香豆素分析

OH COOH
-H2O 7 6 5 4 8 1
O
2 3
Oห้องสมุดไป่ตู้

分子中苯核或α- 吡喃酮环上常有取代基存在， 如羟基、烷氧基、苯基、异戊烯基等
香豆素按结构分为
简单香豆素——只在苯环上有取代基的 呋喃香豆素 —— 线型（6、7～）； 角型（7、8～） 吡喃香豆素——线型（6、7～）； 角型（7、8～） 其他香豆素—— α－吡喃酮环上有取代基的
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三、高效液相色谱法
1．白芷中3种香豆素的测定 测定氧化前胡素（oxypeucedanin，Ⅰ）， 欧前胡素（imperatorin，Ⅱ）和异欧前胡素（ isoimperatorin，Ⅲ），其方法是：准确称取Ⅰ 、Ⅱ、Ⅲ标准品各5mg，用乙酸乙酯溶解，定 容至50ml，分别取此溶液0.5、1.0、1.5、2.0、 2.5、3.0ml，均用乙酸乙酯定容至10m1，制得 6 个不同浓度的标准溶液。
OH
紫苜蓿酚
茵陈炔
二、 分布

香豆素类成分广泛分布于植物界，如伞形 科、夹竹桃科、萝藦科、菊科、十字花科、杜 鹃花科、豆科、唇形科、兰科、禾本科、芸香 科、蔷薇科、茄科、无患子科、瑞香科等植物 中均有较多分布。 含有香豆素类化合物的常用中药有白芷、秦 皮、独活、前胡、阿魏、当归、补骨脂、茵陈 蒿、川芎、防风、蛇床子等。
2．紫外光区扫描法测定独活中蛇床子素含量 取独活粗粉约1g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 加乙醇 20ml ，超声处理 30min ，放冷，滤过，滤液 置25ml量瓶中，用少量乙醇分次洗残渣，洗液并入 同一量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶 液。另取蛇床子素对照品适量，精密称定，加乙醇 制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。 精密吸取供试品溶液2μl、对照品溶液1μl与2μl， 分别交叉点于同一硅胶G薄层板上，以苯-乙酸乙酯 （ 30 ： 1 ）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外 光灯（365nm ）下检视定位，照薄层色谱法进行扫 描，λs322nm，λR370nm，测量供试品吸收度积分值 与对照品吸收度积分值，计算，即得。 本品含蛇床子素（C15H16O3）不得少于0.30%。
薄层色谱法
1．应用特点
薄层色谱法可用于含多类成分的中药的鉴别，可用标准 品或标准药材对照，再与上述荧光反应、颜色反应配合， 即可方便、快速鉴别含香豆素类化合物的中药。 因香豆素类成分大都具荧光，含香豆素类中药提取物， 在硅胶板上的色谱指纹图具一定的鉴别意义， 可用化学对照品对照； 可以使用经准确鉴定学名的标准药材做对照品；
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二．薄层色谱法
1．荧光扫描法测定蛇床子中蛇床子素含量 精密称取在 P2O5 干燥器中减压干燥至恒重的蛇 床子粉末 1g ，置具塞锥形瓶中 ，精密加入乙醇 20ml ，振摇后放置过夜，滤过，取续滤液，作为 供试品溶液。另取蛇床子素对照品适量，精密称 定，加乙醇制1mg/ml的溶液，作为对照品溶液。 精密吸取上述两种溶液各1μl，分别交叉点于同 一硅胶Ｇ薄层板上，以苯- 乙酸乙酯（30：1）为 展开剂，展开，取出，晾干。 照薄层色谱法进行荧光扫描，激发波长λX365nm ，测量供试品与对照品荧光强度积分值. 本品含蛇床子素（C15H16O3）不得少于1.0％ 。 34

三、理化性质
1 2
通性 与碱的反应
3 4
显色反应
荧光与紫外吸收
1
通性
多具芳香气，能随水蒸气挥发或升华。
不溶于水或难溶于水，可溶于石油醚、苯、 乙醚、氯仿或乙醇等溶剂中；一般含氧取代 基的香豆素衍生物，在石油醚中的溶解度比 较小，冷的情况下更小。 在定量测定时，多用氯仿和乙醇来提取。
硅胶薄层色谱常用的展开系统有：

氯仿； 含1.5%乙醇氯仿； 乙醚- 苯（1：1）； 乙醚- 苯- 10%乙酸（1：1：1）等
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2、应用实例
白芷的薄层定性分析 取白芷粉末0.5g，加乙醚10ml，浸泡1h，时时振 摇，滤过，滤液挥干乙醚，残渣加醋酸乙酯1ml使 溶解，作为供试品溶液。另取欧前胡素、异欧前 胡素对照品，加醋酸乙酯制成每 1ml 各含 1mg 的混 合溶液，作为对照品溶液。 吸取上述两种溶液各4µl，分别点于同一以羧甲 基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚 （30~60℃）- 乙醚（3：2）为展开剂，在25℃以 下展开，取出，晾干，置紫外光灯（365nm）下检 视。供试品色谱中，在与对照品色谱相对应的位 置上，显相同颜色的斑点。
OCH3 CH3O
OCH3
O
O
O
O O O
O
O
O
异补骨脂内酯 茴芹内酯
异佛手内酯
（三）吡喃香豆素类

