1 , WAN G Rui2 , W EN Si - yuan3 , L I J ian3 , WANG Sheng - qi3
P450 2C9是人体中重要的药物代谢酶 ,其在人肝微粒体中含量丰 富 ,约占 P450总量的 20%。 P450 2C9能代谢许多不同性质的药物 ,如 S - 华发令 、苯妥因 、甲苯磺丁脲 、洛沙坦以及非甾类抗炎药等 ,并在前 致癌物 、前毒物和致突变剂的活化中也起一定作用 [ 1 ] 。
大量研究表明 , P450 2C9 具有遗传多态性 ,有几种等位基因突变 体 ,最 主 要 有 3 种 , 即 野 生 型 P450 2C9 3 1, 突 变 体 P450 2C9 3 2 (A rg144Cys)和 P450 2C9 3 3 突变体 ( Ilu359Leu) 。最近发现 [ 2 ] , P450 2C9等位 基 因 突 变 体 还 有 P450 2C9 3 4 ( Ile359Thr) 、P450 2C9 3 5 (A sp360Glu)和 P450 2C93 6 ( △A818)突变体 。细胞色素 P450 2C9酶 的基因多态性是引起酶活性个体差异的重要因素 ,基因变异者的酶活 性可明显降低 ,对 P450 2C9底物的代谢能力下降 。现常用限制性片段 长度多态性分析 (RELP - PCR )法检测 P450基因多态性 [ 3 ] 。
© 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
Chin J Clin Pharmacol
Vol. 21 No. 3,M ay 2005 ( Serial No. 95)
177
基因芯片技术是近年来发展起来的一种快捷 、方 便的基因突变检查技术 ,广泛应用于基因多态性分 析 ,可以极大的提高基因检测的速度 [ 4 ] 。本研究用基 因芯片技术检测中国健康人群的 P450 2C9基因突变 情况 ,改进原有的 P450 2C9基因多态性检测方法 ,并 研究中国健康人群 P450 2C9基因的变异情况 。
9 (8 /1) 1 (0 /1)
Age ( year) 31. 9 ±5. 1 33. 7 ±6. 2
35
Compared w ith 3 kind of volunteers, P > 0. 05
Body height( cm ) 165. 4 ±6. 3 168. 0 ±6. 0
jing 100853, Ch ina; 3. B eijing Institu te of R ad ia tion M ed icine, A cadem y of M ilita ry M ed ica l S ciences, B eijing 100850, Ch ina)
收稿日期 : 2004 - 09 - 06 修回日期 : 2005 - 03 - 30 基金项目 : 国家 863计第 21卷 第 3期 2005年 5月 (总第 95期 )
用基因芯片技术测定健康人群 P450 2C9 基因多态性
D eterm ina tion of the P450 2C9 genetic polym orph ism s in hea lthy volun teers utiliz ing oligonucleotide m icroarray
Abstract: O bjective To study the P450 2C9 genetic polymorphism s in Chinese healthy volunteers using oligonucleotide m icroarray. M ethods P450 2C9 genotype was determ ined by oligonucleotide m icroarray. Part of the genotyp ing results was confirm ed by direct sequencing. Results N ine heterozygous alleles of P450 2C93 1 / 3 3 and 1 homozygous mutant alleles were found in 169 subjects. No mutant alleles of P450 2C93 2, P450 2C9 3 4 and P450 2C93 5 were detected. Conclusion O ligonucleotide m icroar2 ray was reliable for determ ination of P450 2C9 genetic polymorphism s. The P450 2C93 3 allele frequency was 0. 03 in Chinese. Key words: P450 2C9; genetic polymorphism s; oligonucleotide m icroarray
