逆向遗传学技术在猪瘟病毒研究中的应用
反向遗传学在植物研究中的应用
反向遗传学在植物研究中的应用作者：闫晓丹来源：《中国果菜》 2010年第3期摘要:反向遗传学是直接从遗传物质入手来研究生命现象与规律的, 其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。
本文就反向遗传学在植物研究中的应用进行了评述, 并对其前景进行了阐述。
关键词：反向遗传学技术；反向遗传学1、反向遗传学及其技术介绍反向遗传学（reverse genetics）是相对于正向（经典）遗传学而提出的。
经典遗传学的系统研究是从孟德尔的豌豆花实验开始的，就是通过研究生物的表型、性状来推测其遗传物质组成、分布与传递规律等，从而研究生命过程的发生与发展规律的。
即正向遗传学主要研究生物突变性状的遗传行为，如控制突变性状的基因数目及其在染色体上的位置以及突变性状在后代中的传递规律等。
反向遗传学则是在已知基因序列的基础上，利用现代生物理论与技术，通过核苷酸序列的突变、缺失、插入等手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应。
即反向遗传学是直接从生物的遗传物质入手来研究基因的生物学功能，阐述生物生命发生的本质现象与规律，如生物的繁殖复制机制、病毒的致病机制等。
而与反向遗传学操作相关的各种技术统称为反向遗传学技术（r e v e r s e g e n e t i c sapproach），包括RNA 干扰（RNA interference,RNAi）技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等，是D N A 重组技术应用范围的扩展与延伸。
随着基因组序列测定技术的日渐成熟，反向遗传学技术的应用将越来越广泛。
目前反向遗传学技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域，且在病毒研究方面已经显示出了巨大的作用，尤其是R N A 病毒的研究方面。
2、反向遗传学的应用2.1 用于拯救病毒或创造新型病毒根据一些病毒的有关的已知核酸序列，采用反向遗传学操作技术可以构建出“人为设计”的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或已消失的病毒核酸序列为基因组的新型病毒，这给获得高免疫原性的低致病力毒株来制造疫苗提供了一个全新的途径。
反向遗传技术拯救流感病毒标准操作规程
反向遗传技术拯救流感病毒标准操作规程（编号：016）1、目的及适用范围利用该系统改变病毒基因组序列，拯救重组病毒。
2、主要仪器及试剂CO2细胞培养箱、生物安全柜、离心机、转染试剂、TPCK处理的胰酶（2μg/mL）、胎牛血清（FBS）、DMEM、293T或Vero等细胞3、操作步骤3.1 在转染前细胞传代3.2转染前换无抗生素培养基，混匀质粒（pPolI-WSN-PB2 pPolI-WSN-PB1 pPolI-WSN-PA pPolI-WSN-HA pPolI-WSN-NP pPolI-WSN-NA pPolI-WSN-M pPolI-WSN-NS pcDNA-PB2 pcDNA-PB1、pcDNA-PA、pCAGGS-NP）pcDNA-PA 0.1μg,其余质粒1μg，按照lipofectamine 2000说明书操作。
3.3转染4-6h后换液，含TPCK处理的胰酶2μg/mL、0.01%-0.1%FBS的DMEM，48h 可检测到103以上pfμ的病毒。
4、注意事项转染试剂：在拯救病毒时不能用PEI，据报道PEI有抑菌杀毒作用。
建议用脂质体如lipofectamine 2000。
5、问题向导没有拯救出重组病毒可能原因：质粒的纯度不够附：1、转染用的12质粒：1.1病毒vRNA表达质粒：pPolI-WSN-PB2 pPolI-WSN-PB1 pPolI-WSN-PA pPolI-WSN-HA pPolI-WSN-NP pPolI-WSN-NA pPolI-WSN-M pPolI-WSN-NS1.2 病毒聚合酶和NP蛋白表达质粒：pcDNA-PB2、pcDNA-PB1、pcDNA-PA、pCAGGS-NP37。
生物学在畜牧养殖中的应用
基于全基因组测序数据，对个体 进行全面、准确的选择，提高选 育效率。
01 02 03 04
分子标记辅助选育
利用分子标记技术，辅助选择具 有优良基因型的个体。
持续性选育与品种改良
通过持续选育和品种改良，不断 提高畜禽品种的生产性能和适应 性。
03
饲料营养与添加剂研究
Chapter
饲料营养成分分析及优化配方设计
细菌性疾病
如大肠杆菌病、沙门氏菌病等，可通过改善饲养环境、提高饲料 质量、使用抗菌药物等进行预防。
