原代培养和传代培养
(细胞工程)名词解释
一、名词解释细胞工程:是应用细胞生物学和分子生物学和分子生物学的理论和方法，按照人们的设计蓝图，在细胞水平上的遗传操作及进行大规模的细胞和组织培养。
通过细胞工程可以生产有用的生物产品或培养有价值的植株，并可以产生新的物种或品系。
外植体:是指用于离体培养的活的植物组织、器官等材料。
植物组织培养：（广义）又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织.器官或细胞，原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
（狭义）组培指用植物各部分组织，如形成层.薄壁组织.叶肉组织.胚乳等进行培养获得再生植株，也指在培养过程中从各器官上产生愈伤组织的培养，愈伤组织再经过再分化形成再生植物。
愈伤组织：在离体培养过程中形成的具有分生能力的一团不规则细胞，多在外植体切面上产生。
胚状体〔embroid〕:—对应于胚〔embryo〕，在离体培养过程中产生一种形似胚（具有明显的根端和芽端），功能与胚相同的结构。
离体无性繁殖：是在人工控制的无菌条件下，使植物在人工培养基上繁殖的技术。
跟常规的繁殖方法相比它是一种微型操作过程，因此，有时就直接称之为微繁继代培养：更换新鲜培养基来繁殖同种类型的材料（愈伤组织.芽等）。
细胞分化:指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。
细胞脱分化:已分化好的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力，回复到分化组织状态的过程。
细胞再分化:脱分化后具有分生能力的细胞再经过与原来相同的分化过程，重新形成各类组织和器官的过程。
人工种子:亦称体细胞种子。
早期的人工种子概念是：体细胞胚经过人工种皮包被后而形成的体细胞种子。
现在指任何一种经人工种皮包被或裸露的，具有形成完整植株能力的繁殖体均可称之为人工种子。
植物细胞全能性:指每个植物细胞都具有形成完整植株的能力，因为每个细胞都具有全套的遗传基因，无论是性细胞还是体细胞在特定条件下可以进行表达。
细胞生物学 名词解释
细胞生物学复习资料一、名词解释：1.分辨率：是指能够区分相近两点的最小距离。
2.原代培养：直接从体内获取的组织或细胞进行首次培养。
3.传代培养：当原代细胞经增殖达到一定密度后，将细胞分散，从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养。
4.细胞系：通常来源于恶性肿瘤组织的细胞能够在体外无限繁殖、传代。
5.细胞膜：是包围在细胞质表面的一层薄膜，又称质膜。
6.内膜系统：是真核细胞的膜相结构中，除了细胞和线粒体外，那些在发生、形态、结构和功能上相互联系的膜相细胞器。
7.生物膜：目前把质膜和细胞内膜系统总称为生物膜。
8.单位膜：电子显微镜下，生物膜呈“两暗夹一明”的形态结构。
9.脂质体：为避免双分子层两端疏水尾部与水接触，其游离端往往能自动闭合，形成充满液体的球状小泡。
10.主动运输：细胞膜利用代谢产生的能量来驱动物质的逆浓度梯度的转运。
11.被动运输：多种载体蛋白和通道蛋白介导溶质穿膜转运时不消耗能量。
12.膜转运蛋白：细胞膜中有特定的膜蛋白负责转运细胞代谢产物。
13.Na+-K+泵：又称Na+-K+-ATP酶，是由α亚基和β亚基构成，α亚基分子量为120kD，是一个多次穿膜的膜整合蛋白，具有ATP酶活性。
β亚基分子量为50kD，是具有组织特异性的糖蛋白，并不直接参与离子的穿膜转运。
14.胞吞：细胞摄入大分子或颗粒物质的过程。
15.胞吐：细胞排出大分子或颗粒物质的过程。
16.受体介导的胞吞：是细胞通过受体的介导选择性高效摄取细胞外特定大分子物质的过程。
17.微粒体：应用超速分级分离的方法，可从细胞匀浆中分离出直径在100nm左右的球囊状封闭小泡。
18.信号肽：是指导蛋白多肽链在糙面内质网上合成与穿膜转移的决定因素。
19.信号识别颗粒：参与核糖体与内质网的结合以及肽链穿越内质网膜的转移。
20.初级溶酶体：是指通过其形成途径刚刚产生的溶酶体。
21.次级溶酶体：当初级溶酶体经过成熟，接受来自细胞内、外的物质，并与之发生相互作用时，即成为次级溶酶体。
细胞的原代培养
细胞原代培养【实验目的】1.理解细胞原代培养原理2.熟悉细胞原代培养方法与过程3.了解细胞原代培养的应用4.独立进行细胞原代培养操作【实验原理】1、原代培养实验原理细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一，可分为原代培养和传代培养两种。
原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养，即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。
由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。
这一方法可为研究生物体细胞的生长，代谢，繁殖提供有力的手段。
同时也为以后传代培养创造条件。
原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后，经机械法或各种酶类（常用胰蛋白酶）和鳌合剂（常用EDTA)处理，使之分散成单个细胞,加入适量培养基，置于合适的培养容器中，在无菌、适当温度和一定条件下，使之生存、生长和繁殖的过程。
原代培养的方法有：a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎，每个组织块小于1mm3大小。
用Hanks液洗涤2—3次，自然沉淀。
用吸管吸去上清液。
将组织块贴于培养瓶进行培养。