( 2002AA2Z341L ) 作者简介 : 陈马昆 ( 1977 - ) , 男 , 博 士 研 究
生 ,主要从事临床药理学研究 通讯作者 : 王睿 ,研究员 ,博导
Tel: ( 010) 66939409 E - mail: wangrui301@vip. sina. com
摘要 :目的 探讨基因芯片技术在 P450 2C9基因分型中应用的可行性 ,研究中 国人群 P450 2C9基因多态性 。方法 用基因芯片技术测定 169例中国健康志 愿者 P450 2C9基因分型 ,并用直接测序法对结果进行验证 。结果 169例中国 健康志愿者中 ,共发现 9名 P450 2C93 1 / 3 3基因型 , P450 2C93 3 / 3 3基因型 1名 ,无 P450 2C93 2, P450 2C93 4 和 P450 2C93 5变异 。结论 基因芯片法 适用于中国健康人群 P450 2C9基因分型研究 ,健康人群 P450 2C93 3等位基因 频率为 0. 03。 关键词 : P450 2C9; 基因多态性 ; 基因芯片 中图分类号 : R319; R977. 15 文献标识码 : A 文章编号 : 1001 - 6821 (2005) 03 - 0176 - 04
te, O cean U n iversity of Ch ina,
Q ingdao 266003, Ch ina; 2, D e2
pa rtm en t of C lin ica l Pha rm acology,
Ch inese PLA Genera l Hospita l, B ei2
经测序确证重组质粒为野生型 。以野生型重组 质粒为模板 ,用突变引物 PCR扩增产生定点突变的方 法 [ 5 ] ,在目标片段的特定位点引入突变碱基 ,纯化目 标片段 ,用 T4 DNA 连接酶连接至 PGEM ( r) T4 - vec2 tor,转化感受态大肠杆菌 JM109。经测序确证重组质 粒为突变型 。
3. 3 杂交和信号检测
Cy3 - 标记的单链 PCR 产物与杂交液 ( 5 ×SSC, 0. 1% SDS, 1 ×Denhart试剂 ) 混合 ,将混合液 10μL 转 移至芯片的杂交区域 。芯片置于杂交盒中 ,在 45℃水 浴中保温 1 h。杂交后的芯片依次在洗液 A (1 ×SSC, 0. 2% SDS) 、洗液 B ( 0. 2 ×SSC) 和洗液 C ( 0. 1 × SSC)中各洗涤 1 m in。芯片用共聚焦扫描仪在激发波 长 540 nm、发射波长 570 nm 扫描 。产生并分析精度 为 10 μmo l·L - 1的 16 位 TIFF图象 。在扣除背景值 后 ,信号强度以每条探针的重复 2点的均值计算 。
Ta b le 1. Com p a riso n o f co nd itio n o f the 63 he a lthy p a rtic ip a n ts
Item P450 2C93 1 / 3 1 P450 2C93 1 / 3 3 P450 2C93 3 / 3 3
Sex ( M / F) 159 ( 113 /36)
2 试验对象
筛选 169 名健康志愿者 ,男女不限 ,年龄 18 ～43 岁 ,身高 150～183 cm ,体重 50～84 kg,均在标准范围 内 。受试者自愿签署知情同意书 。
3 用基因芯片法测定 P450 2C9基因型
3. 1 D NA纯化及质粒构建
用 DNA 纯化试剂盒从全血中提取 DNA; 用紫外 分光光度计定量后冻存于 - 20℃备用 。寡核苷酸 (引 物或探针 )用标准亚磷酰胺化学方法在自动合成仪上 合成 。所有荧光引物在合成中用 Cy3 亚磷酰化试剂 在 5′端进行标记 。以基因组 DNA 为模板的 PCR扩增 产物纯化后用 T4 DNA 连接酶连接至 PGEM ( r) T4 vector,转化感受态大肠杆菌 JM109。
