亚麻籽中开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的测定_省略_高效液相色谱_二极管阵列检测_

浙江大学学报(农业与生命科学版)　34(5):564～570,2008Journal of Zhejiang U niversity(Agric1&Life Sci1)文章编号:100829209(2008)0520564207DOI:10.3785/j.issn.100829209.2008.05.013亚麻籽中开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的测定———高效液相色谱2二极管阵列检测2电喷雾质谱法张文斌,许时婴,王璋,杨瑞金,卢蓉蓉(江南大学食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡214122)摘　要:采用高效液相色谱-二极管阵列检测-电喷雾质谱(HPL C2PAD2ESI2MS)法对开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(SD G)进行定性和定量检测,研究方法的精密度、稳定性、定量检测限及加样回收率,并考察样品制备方法对定量检测结果的影响.采用Sephadex L H220柱色谱分离制备SD G对照品,并用1H2NMR与13C2NMR对其进行表征.HPL C2PAD2ESI2MS检测所得紫外及电喷雾质谱信息与SD G结构相符.以自制的SD G(纯度9616%)为对照,采用HPL C绘制定量标准曲线,方法精密度较高(RSD为1136%),稳定性好(1周后RSD为1121%),定量检测限较低(LOQ为314mg!L-1),加样回收率达(9917±312)%.此外,制样时采用碱法水解与混合溶剂提取,不仅节省时间,还更充分地提取了SD G.说明用HPL C2PAD2ESI2MS法检测亚麻籽中的SD G方便省时,准确可靠.关　键　词:亚麻籽;木酚素;开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷;高效液相色谱;二极管阵列检测;电喷雾质谱中图分类号:TS201 文献标识码:AZHAN G Wen2bin,XU Shi2ying,WAN G Zhang,YAN G Rui2jin,L U Rong2rong(S tate Key L aboratoryof Food S cience and Technolog y,S outhern Yangtze Universit y,W ux i,J iangsu214122,China)Determination of secoisolariciresinol diglucoside by high perform ance liquid chrom atography2photodiode array detection2electrospray ionization2m ass spectrometry.Journal of Zhejiang University(Agric1&Life Sci1),2008,34(5):5642570Abstract:High performance liquid chromatography2photodiode array detection2elctrospray ionization2 mass spectrometry(HPL C2PAD2ESI2MS)method was used to determine secoisolariciresinol diglucoside(SD G)qualitatively and quantitatively.Precision,stability,limits of quantification,SD G recovery and sample preparation method were studied.SD G was isolated on a Sephadex L H220column chromatography and characterized by1H2NMR and13C2NMR.Calibration curve was built with the purified SD G(with purity of9616%)as a standard1The UV spectrum and ESI2MS spectra were in accordance with SD G structure.The HPL C2PAD2ESI2MS method had high precision(RSD1136%), good stability(RSD1121%after a week),low limit of quantification(314mg!L-1)and satisfying recovery(9917±312)%.In addition,by combination of solvent extraction with alkaline hydrolysis, 收稿日期:2007205217基金项目:江南大学2007年博士启动基金资助项目.作者简介:张文斌(1979—),男,安徽六安人,博士研究生,主要从事功能性食品因子与食品酶学研究.Tel:0510285329249; E2mail:zhangwb7909@hot .