b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的0.125%的胰蛋白酶。
370C磁棒搅拌消化20－30分钟。
然后终止消化。
用几层无菌纱布过滤。
取过滤液，离心800rpm 5—10分钟收集细胞。
弃上清，加入带有双抗的培养基，放入培养瓶培养。
【实验仪器、材料、试剂及用品】1.仪器：荧光显微镜，CO2培养箱2.材料：孕鼠3.试剂：(1) 培养液：为DMEM，添加10％新生牛血清(NBS)、青霉素100 u／ ml 、链霉素100ug／ml。
(2)消化液：为0.125％胰蛋白酶—0.02％EDTA 混合消化液。
4.用品：镊子，剪刀，培养瓶，试管，移液管，巴斯德吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯、小指管。
【实验步骤】(一)小鼠胚胎的准备:1.取怀孕16～18d的母鼠，断颈处死，置于75%的酒精中。
医学-细胞原代培养与传代
2 细胞的生存环境
温度: 37 ℃
O2
CO2: 5%
CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3-
pH: 7.2-7.4
渗透压
3 无污染
4 无毒
常用仪器设备
超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管
原代培养与细胞系
原代培养
（primary cultureபைடு நூலகம் 从动物机体取出的进 行培养的细胞群。生 长缓慢，繁殖一定的 代数后（一般10代以 内）停止生长。
细胞株
（cell strain） 从原代培养细 胞群中筛选出 的具有特定性 质或标志的细 胞群，能够繁 殖50代左右， 在培养过程中 其特征始终保 持。
目录
一． 细胞培养基本概念 二． 细胞培养基本要求 三． 细胞培养基本技术
细胞培养定义
定义：
模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其 生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程 等问题的研究。
优点：
1．活细胞：同时、大量、均一性、重复性； 2．可控制： 各种物理、化学、生物等因素可调控； 3．研究方法多样：倒置、荧光、电子、激光共焦显微镜、流式细胞术、
血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白 （生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底 物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。
进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）
潜伏期
此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。细胞株潜伏期 一般为6～24小时。
细胞传代实验报告
细胞传代培养一.实验目的初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程，为生物技术在医学上的应用打下基础。
二、原理从生物体中取出某种组织或细胞，模拟体内生理条件，在人工培养条件下使其生存、生长、繁殖或传代，这一过程称为细胞培养。
细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接观察活细胞，并在有控制的环境条件下进行实验，避免了体内实验时的许多复杂因素，还可以与体内实验互为补充，可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象，耗费少，比较经济，因此成为生物学研究的重要手段。
细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。
直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养，即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。
细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。
所有离体细胞的生长都受温度、渗透压、ph值、无机盐影响，消毒、配液等均有严格的规X和要求，特别是无菌操作是细胞培养成败的关键。
三、材料和试剂1、细胞：293细胞株2、试剂：0.25％胰酶、1640培养基〔含10％小牛血清〕3、仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、电动枪，培养板，吸液枪，5ml玻璃吸管、酒精灯等四、操作步骤1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。
2、加入1~2ml 0.25％胰酶溶液，使板底细胞都浸入溶液中。
3、马上吸走胰酶液，再次加入2ml左右的胰酶，同样马上吸去，再加入几滴胰酶放入培养箱中消化几分钟4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液，再按照观察的生长情况确定的传代比例传代5.根据确定的比例来取需要的量〔剩余的细胞拿来做细胞计数〕，加入4ml左右的培养液6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后，将培养板放入培养箱7.收拾整理超净台附：消化液配制方法：称取2.5克胰酶蛋白酶，加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l，滤器过滤除菌，4℃保存，用前可在37℃下回温。