3. 2 寡核苷酸芯片制备
标准载玻片用重铬酸洗液浸泡过夜 ,蒸馏水清 洗 ,依次用 25%氨水溶液和 1mol·L - 1的盐酸水溶液 浸泡 8 h,蒸馏水清洗 。将洁净的载玻片浸入氨丙基 三甲氧基硅烷的 95%的乙醇溶液中 ,冰醋酸调节 pH 至 4. 5,室温处理 30 m in。95%乙醇超声清洗 ,蒸馏水 超声清洗 , 115 ℃烘干 。将氨基化载玻片浸入 5%的 戊二醛水溶液 ,室温处理 30 m in。M illi - Q 超纯水清 洗 。室温干燥备用 。将探针用点样液〔3 ×NaC1 /柠檬 酸缓冲 液 pH 7. 0 ( SSC ) , 0. 01% 十 二 烷 基 磺 酸 钠 ( SDS) 〕稀释至终浓度为 30 μmol·L - 1 ,并取 10 μL 转移至 96 孔板 。用芯片点样仪点至醛基化玻片上 , 每点体积约为 0. 5 nL ,直径约为 200 μm ,重复点 2 次 。点样时保持湿度 70% ,温度 23℃ 。点样后的芯 片在使用前室温放置至少 24 h。
材料 、对象与方法
1 材料与仪器
DNA 纯化试剂盒 , PCR 产物纯化试剂盒 ,均购自 美国 Promega公司 ; DNA 测序试剂盒 ,购自德国 B eck2 man公司 ;其余试剂均为国产分析纯 。
紫外分光光度计 , 购自德国 B eckman Coulter公 司 ; AB i 8909 自动核酸合成仪 ; 2000XL DNA 测序仪 , 均购自德国 Beckman公司 ; PCR 扩增仪 ,购自意大利 MJ. Reseach公司 ; 3000 GSI共聚焦扫描仪 ,购自美国 Lumonics公司 。
4 DNA 测序
对于变 异 和 部 分 正 常 志 愿 者 的 DNA 样 本 , 用 DNA 测序法验证基因芯片测定的结果 。取 PCR 反应 产物 50μL ,用 PCR产物纯化试剂盒得 DNA 样品 ,用 DNA 测序仪 ,按 DNA 测序试剂盒操作说明进行 。
结 果
1 基本情况
169例志愿者完成 ,本试验均为中国汉族志愿者 , 男性 121 例 ( 71. 6% ) ,女性 48 例 ( 29. 4% ) ,年龄为 (32. 2 ±6. 3)岁 ,身高 ( 166. 1 ±6. 6) cm ,体重 ( 63. 7 ± 7. 2) kg。比较不同 P450 2C9基因型志愿者的基本情 况 ,经 t检验和 χ2 检验无统计学差异 (表 1) 。
陈 马昆 1 , 王 睿 2 , 文思远 3 , 李 健 3 , 王升启 3
(1. 中国海洋大学 海洋药物与食品研究 所 ,山东 青岛 266003; 2. 解放军总医院 临床药理室 ,北京 100853; 3. 军事医学 科学院 放射医学研究所 ,北京 100850)
CHEN Kun1 , WAN G Rui2 , W EN Si - yuan3 , L I J ian3 , WANG Sheng - qi3
P450 2C9是人体中重要的药物代谢酶 ,其在人肝微粒体中含量丰 富 ,约占 P450总量的 20%。 P450 2C9能代谢许多不同性质的药物 ,如 S - 华发令 、苯妥因 、甲苯磺丁脲 、洛沙坦以及非甾类抗炎药等 ,并在前 致癌物 、前毒物和致突变剂的活化中也起一定作用 [ 1 ] 。
大量研究表明 , P450 2C9 具有遗传多态性 ,有几种等位基因突变 体 ,最 主 要 有 3 种 , 即 野 生 型 P450 2C9 3 1, 突 变 体 P450 2C9 3 2 (A rg144Cys)和 P450 2C9 3 3 突变体 ( Ilu359Leu) 。最近发现 [ 2 ] , P450 2C9等位 基 因 突 变 体 还 有 P450 2C9 3 4 ( Ile359Thr) 、P450 2C9 3 5 (A sp360Glu)和 P450 2C93 6 ( △A818)突变体 。细胞色素 P450 2C9酶 的基因多态性是引起酶活性个体差异的重要因素 ,基因变异者的酶活 性可明显降低 ,对 P450 2C9底物的代谢能力下降 。现常用限制性片段 长度多态性分析 (RELP - PCR )法检测 P450基因多态性 [ 3 ] 。
© 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.