基本结构为香豆素母核苯环与吡喃环稠合， 也分为线型和角型。
1．6,7-吡喃香豆素（线型）

C6、C7位与吡喃环稠合（6位异戊烯 基与7位羟基环合）的衍生物。
O OCH3 O O
O
O
O
花椒内酯
美花椒内酯
OH O O
-

OH OCOO
-
-
COOO-
H+
顺式邻羟基桂皮酸
反式邻羟基桂皮酸
3
显色反应
（1）异羟基肟酸铁反应： 因香豆素具有内酯环，所以能与异羟基肟酸铁 反应，产生紫红色，可被用来鉴别和比色测定， 其反应如下：
NH2OH O O NaOH NH ONa O OH Fe
3+
,H
+
NH ONa O O Fe 1 3
一．荧光分光光度法
1、应用概况

香豆素类化合物在紫外光的照射下显蓝色荧光， 可用荧光分光光度法测定。如 7- 羟基香豆素和香 豆素混合物的测定，前者用370nm激发，在450nm 测定，浓度为 1~10µg／ ml 时荧光与浓度成线性失 系。后者用361nm激发，在491nm测荧光。 如果香豆素7位上有乙氧基（代谢产物）可使其变 为7- 羟基香豆素用390nm激发，440nm测定。
2．7,8-吡喃香豆素（角型）

C7、C8位与吡喃环稠合（8位异戊烯基与 7位羟基环合）的衍生物。
OCH3 O
O
O
O
O
O
O
O
邪蒿内酯
黄曲霉素B1
（四）其他香豆素类

具有抗凝血作用的紫苜蓿酚 (sativol) 属双 香豆素类；茵陈炔 (capillone) 属异香豆素 类。
O O O O
O O
OH
（2）酚类试剂反应： 因该类化合物多具酚羟基，能和常规酚类试剂 反应，如三氯化铁、硝酸银的氨溶液、三氯化铁 铁氰化钾。 如果香豆素化合物的C6位上（即酚羟基的对位） 没有取代基，则能和 Emerson试剂反应现橙~红色； 与Gibbs试剂反应现蓝色。 Emerson反应是将香豆素类化合物溶于碱性溶液 中，加入2% 4- 氨基安替比林溶液数滴及8%铁氰化 钾溶液2~3滴即可显色，其反应如下：
1．6,7-呋喃香豆素（线型）

C6、C7位与呋喃环稠合（6位异戊烯基 与7位羟基环合，降解失去三个碳原子） 的衍生物，称为线型。
O O O
O OCH3 O O
H3C HO CH3
O
O
O
补骨脂内酯
花椒毒内酯
紫花前胡内酯
2．7,8-呋喃香豆素（角型）

C7、C8位与呋喃环稠合（8位异戊烯基 与7位羟基环合）的衍生物，称为角型。
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第三节 香豆素定量分析
含香豆素成分的中药定量测定方法有比色法、荧 光法、极谱法、紫外分光光度法、薄层色谱法、高 效液相色谱法、气相色谱法等。 每种方法都有其特点，有的简单，有的操作麻烦， 有的则需要一定的仪器设备。 相比之下，因该类成分多具有较强的荧光，故可 荧光分光光度法进行定量分析；薄层扫描法测其紫 外吸收或荧光的方法较简便快速，兼有分离功能， 应用日趋普遍；近年来又有了分离效率较高的高效 液相色谱技术，对复杂的中药样品更为合适。

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2．应用实例
（1）佛手油中的香豆素分析 可用硅胶GF254薄层分离，以己烷- 醋酸乙酯 （3：1）展开，分出4个荧光点即：柠美内酯（ Citropten）Ⅰ；5- 牻牛儿氧基-7-甲氧基香豆素（5geranyloxy-7-methydroxycoumarin）Ⅱ；佛手内酯Ⅲ 和佛手柑亭（bergamottin）Ⅳ，可直接在薄层上进 行荧光测定，对于Ⅰ和Ⅱ用330nm激发，424nm测 定荧光，Ⅲ和Ⅳ用272nm激发，520nm测定。
按下述条件进行HPLC分析：以µ-Bondapak C18柱为色谱 分离柱，加预柱以防样品污染分析柱，流动相为甲醇- 水 （70：30），流速1.0ml／min，UV 254nm检测各组分峰， 进样 10µl，以峰面积为纵坐标，各成分浓度为横坐标， 得3条通过原点的直线，线性范围0.005 ~ 0.05mg／ml，其 回归方程如下： 氧化前胡素 Y = 1521X + 25.40， r = 0.999 欧前胡素 Y = 1953X + 76.53， r = 1.000 异欧前胡素 Y = 1930X + 53.73， r = 0.999 精密称取白芷粉（40目）2g，置索氏提取器中，用乙 醚提取9h，回收乙醚，真空干燥，残渣溶于乙酸乙酯并 定容成25ml，经Millipore样品过滤器过滤，同上色谱条件 测定。标准品与样品分离情况（见图 13-1）较好。
*
（2）羟基香豆素在紫外光下有强的荧光，不难辨 认；呋喃香豆素较弱，但也能在紫外光下显示蓝、 紫、棕、绿、黄等色。必要时可喷10% KOH醇液， 或20% SbCl3氯仿液以显色。 （3）香豆素类化合物羟基和芳环形成的共轭体系 具较强的紫外特征吸收，不同的香豆素化合物在 不同pH条件下表现不同的光谱特性，对该类成分 的分析具重要意义。
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