【2017年整理】平滑肌细胞原代培养、传代、冻存方法及所需试剂
01年中国现代医学杂志贴壁法原代培养1.1细胞培养1.1.1培养液配制DMEM(美国Corning Cellgro公司),Hepes(15mmol/L),青霉素(100u/ml),链霉素(100mg/ml),优质胎牛血清(原代培养浓度20%,传代培养浓度10%,上海普飞澳洲胎牛血清)。
1.1.2培养器皿25cm2塑料培养瓶(Costar),培养面积25cm2;直径3.5cm培养皿。
1.1.3大鼠血管平滑肌细胞培养动物来源:健康Wistar大鼠,由第三军大学实验动物中心提供,雌雄不拘,体重150~180g。
动脉取材:断颈法处死Wis-tar大鼠,无菌条件下分离全段主动脉,立即置于含青霉素100u/ml,链霉素100mg/ml的无菌生理盐水中。
每次取材2~3只大鼠。
贴壁法原代培养:超净工作台上,清除结缔组织,剥除动脉外膜。
纵向剖开血管,用眼科弯镊钝性刮除内膜面,以去除内皮细胞,剩余血管中膜组织较薄、透明、韧性好。
用含青、链霉素的生理盐水反复冲洗,去除脂滴、血凝块等杂质及可能残留的内皮细胞和外膜成纤维细胞,然后将一次取材的2~3条血管的中膜组织混合在一起,置于无菌培养皿中。
滴加少许培养液使组织保持湿润,用眼科弯剪反复剪切成1mm×1mm大小的组织块。
并剪切好的组织小块均匀摆置于瓶底,组织块间距0.5cm。
盖好瓶盖,轻轻翻转培养瓶,让瓶底朝上并向瓶内注入适量培养液,于37℃孵箱内放置2~4h使组织块干涸并与瓶壁贴附后,将培养瓶慢慢翻转平放,使组织块完全浸入培养液中,继续静置培养3~5d。
待有细胞从组织块周围游出后换液。
1.1.4原代培养动脉VSMC的传代培养当大部分组织块长出细胞晕,并与相邻细胞的细胞晕接触时即可传代。
加入配制好的消化液使其恰好覆盖细胞表面,室温下大约1~2min,倒置显微镜下见细胞质回缩、细胞间隙增大时迅速翻转培养瓶使细胞脱离消化液,吸弃消化液,加入含胎牛血清培养液3~4ml终止消化并反复吹打瓶壁细胞使细胞脱壁,分散为单细胞悬液。
安立国第二版动物细胞工程思考题参考答案
哺乳动物的克隆方法：胚胎干细胞核移植、胚胎细胞核移植、胎儿成纤维细胞核移植、体细胞核移植。
第一章绪论课后习题答案1. 动物细胞工程主要有哪些内容？这些技术有何用途？答：1. 组织和细胞培养技术2. 细胞融合与单克隆抗体技术3. 细胞核移植技术4. 胚胎工程技术5. 干细胞技术6. 转基因技术7. 染色体工程细胞工程的应用有：A. 单克隆抗体的应用：疾病诊断与治疗、微量大分子物资的检测、贵重生物活性物的分离与提纯、特殊疾病治疗、与药物交联治疗疾病；B. 转基因技术的应用：建立疾病的动物模型、品种改良和抗病育种、“乳腺生物发应器”、基因代替治疗、异种器官移植、基因功能研究；C. 细胞与组织替代治疗；D. 治疗人类不孕症；E. 优良品种繁育；F. 生产转基因家畜；G. 保护濒危动物。
2.追踪动物细胞工程研究与应用的最新进展，并预测其发展趋势。
第二章细胞培养1、体外培养细胞有哪些类型？其生长特点有什么区别？答：体外培养的细胞根据其生长方式，主要分为贴壁生长型细胞和悬浮生长型细胞。
离体细胞必须贴附于底物上才能生长的细胞称为贴壁生长型细胞。
有机体的绝大部分细胞必须贴附在某一固相表面才能生存和生长。
动物细胞培养中，大多数细胞必须贴附在固相表面才能生长，当细胞布满表面后即停止生长。
从生长表面脱落进入液体得细胞通常不再生长而逐渐退化，这种细胞称为单层附壁细胞。
贴壁生长的细胞在活体体内时，形态各异，而体外培养状态下则在形态上比较单一而失去其在体内时原有的特征。
按照培养细胞的形态，主要可分为以下几类：成纤维细胞型、上皮型细胞、游走型细胞、多形型细胞；少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，如血液白细胞、淋巴组织细胞、某些肿瘤细胞、杂交瘤细胞、转化细胞等，这些细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察使细胞呈圆形。
由于悬浮生长于培养液中，因此其生存空间大，具有能够提供繁殖大量细胞、传代方便、易于收获细胞等优点，易于大规模生产，便于过程的控制。
细胞工程名词解释
14.植物细胞培养：在离体条件下将植物的单个细胞或小的细胞团在培养基中进行培养在使其增值的一种技术。
15.细胞悬浮培养：单个的游离细胞或细胞团在液体培养基中进行培养的技术。（用胚，胚轴，子叶）
16.固定化培养技术：将游离的细胞包埋在多糖或多聚化合物制备成的网状支持物中，培养液呈流动状进行无菌培养的一门技术。
29. 单克隆抗体：像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限增殖，又能持续地分泌特异性抗体，通过克隆化可使杂交细胞成为单纯的细胞系。由此单克隆细胞系统就可以获得结构与各种特性完全相同的高纯度抗体，即单克隆抗体。
30.胚胎工程：主要是哺乳动物的胚胎进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物的技术。
1.细胞株：从原代培养或细胞系获得的具有特定性质或标志，并在随后培养期间始终保持具有其特性的细胞。
2.细胞系：从初代培养产生的能进行无限次传代培养的细胞群。
3.密度抑制：随着细胞密度进一步增大，细胞内因营养枯竭和代谢产物的影响抑制正常细胞分裂的现象。
4.接触抑制：随着细胞数量的不断增多，相互接触融成片，正常细胞由于接触限制运动的现象。
17.原生质体：除去了细胞壁后的得到裸露的球形细胞。（植物细胞与动物细胞相比多具有的一层细胞壁）
18.人工种子：最外面包裹一层有机膜，保护水分免于丧失和防止外部力量冲击中间含有培养物所需的营养和某些植物激素，最内侧是被包裹的胶状体或芽。通过这样的组合，认为的制造出和天然种子相类似的结构。