Chin J Clin Pharmacol
Vol. 21 No. 3,M ay 2005 ( Serial No. 95)
177
基因芯片技术是近年来发展起来的一种快捷 、方 便的基因突变检查技术 ,广泛应用于基因多态性分 析 ,可以极大的提高基因检测的速度 [ 4 ] 。本研究用基 因芯片技术检测中国健康人群的 P450 2C9基因突变 情况 ,改进原有的 P450 2C9基因多态性检测方法 ,并 研究中国健康人群 P450 2C9基因的变异情况 。
9 (8 /1) 1 (0 /1)
Age ( year) 31. 9 ±5. 1 33. 7 ±6. 2
35
Compared w ith 3 kind of volunteers, P > 0. 05
Body height( cm ) 165. 4 ±6. 3 168. 0 ±6. 0
jing 100853, Ch ina; 3. B eijing Institu te of R ad ia tion M ed icine, A cadem y of M ilita ry M ed ica l S ciences, B eijing 100850, Ch ina)
收稿日期 : 2004 - 09 - 06 修回日期 : 2005 - 03 - 30 基金项目 : 国家 863计第 21卷 第 3期 2005年 5月 (总第 95期 )
用基因芯片技术测定健康人群 P450 2C9 基因多态性
D eterm ina tion of the P450 2C9 genetic polym orph ism s in hea lthy volun teers utiliz ing oligonucleotide m icroarray
Abstract: O bjective To study the P450 2C9 genetic polymorphism s in Chinese healthy volunteers using oligonucleotide m icroarray. M ethods P450 2C9 genotype was determ ined by oligonucleotide m icroarray. Part of the genotyp ing results was confirm ed by direct sequencing. Results N ine heterozygous alleles of P450 2C93 1 / 3 3 and 1 homozygous mutant alleles were found in 169 subjects. No mutant alleles of P450 2C93 2, P450 2C9 3 4 and P450 2C93 5 were detected. Conclusion O ligonucleotide m icroar2 ray was reliable for determ ination of P450 2C9 genetic polymorphism s. The P450 2C93 3 allele frequency was 0. 03 in Chinese. Key words: P450 2C9; genetic polymorphism s; oligonucleotide m icroarray
( 2002AA2Z341L ) 作者简介 : 陈马昆 ( 1977 - ) , 男 , 博 士 研 究
生 ,主要从事临床药理学研究 通讯作者 : 王睿 ,研究员 ,博导
Tel: ( 010) 66939409 E - mail: wangrui301@vip. sina. com
摘要 :目的 探讨基因芯片技术在 P450 2C9基因分型中应用的可行性 ,研究中 国人群 P450 2C9基因多态性 。方法 用基因芯片技术测定 169例中国健康志 愿者 P450 2C9基因分型 ,并用直接测序法对结果进行验证 。结果 169例中国 健康志愿者中 ,共发现 9名 P450 2C93 1 / 3 3基因型 , P450 2C93 3 / 3 3基因型 1名 ,无 P450 2C93 2, P450 2C93 4 和 P450 2C93 5变异 。结论 基因芯片法 适用于中国健康人群 P450 2C9基因分型研究 ,健康人群 P450 2C93 3等位基因 频率为 0. 03。 关键词 : P450 2C9; 基因多态性 ; 基因芯片 中图分类号 : R319; R977. 15 文献标识码 : A 文章编号 : 1001 - 6821 (2005) 03 - 0176 - 04