通讯作者:许时婴,女,教授,博士生导师,主要从事功能性食品因子与配料研究.Tel:0510285884496;E2mail:syxu@jiangnan. . 张文斌,等:亚麻籽中开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的测定———高效液相色谱2二极管阵列检测2电喷雾质谱法sample preparation time was saved and SD G yield was improved.This HPL C 2PAD 2ESI 2MS method is convenient ,time 2saving ,accurate and reliable.K ey w ords :flaxseed ;lignan ;secoisolariciresinol diglucoside ;HPL C ;photodiode array detection ;electrospray ionization 2mass spectrometry图1　木酚素基本骨架及亚麻籽中的木酚素Fig.1　Basic structure of lignans and lignans identified in flaxseed 亚麻(L i num ustit atissi m um L.)又称胡麻,属亚麻科、亚麻属,是世界第七大、我国第四大油料作物.亚麻籽中富含木酚素类物质,目前已发现的木酚素类物质有5种(图1),其中开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(SD G )的含量最高,达5～10g !kg -1亚麻籽,是其他木酚素含量的百倍以上[1].同时,亚麻籽也是SD G 的主要来源,SD G 在亚麻籽中的含量是其在豆类、谷物和蔬菜中含量的75～800倍[1].SD G 具有弱激素/抗雌激素双向调节功能.在抑制乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、减轻妇女绝经期症状、辅助治疗狼疮性肾炎、糖尿病等方面可发挥有益作用[2].此外,SD G 也是一种良好的抗氧化剂[3].SD G 的检测对于建立食品成分数据库与膳食补充具有重要的意义[4]. 由于亚麻籽中部分SD G 与32羟基252甲基2戊二酸(HM GA )共价结合形成低聚体,而SD G又没有商业化标准品,因此其样品制备和检测难度较大.研究者采用肠道菌群将木酚素转化为肠二醇和肠内酯,通过测定肠二醇与肠内酯含量来间接确定木酚素的含量[5].该法依赖肠道菌群在体外的活力,重现性较差,耗时较长,难以推广.Mazur 等建立了一种稳定同位素稀释2气相色谱2质谱(ID 2GC 2MS )法来测定包括SD G 的多种植物雌激素[6].该法灵敏度高,可同时测定多种植物雌激素[7].但其样品制备较为繁杂,包括样品复水、酶水解、酸水解、两次离子交换色谱纯化、三甲基硅醚衍生化5个步骤,需加入内标补偿制样过程中的损失,而且测定费用较高.制样过程中采用酸水解往往也造成亚麻木酚素一定程度的损失[829]. 鉴于亚麻籽中主要木酚素为SD G ,研究者565　第5期浙江大学学报(农业与生命科学版)采用HPL C 2UV 或H PL C 2MS 方法来直接测定SD G 含量[8,10].这些方法避免了酸水解,无需衍生,过程简单.但其缺点在于仅仅采用UV 或MS 单独测定,所提供的定性信息较少,测定结果易受干扰.HPL C 2PAD 2ESI 2MS 串联法检测简便快速、灵敏度较高,可提供更多定性信息,在天然产物检测中应用广泛.本文采用H PL C 2PAD 2ESI 2MS 对样品中的SD G 进行测定,并采用1H 2NMR 和13C 2NMR 对H PL C 2PAD 2ESI 2MS 的测定结果进行验证,对方法的精密度、稳定性、定量检测限、加样回收率及样品制备方法进行研究.1　材料与方法1.1　试剂与仪器 亚麻籽由新疆绿旗生物制品有限公司提供,乙醇、甲醇、盐酸、氢氧化钠等均为分析纯.用于色谱分析的甲醇为H PL C 纯度,用于NMR 分析的CD 3OD (9918%D )购自美国Aldrich 公司,Sephadex L H 220购自Amersham Biosciences 公司.主要仪器包括UV 21100紫外2可见分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)、Waters 2690液相色谱仪(含二极管阵列检测器,美国Waters 公司)、ZMD 4000质谱仪(美国Waters 公司)、Bruker DRX 400核磁共振仪(英国Bruker 仪器有限公司).112　SD G 样品的制备 亚麻籽在70℃热水中浸泡脱粘,经砂轮磨破碎,湿法分离仁壳,富壳部分干燥后作为提取木酚素的原料.采用正己烷(1∶10,W /V )搅拌脱脂,离心(3000r !min -1,10min )后得到清液和沉淀(即脱脂亚麻籽壳粉,DF H F ),60℃热风干燥,粉碎,过60目筛,置干燥器中待用.SD G 的提取采用两种方法(图2),两种提取方法分别重复3次.图2　从脱脂亚麻籽壳粉中提取SDG 的两种方法Fig.2　Two met hods for extraction of SD G from defatted flaxseed hull flower113　SD G 对照品的制备与鉴定 SDG 对照品的制备详见前期研究[11].经0145μm 过滤的SDG 粗提液进样至Sephadex L H 220柱色谱(95cm ×116cm ,i.d 1),采用去离子水洗脱,检测波长为280nm ,对280nm 下有吸收的组分进行波长扫描.