19.体细胞胚：在离体条件下，没有经过受精过程，但经过了胚胎发育过程，所形成的胚的类似物。
细胞工程-原代及传代细胞培养
因此采用原代培养细胞做实验，如药物 测试、基因表达测试等有其独特优点， 是组织培养工作者应熟知和掌握的技术。 原代细胞培养主要有离散细胞原代培养 和组织块原代培养两种方法。
一、离散细胞原代培养
动物细胞在体内有严密的组织结构，群 体细胞之间以固有的分化方式相互联系、 相互依存。离体之后仍保持原有的组织 结构特性，多数组织的形态是固体结构， 细胞与细胞或细胞与细胞间质之间联系 紧密，要得到大量的离散细胞，必须采 取必要的措施进行人工分离（消化培 养）。
在普通恒温箱中培养细胞，培养容器需
要密闭，以免CO2逸出而造成培养液pH 上升。一但发现这种情况（溶液变红）
要及时调整pH。在CO2或三气培养箱中 进行培养，瓶盖一定要松开，以便换气。
培养过程中每天要检查细胞贴壁情况、
生长与增殖情况，并每隔3～5天更换一
次培养液。细胞铺满瓶壁时要及时进行
传代。
二、组织块原代培养
贴壁细胞传代的基本方法是：吸出培养 瓶内营养液，注入消化液（如0.02％ EDTA和0.25％胰蛋白酶混合液），置 37℃温箱或室温中作用一定时间。在消 化过程中，要在镜下随时监视细胞状态， 当见到细胞胞质回缩，胞体变圆，细胞 间缝隙变大时，便立即终止消化。
吸出消化液，注入适量平衡盐溶液洗 1～2次。吸出平衡盐溶液，加入适量培 养液后，用吸管吹吸营养液，反复轻轻 吹打瓶壁上细胞，使之脱落入培养液中 形成细胞悬液。 细胞悬液经细胞计数后 稀释到适当浓度，或按原培养液体积稀 释2～4倍，分装到2～4个培养瓶中继续 培养（图4-21）。
第四章 动物细胞培养
第四章 动物细胞培养 第一节 细胞培养需要具备的基本条件 第二节 培养基的种类、成分及其作用 第三节 原代及传代细胞培养 第四节 培养细胞的常规检测 第五节 无限细胞系的建立 第六节 动物细胞培养技术的应用
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
初代培养原理将动物机体地各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适地培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖，这一过程称原代培养.仪器、材料及试剂仪器：培养箱（调整至℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（℃）材料：动物组织块试剂：培养基（含小牛血清），胰酶，′液，碘酒初代消化培养法. 准备：取各种已消毒地培养用品置于净化台面，紫外线消毒分钟.开始工作前先洗手、酒精擦拭手至肘部. . 布局：点燃酒精灯，安装吸管帽.. 处理组织：把组织块置于烧杯中，用液漂洗次，去除血污；如怀疑组织可能污染，可先置于含有青链霉素地混合液中分钟.. 剪切：用眼科剪把组织切成毫米大小地块，以便于消化.加入比组织块总量多倍地胰蛋白酶液，然后一并倒入三角烧瓶中，结扎瓶口或塞以胶塞.. 消化：或用恒温水浴，或置于℃温箱消化均可，消化中每隔分钟应摇动一次，如用电磁恒温搅拌器消化更好.消化时间依组织块地大小和组织地硬度而定.. 分离：在消化过程中见消化液发混浊时，可用吸管吸出少许消化液在镜下观察，如组织已分散成细胞团或单个细胞，立即终止消化，随即通过适宜不锈钢筛，滤掉尚未充分消化开地组织块.低速（转分）离心消化液分钟，吸出上清，加入适量含有血清地培养液.. 计数：用计数板计数，如细胞悬液细胞密度过大，再补加培养液调整后，分装入培养瓶中.对大多数细胞来说，要求在范围，培养液呈微红色，如颜色偏黄，说明液体变酸，可用调整.. 培养：置于℃温箱培养，如用温箱培养，瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞，纱布塞易生霉菌，每次换液时需要换新塞.初代组织块培养法. 剪切：把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中，用液漂洗二三次以去掉表面血污，吸静液，用眼科剪反复剪切块为止.. 摆布：用弯头吸管吸取若干小块，置于培养瓶中，用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部，小块相互距离以为宜，每一培养瓶底可摆布块.. 轻轻翻转培养瓶，另瓶底向上，注意翻瓶时勿另组织小块流动，塞好瓶塞，置℃温箱培养小时左右（勿超过小时），使小块微干涸.. 培养：从微箱中取出培养瓶，开塞，度斜持培养瓶，箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许，然后缓缓再把培养瓶翻转过来，让培养液慢慢覆盖附于瓶地上地组织小块.置温箱中静止培养.待细胞从组织块游出数量增多后.再补加培养液.传代培养法原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）. 传代培养也是一种将细胞种保存下去地方法.同时也是利用培养细胞进行各种实验地必经过程.悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶.材料和试剂. 细胞：贴壁细胞株. 试剂：％胰酶、培养基（含％小牛血清）. 仪器和器材：倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等操作步骤. 吸除培养瓶内旧培养液.. 向瓶内加入胰蛋白酶和混合液少许，以能覆满瓶底为限.. 置温箱中分钟，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，立即终止消化.. 吸除消化液，向瓶内注入液数毫升，轻轻转动培养瓶，把残余消化液冲掉.注意加液冲洗细胞时，动作要轻，以免把已松动地细胞冲掉流失，如用胰蛋白酶液单独消化，吸除胰蛋白酶液后，可不用液冲洗，直接加入培养液.. 用吸管吸取营养液轻轻反复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液.. 计数板计数后，把细胞悬液分成等份分装入数个培养瓶中，置温箱中培养.无菌操作注意事项. 操作前要洗手，进入超净台后手要用酒精或新洁尔灭擦试.试剂等瓶口也要擦试.. 点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液地用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜.. 操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会.. 不能用手触已消毒器皿地工作部分，工作台面上用品要布局合理.. 瓶子开口后要尽量保持℃斜位.. 吸溶液地吸管等不能混用.。
鸡胚成纤维细胞的原代培养
鸡胚成纤维细胞的原代培养171850044生拔钱诗晨一、背景知识1.1原代培养与传代培养1.1.1原代培养是指直接从生物体取材（细胞、组织或器官）进行的第一次培养（中途不分割培养物、不更换培养物的生长器皿）。
1.1.2传代细胞培养分割细胞培养物进行的再配养注：细胞培养的代不是指细胞分裂次数，而是指培养的次数1.2细胞体外培养要求的条件✓无菌✓适宜温度：哺乳动物细胞36.5℃ 0.5℃，植物细胞原生质体25℃左右✓生理渗透压✓适宜酸碱度：7.2-7.4✓气体：95%空气+5%二氧化碳✓培养基：提供水、各种有机营养（糖、氨基酸、维生素等）及无机盐、生长调节因子等1.3培养细胞生长类型悬浮型：培养时不黏附于支持物之上。
而呈现悬浮生长的细胞。
贴壁型：培养时需要黏附于一定固相支持物表面才能很好生长的细胞。
又称黏附依赖型细胞（分如下四类）✧成纤维细胞：胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。
✧上皮型：细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。
✧游走型：呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。
此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。
在一定条件下，如培养基化学性质变动等，它们也可能成纤维细胞形态。
✧多形型：是一些形态上不规则的细胞。
细胞一般分胞体和胞突两部分，胞体呈不规则多边形，胞突呈细长丝状。
如神经元和神经胶质细胞1.4原代细胞培养的一般办法1.4.1植块培养法直接将组织块接入培养皿底部，待组织块贴牢在底部后再加入培养基培养的方法1.4.2离散细胞培养法用酶消化组织，使细胞之间连接破坏，将组织离散成单细胞悬液进行培养的方法注：原代培养中的植块培养法与组织培养不是一回事；植物组织培养又叫离体培养，指从植物体分离出符合需要的组织、器官或细胞、原生质体等，通过无菌操作，在人工控制条件下进行培养以获得再生的完整植株或生产具有经济价值的其他产品的技术。
细胞培养方法
细胞一细胞培养（一）原代培养○1胰蛋白酶消化法1.将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.吸去PBS液，将组织块移入15ml离心管中，加入组织块两倍体积预热至37℃的0.25%含EDTA的胰蛋白酶，在37℃水浴中作用20分钟，每隔五分钟摇晃一下3.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，将消化后的组织块用细胞筛过滤，取过滤液于离心管中，1000r/min离心5分钟4.离心后吸去上清液，加入5ml含10%胎牛血清和1%双抗的培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至约5×105个/ml，每个培养皿（6㎝培养皿）加入5ml含细胞的培养基，上下左右移动混匀5.放入37℃，5%CO2的培养箱中培养6.24h后，观察细胞贴壁情况，更换培养基，继续培养，2-3天更换一次培养基7.代细胞融合率达80%-90%时进行传代培养○2组织块法1. 将组织块用PBS清洗3遍，去除表面血污，移入新的培养皿中用弯头剪剪至1mm3（糊状）后用PBS清洗三遍（洗至PBS澄清透明）2.将组织块转移至培养皿中，每个组织块保持一定间距3.向培养皿中缓慢加入培养基至刚好没过组织块，小心放入37℃，5%CO2的培养箱中培养4.24h后，观察贴壁情况，并补加新培养基仪器：6㎝培养皿、弯头剪、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（二）传代培养○1贴壁细胞1.先将含10%血清和1%双抗的培养基、0.25%EDTA-胰蛋白酶在37℃水浴锅中预热20min2.观察细胞融合率是否达到80%-90%3.将所需用品放入紫外照射30min的超净工作台中，物品放入前需用75%酒精擦拭或放入后立即用酒精擦拭4.吸去培养基，加入PBS冲洗两遍，洗去残留培养基，加入胰蛋白酶至刚好覆盖培养皿底 （6㎝培养皿约1ml），放入培养箱中消化0.5-2分钟5.加入两倍体积的含血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀，吸入离心管中，1000r/min离心5min6.离心后，小心吸去上清夜，加入5ml培养基轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml7.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养○2悬浮细胞1.将培养皿中的培养基吸至离心管中，1000r/min离心5分钟2.