将扫描结果与文献报道比较,初步判定SDG 的出峰位置[12].将与SDG 吸收特征相近的相邻组分收集合并,浓缩后再次进Sephadex L H 220柱色谱分离得SDG 对照品. 纯化后的SD G 采用H PL C 2PAD 2ESI 2MS 分析,根据280nm 下吸收峰的面积采用面积665第34卷　 张文斌,等:亚麻籽中开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的测定———高效液相色谱2二极管阵列检测2电喷雾质谱法归一法计算其纯度.色谱柱为Symmetry C8 (150mm×211mm i1d1,5μm),PAD扫描范围200～400nm,柱温30℃,进样体积10μL.流动相由(A)1%醋酸水溶液(V/V)与(B)甲醇两相组成.采用线性梯度洗脱(A∶B,V/ V),0min,5∶95;40min,55∶45;60min,5∶95.流速015mL!min-1.电喷雾质谱采用正离子和负离子模式同时检测,毛细管电压3188 kV,锥孔电压25V,离子源温度120℃,脱溶剂气温度300℃,质荷比范围300～800,光电倍增器电压650V.另外,将Sep hadex L H220柱色谱纯化所得SD G冷冻干燥后复溶在CD3OD中,采用1H2NMR(400M Hz)和13C2 NMR(100M Hz)鉴定其结构.114　HPLC定量测定SD G 将纯化所得的SD G对照品配成6125、1010、2010、5010、100mg!L-1的系列溶液,进样至HPL C2PAD中,根据最大吸收波长下吸收峰面积与样品浓度绘制标准曲线,计算回归系数.分别测定浓度为1010、2010、5010mg! L-1的SD G对照品溶液各3次,计算相对标准偏差(RSD).定义定量检测限(LOQ)为检测峰面积与噪音峰面积的比例达到10、相对标准偏差≤15%(3次重复)时的浓度值.稀释SD G对照品溶液至5、215和1125mg!L-1,进样检测,确定SD G的LOQ.将SD G对照品溶液在4℃下放置7d后测定3次,计算其RSD.准确称取110～210g脱脂亚麻籽壳粉,加入一定量SD G 对照品溶液,提取后用HPL C测定,计算回收率.采用方法2制备样品,用HPL C2PAD2ESI2 MS方法测定DF HF中的SD G.2　结果与讨论211　SD G对照品的分析鉴定 经Sep hadex L H220柱色谱两次分离纯化得到SD G的对照品,用HPL C2PAD2ESI2MS 法确定其出峰时间为15106min(图3),面积归一法计算出其纯度为9616%. 由于SDG分子中发色基团只有苯环,且苯环上连接给电子取代基2O H和2OCH3,因此在23216和28016nm处分别出现E2吸收带和B图3　SDG对照品的HPLC谱图Fig.3　HPLC chromatogram for purified SD G吸收带(图4).图4　SDG的紫外吸收特征Fig.4　UV spectra of SD G by PAD SD G分子(C32H46O12,M W=686171)经过电喷雾质子化后,生成不同荷质比的离子峰(图5).在ESI-模式中,m/z36112、m/z 52310、m/z72117和m/z68519处有较强的离子峰,其中基峰为分子离子峰[M-H]-,m/z 36112与m/z52310是SD G脱除两个或一个糖苷生成的离子碎片,即[M-2Glu+2H2O-H]-和[M-Glu+H2O-H]-,m/z72117和m/z78312则分别可能是SD G生成的离子碎片[M+2H2O-H]-和[M+Na+2K-4H]-对应的离子峰.作为ESI-模式的补充, ESI+模式也得到了一些离子碎片信息.其中基峰m/z36315对应碎片为[M-2Glu+2H2O +H]+,m/z68717为分子离子峰[M+H]+, m/z70417、m/z71010、m/z78610和m/z 52512分别对应碎片离子[M+H2O+H]+、[M+Na]+、[M+Na+2K-2H]+和[M-Glu765　第5期浙江大学学报(农业与生命科学版)+H2O+H]+.由UV和ESI2MS信息得到了SD G可靠的定性结果. 为验证UV和ESI2MS鉴定的结果和确定SD G的绝对构型,对纯化所得SD G进行1H2 NMR和13C2NMR分析.与文献对照[13],表明纯化所得产物确为SD G,其绝对构型为2,32二[(42羟基232甲氧苯基)甲基]21,42丁二醇二2 [R2(R3,R3)]2β2D2吡喃葡萄糖苷.图谱中几无杂峰,证实了纯化所得SD G纯度较高(90%以上,W/W),可以作为定量标准.图5　SDG的ESI-与ESI+模式的电喷雾质谱Fig.5　MS spectra of SD G in bot h ESI-and ESI+mode212　HPLC定量测定SD G 采用纯化所得SD G为对照品,以响应峰面积对SD G浓度作图,在浓度范围0100625～011mg!mL-1内,得出定量标准曲线方程为y =20912x-1011,y为响应峰面积,x为木酚素浓度/(mg!L-1).峰面积与吸光值线性关系良好,R2为019997.通过测定1010、2010、5010 mg!L-1的SD G对照品溶液,计算出RSD仅为1136%,表明方法精密度较好.