离心后吸去上清液，加入5ml培养基，轻轻吹打混匀，血细胞计数，调至5×105个/ml3.每个6㎝培养皿加入5ml含细胞的培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中继续培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）（三）细胞冻存○1贴壁细胞冻存1.配置细胞冻存液2.吸去培养基，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶刚好覆盖培养皿底，放入培养箱中消化0.5-2min3.消化后的细胞，转移至离心管中，1000r/min离心5min4．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml5.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中○2悬浮细胞冻存1.配置细胞冻存液2.将细胞转移至离心管中，1000r/min离心5min3．离心后，加入细胞冻存液与细胞混匀，细胞计数，调至5×106个/ml4.每个冻存管加入1.5ml，将冻存管放入程序性降温盒，-80℃过夜，转移至液氮中；若无程序性降温盒，则将冻存细胞依次放置4℃1h，-20℃2h，-80℃过夜，再转移至液氮中仪器：15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、倒置显微镜、程序性降温盒、液氮罐试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM（高糖）培养基、胎牛血清、二甲基亚砜（四）细胞复苏1.将冻存的细胞从液氮中小心取出，快速在37℃水浴锅中摇晃解冻，一般在1min内完成，若离水浴锅较远可将细胞放置在干冰上2.将冻存管内液体转移至离心管中，1000r/min离心5min3.去除上清液，加入培养基，轻轻吹打混匀，细胞计数，调至5×105个/ml4.每个6㎝培养皿加入5ml复苏后的细胞，放入37℃，5%CO2培养箱中培养仪器：6㎝培养皿、15ml离心管、50ml离心管、5ml移液枪、1ml移液枪、5ml枪头、1ml枪头、废液瓶、酒精棉球、离心机、水浴锅、倒置显微镜、细胞培养箱试剂：PBS缓冲液、0.25%EDTA-胰蛋白酶、DMEM （高糖）培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素混合液（双抗）。
细胞传代培养和原代培养
细胞传代培养和原代培养一：原代细胞培养(一)原理：细胞培养(Cell culture)是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。
近年来，广泛地应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，发展成一种重要生物技术，并取得显著成就。
由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。
原代培养细胞离体时间短，性状与体内相似，适用于研究。
一般说来，幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养。
(二)操作：1．取材：用颈椎脱位法使乳兔迅速死亡。
然后，把整个动物浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。
用消过毒的剪刀剪开用和乙醇再次消毒后的皮肤，剖腹取出肝脏或肾脏。
置于无菌平皿中。
2．切割：用灭菌的PBS液将取出的脏器清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织反复剪碎，直到成1mm3左右的小块，再用PBS清洗，洗到组织块发白为止。
移入无菌离心管中，静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。
3．消化、接种培养：吸取0.25％胰蛋白酶一0.02％混合消化液1ml，加入离心管中，与组织块混匀后，加上管口塞子，37℃水浴中消化8～10分钟，每隔几分钟摇动一下试管，使组织与消化液充分接触，静止，吸去上清，向离心管中加入5～10ml含5％小牛血清的MEM培养基，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养。
(三)结果:细胞接种后一般几小时内就能贴壁，并开始生长，如接种的细胞密度适宜，5天到一周即可形成单层。
二：传代细胞培养(一)原理：体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。
培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项
原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项1.组织获得:收集组织样本，并用无菌技术分离细胞。
组织样本可以通过活体组织采样、细胞培养物或冻存细胞获得。
2.细胞分离:使用酶或机械方法，将组织分解为单个细胞。
酶消化可以使用胰蛋白酶、胶原酶等，机械方法可以使用刮刀或组织切割器。
3.细胞培养:将细胞转移到含有适当营养物质和细胞因子的培养基中。
常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640、MEM等。
4.培养条件:细胞应保持在适当的培养条件下，包括温度、湿度、CO2和O2浓度以及pH值等。
传代培养的方法：1.剥离细胞:轻轻地将细胞从培养底物上剥离。
可以使用胰蛋白酶或EDTA来辅助细胞剥离。
2.细胞计数:使用显微镜和细胞计数板，计算细胞的数量。
3.细胞传代:将细胞转移到新的培养底物中。
选择适当的培养底物和培养条件，以确保细胞的正常生长和增殖。
4.细胞恢复:细胞传代后，需要一段时间来恢复和适应新的培养条件。
在这段时间内，细胞可能会出现一定程度的生长停滞或损伤。
注意事项：1.无菌操作:在进行细胞培养时，必须保持严格的无菌操作，以防止细胞污染和细菌、真菌、病毒等微生物的污染。
2.培养基配方:不同类型的细胞对培养基中的成分和细胞因子的需求有所不同，因此必须使用适当的培养基。
3.培养条件控制:细胞对培养条件非常敏感，包括温度、CO2浓度、湿度等。
必须确保这些条件处于合适的范围内。
4.细胞密度控制:细胞密度对细胞生长和增殖有重要影响。
过高的细胞密度可能导致细胞死亡，而过低的细胞密度可能导致细胞转分化。
5.传代次数限制:细胞在传代培养中会出现累积的突变和基因改变，因此应限制传代的次数，以确保细胞的稳定性和一致性。
6.细胞检测和验证:在进行细胞传代培养之前和之后，应对细胞进行检测和验证，以确保细胞的纯度和正常生长。
细胞培养是一项复杂的技术，需要细致的操作和严格的条件控制，以确保细胞的正常生长和稳定性。
遵循适当的方法和注意事项，将有助于提高细胞培养的成功率和可靠性。
原代培养和传代培养
原代培养:即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
有几方面含义：●培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；●原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；●原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。
正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。
目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。
此细胞系一直延用至今。
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。
但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。
细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。
当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。
但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。
由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。
目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。
多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（monolayer culture），又叫贴壁培养（adherent culture）。
传代培养和原代培养的概念辨析
传代培养和原代培养的概念辨析1．原代培养和传代培养的概念从机体上获取的组织，通过酶或机械方法分散成单个细胞进行培养，在首次传代前的培养一般称为原代培养。
原代培养的最大优点是：组织细胞刚脱离机体，生物性状尚未发生较大变化，在一定程度上能够反映体内的状态。
原代培养的细胞在生长、繁殖一定时间后，由于空间不足或细胞密度过大导致营养枯竭，会影响细胞的生长，因此需要进行扩大培养，即传代或称为传代培养，也就是将细胞按1：2~1：4的比例传代。
但严格说来，不论在进行传代时稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移到另一个培养瓶即称为传代培养。
传代代数与细胞的世代（增殖代数）并不是同一个概念。
在细胞培养时，所说的“第10代细胞”，仅指该细胞已经传代10次；细胞传一代后，一般能倍增3~6次，经过三个阶段，即潜伏期、指数生长期和平台期。
当细胞达到平台期时，就需要进行传代培养，否则细胞会中毒，发生形态改变，甚至死亡。
2．关于传代培养在进行传代时，如果是悬浮细胞，只需简单稀释即可，若需完全更换培养液只需低速离心沉淀，再悬浮于合适的培养液中即可。
一般细胞每毫升接种数量为5?104~8?105个，传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。
在培养过程中，培养液会由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。
如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代，多数细胞需用胰蛋白酶处理将细胞从生长物表面分离下来，以促进传代培养。
3．细胞系和细胞株细胞系和细胞株，两者曾一度混用，导致有些文献中概念不清。
下面所指的概念是现在国内外比较通用的，也是绝大多数研究者接受的观点。
原代培养物经首次传代成功即称为细胞系（Cell Line），因此细胞系可泛指一般可能传代的细胞。
其中能够连续传代的细胞叫做连续细胞系或无限细胞系，不能连续培养的称为有限细胞系。
大多数二倍体细胞为有限细胞系。
通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物的培养物称为细胞株（Cell Strain），也就是说，细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。
细胞的原代培养与传代培养