通过测定稀释到5、215、1125mg!L-1的SD G对照品,确定本方法的LOQ为314mg!L-1,方法灵敏度足以检测一般食品原料中SD G的含量.SD G对照品溶液在4℃下放置1周后测定,与原测定值比较,其RSD为1121%,说明该对照品溶液较为稳定,测定周期较长.加样回收率试验结果(表1)表明本方法回收率高,平均回收率(9917±312)%,完全满足定量要求.表1　加样回收率试验Table1　Recovery experiment for lignan determination实验号样品中SD G含量/μg加入SD G量/μg测定值/μg回收率/%平均回收率/% 101891165214797129917±312 21137116531121031331178116531389815 采用所建立的HPLC2PAD2ESI2MS方法测定脱脂亚麻籽壳粉中SDG(图6),15108min出峰的物质与对照品SDG出峰时间(15106min)接近,其UV吸收特征、电喷雾质谱(图7)均与对照品一致,因此确定该物质为SDG.865第34卷　 张文斌,等:亚麻籽中开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的测定———高效液相色谱2二极管阵列检测2电喷雾质谱法图6　HPLC 测定脱脂亚麻籽壳粉中SDGFig.6　HPLC chromatogram for determination of SD Gin DF HF 通过吸收峰面积计算出SD G 的浓度,发现采用方法1(图2)提取时,检测出DF H F 中SD G 含量为(93013±1810)mg !kg -1DF HF (基于干基).而采用方法2的测定结果为(106012±615)mg SD G !kg -1DF HF.为验证2种方法的提取效果,采用方法2对方法1的残渣进行提取,发现残渣中还剩下(13218±1010)mg !kg -1DF H F.而采用方法1对方法2的残渣进行提取则未得到SD G.这表明将碱水解和有机溶剂提取合并起来可以更充分地提取出亚麻籽中的SD G.这可能与SD G 在亚麻籽中的分布和存在状态有关.由于部分SD G 以酯键的形式结合HM GA ,因此,合并碱水解与有机溶剂提取实现边提取,边水解,有利于酯键的断裂和SD G 的释放,从而提高了SD G 的得率.研究还发现方法2的粗提物得率为(15314±2019)g !kg -1DF H F ,大大高于方法1的粗提物得率(9814±1313)g !kg -1DF H F.调节粗提液p H 至415以后,大部分的杂质沉淀下来,表明杂质可能以蛋白或肽类为主.这可能是由于在湿法分离仁壳时,结合在壳层上的部分胚乳层被带入了富壳部分.比较而言,方法2虽然将更多杂质引入了粗提物,但是它更充分地提取了基质中的SD G ,而且制样时采用碱法水解与混合溶剂提取,缩短了样品的制备时间,使分析检测更为便捷.图7　样品中SDG 洗脱峰的电喷雾质谱Fig.7　ESI 2MS spect ra of SD G in DF HF965　第5期浙江大学学报(农业与生命科学版)3　结　论 本文采用H PL C2PAD2ESI2MS测定了亚麻木酚素———开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷,通过紫外和质谱信息进行定性,采用外标法定量.通过采用碱性混合溶剂提取的方法,不仅节省时间,还更充分地提取了SD G,提高了测定速度和准确性.采用HPL C2PAD定量,方法精密度较高(RSD为1136%),稳定性良好(1周后测定值与原测定值相比,RSD为1121%),定量检测限(314mg!L-1)较低,加样回收率(9917±312)%高,易于推广应用.此外,采用H PL C2PAD2ESI2MS串联法定性,所提供的定性依据信息充足,避免测定结果受到干扰,提高了结果的可靠性.R eferences:[1]　Meagher L P,Beecher G R1Assessment of data on t helignan content of foods[J]1Journal of FoodComposition and Analysis,2000,13:93529471[2]　Kurzer M S,Xu X1Dietary phytoestrogens[J]1Annu al R evie w of Nutrition,1997,17:35323811 [3]　Prasad K1Antioxidant activity of secoisolariciresinoldiglucoside2derived metabolites,secoisolariciresinol,enterodiol,and enterolactone[J].International Journalof Angiology,2000,9:2202225.[4]　Valsta L M,K ilkkinen A,Mazur W,et al.Phyto2oestrogen database of foods and average intake inFinland[J].B ritish Journal of Nutrition,2003,89(Suppl1):S31238.[5]　Thompson L U,Rickard S E,Cheung F,et al.Variability in anticancer lignan levels in flaxseed[J].Nutrition and C 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