细胞的原代培养与传代培养原代培养通过组织块直接长出单层细胞或用酶或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养，在首次传代前的培养可认为是原代培养。
原代培养最大的优点是，组织和细胞刚刚离体，生物性状尚未发生很大变化，在一定程度上能反映体内状态。
特别是在细胞培养会合时，原代培养的某些特殊功能表达尤为强烈。
在这样的培养阶段能更好地显示与亲体组织紧密结合的形态学特征。
在供体来源充分、生物学条件稳定的情况下，采用原代培养做各种实验，如药物测试、细胞分化等，效果很好。
但应注意，原代培养组织是由多种细胞成分组成的，比较复杂。
即使全为同一类型的细胞，如上皮细胞或成纤维细胞，也仍具有异质性，在分析细胞生物学特性时比较困难。
其次，由于供体的个体差异及其他一些原因，细胞群生长效果有时也不一致。
原代培养也是建立各种细胞系（株）必经的阶段。
假如原代培养能够维持几小时甚至更长，即可进行进一步筛选。
有的细胞具有继续增殖能力，有的细胞类型只是存活而不增殖，而另外一些细胞只是在特殊条件下应用而不存活，因而细胞类型的分布将会改变。
在单层培养的情况下，瓶底全部铺满细胞，达到会合以后，对密度有依赖性的细胞则逐渐减少生长，而失去密度依赖敏感性的细胞则生长增加，天然或自发转化的细胞则过度生长。
借助于频繁传代，保持细胞低密度生长，有利于保存细胞的正常表型（如小鼠成纤维细胞）。
而自发转化则倾向于高细胞密度的过度生长。
细胞密度过大，培养基消耗将尽，细胞代谢产物积聚过度，细胞增殖变慢，应进行传代培养。
传代培养原代培养形成的单层细胞汇合以后，需要进行分离培养，否则细胞会因生成空间不足或由于细胞密度过大引起营养枯竭，都将影响细胞的生长，这一程序常称为传代或传代培养。
原代培养在首次传代时即为细胞系，能连续培养下去的为连续细胞系；不能连续培养的为有限细胞系。
通常，传代培养是指扩大培养，也就是将一份细胞一分为二或者一分为三进行培养等。
但严格说来，不论稀释与否，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养。
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原代培养:即第一次培养，是指将培养物放置在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养物的培养过程。
有几方面含义：
●培养物一经接种到培养器皿（瓶）中就不在分割，任其生长繁殖；
●原代培养中的“代”并非细胞的“代”数，因为培养过程中细胞经多次分裂已经产生多代子细胞；
●原代培养过程中不分割培养物不等于不更换培养液，也不等于不更换培养器皿。
正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。
所谓转化即是指正常细胞在某种因子的作用下发生突变而具有癌性的细胞。
目前世界上许多实验室所广泛传用的HeLa细胞系就是1951年从一位名叫Henrietta Lacks的妇女身上取下的宫颈癌细胞培养而成。
此细胞系一直延用至今。
原代培养的细胞一般传至10代左右就不易传下去了，细胞的生长就会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。
但是有极少数的细胞能够度过“危机”而继续传下去，这些存活的细胞一般能够传到40～50代，这种传代细胞叫做细胞株。
细胞株的遗传物质没有发生改变,在培养过程中其特征始终保持。
当细胞株传至50代以后又会出现“危机”，不能再传下去。
但是有部分细胞的遗传物质发生了改变，并且带有癌变的特点，有可能在培养条件下无限制地传代下去，这种传代细胞称为细胞系。
原代培养是建立各种细胞系（株）必经的阶段，其是否成功与组织污染与否、供体年龄、培养技术和方法、适宜培养基的选择等多种因素有关。
由于原代培养的细胞转化性极小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗等生物制品；但也存在有潜在外源因子、不能事先检查标本、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。
目前常用的原代细胞培养有鸡胚成纤维细胞及猪肾、猴肾、地鼠肾等原代细胞。
原代培养的基本过程包括取材、培养材料的制备、接种、加培养液、置培养条件下培养等步骤，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及生长环境的无菌。
多数情况下，分散的细胞若属于贴壁依赖型细胞，就能黏附、铺展于培养器皿和载体表面生长而形成细胞单层，这种培养方式称为单层细胞培养（monolayer culture），又叫贴壁培养（adherent culture）。
少数情况下，培养的细胞没有贴壁依赖性，可通过专门设备使细胞始终处于悬状态而在体外生长，这种形式称为悬浮培养（suspension culture）。
如何让接种的细胞尽快贴壁，是决定培养成功的关键步骤：
●取决于适当的生长基质表面；
●可降低接种后培养液对细胞的浮力，如先少补加少量培养液，待细胞贴壁后再补足营养液继续培养；
●注意适当的细胞接种密度，一般105个/ml左右。
传代培养:当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。
此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。
这个过程就称为传代（passage）或者再培养（subculture）。
对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。
体外培养技术中所谓的传“代”概念并不等于细胞生物学中“亲代细胞”与“子代细胞”中“代”的概念。
传代培养的实质就是分割后再一次培养，可以相对地衡量培养物的培养年龄。