寄生虫病
如球虫病、蠕虫病等，预防措施包括定期驱虫、保持饲养环境卫 生等。
免疫接种程序和方法
制定免疫程序
根据当地疫情、畜种、年龄等因素，制定合理的免疫程序，确保疫 苗接种及时、有效。
疫苗选择
选择正规厂家生产的疫苗，注意疫苗的保存和运输条件，确保疫苗 质量。
包括维生素、矿物质、氨 基酸、酶制剂、微生态制 剂、酸化剂、抗氧化剂等 。
添加剂功能
提高饲料营养价值、促进 养殖动物生长、增强免疫 力、改善肉质等。
安全性评价
对添加剂进行毒理学、药 理学、代谢动力学等方面 的研究，确保其安全有效 。
提高饲料利用率和降低环境污染
提高饲料消化率
通过添加酶制剂、酸化剂等，提 高养殖动物对饲料的消化率。
接种方法
根据疫苗种类和畜种特点，选择合适的接种方法，如肌肉注射、皮下 注射、饮水免疫等。
新型疫苗研发进展
1 2 3
基因工程疫苗
利用基因工程技术，将病原体的保护性抗原基因 插入到载体中，制备出高效、安全的基因工程疫 苗。
亚单位疫苗
利用化学或生物学方法，将病原体中的保护性抗 原提取出来，制备成亚单位疫苗，具有安全性高 、免疫原性好等优点。
猪抗病育种研究进展
猪抗病育种研究进展高产目标通常导致猪抵抗性降低。
同时猪场疾病，特别是病毒性传染病，严重威胁猪的健康。
尽管预防接种发挥了重要的防治作用，但未能完全控制和消灭传染病的流行。
从长远来看，采用遗传学方法从遗传本质上提高猪对病原的抗性，开展抗病育种具有治本的功效。
20世纪30年代，就有学者报道了不同鸡品种对马立克氏病敏感性存在差异，并在随后的一段时期内对猪或其它畜禽抗病有种进行了较为系统的研究，随着免疫学和生物制品学的发展，大部分传染病都通过预防接种得到了有效的控制，使抗病有种受到一定的冷落。
80年代以来，随着分子生物学和基因工程技术的发展，为抗病有种提供了新的思路，也使人们重新重视对抗病育种的研究。
1抗病力的遗传基础病原体在传染过程中，会遇到3道防御机制，即上皮防御机制、非特异性防御机制和特异性防御机制。
当个体受到病原体侵染时，会调动这3方面的防御机制加以抵抗。
猪是否发病取决于侵染和防御机能相互作用的结果，防御机能加强的猪便表现出自然抗病力。
抗病力按遗传基础的不同可分为特殊抗病力和一般抗病力。
特殊抗病力是指猪对某种特定疾病或病原体的抗性，这种抗性主要受一个主基因位点控制，也可程度不同地受其它位点（包括调控子）及环境因素影响。
，现有的研究结果表明，特殊抗病力的内在机理在于宿主体内存在或缺少某种子分子或其变体，这种分子有以下作用：①决定异体识别及特异性异体反应在；②决定病原体的特殊附着力；③病原体进人体内后在体内增殖，决定能否导致宿主发病。
一般抗病力不限于抗某一种病原体，它受多基因和环境的综合影响，病原体的抗原性差异对一般抗病力影响极小，甚至根本没有影响，这种抗病力体现了机体对疾病的整体防御功能。
如鸡的MHC与马立克病、球虫病及罗斯肉瘤等病的抗性和敏感性有关。
1.1MHC与抗病性主要组织相容性复合体（MajorHlstocompatibllltycomplex，MHC）是与抗病性和免疫应答密切相关的一组基因群，编码细胞表面特异性蛋白，存在于所有较高等的动物中。
猪瘟流行病学调查与防治策略
猪瘟流行病学调查与防治策略猪瘟（African swine fever，简称ASF）是一种病毒引起的传染病，主要侵袭猪类动物，对养猪业产生了严重的经济影响。
为了有效控制和预防猪瘟的传播，进行病毒的流行病学调查并制定相应的防治策略是至关重要的。
本文将详细介绍猪瘟的流行病学调查实践和相关的防治策略。
一、猪瘟的流行病学调查1.1 疫情调查：对于有猪瘟疫情的地区，需要进行详细的调查和统计工作，包括疫情的发生时间、地点、数量等重要信息，以便进一步了解病毒传播的规律。
1.2 传播途径调查：病毒的传播途径是猪瘟流行的重要原因。
通过调查猪瘟的传播途径，可以采取相应的措施来遏制病毒的蔓延。
常见的传播途径包括野生猪的传播、传染性病死猪的运输和销售、猪场间的感染等。
1.3 潜在宿主调查：除了猪类的感染外，一些野生动物也可能成为病毒的潜在宿主。
通过对野生动物的调查，可以更好地了解病毒的传播源头，从而采取相应的防治措施。
1.4 传播路线分析：通过分析疫情的传播路线，可以确定病毒的扩散路径，进而制定有针对性的控制措施，包括限制猪类流动、加强交通工具和器械的消毒等。
二、猪瘟的防治策略2.1 清除感染源：对于已经感染的猪类，及时隔离和处理，包括正确处理病死猪的尸体，以减少病毒的扩散风险。
2.2 封锁疫区：对于疫情严重的地区，可以采取封锁措施，限制猪类和病死猪的流动，以防止疫情的扩散。
2.3 解除封锁措施：当疫情得到有效控制后，可以逐渐解除封锁措施，但仍需要继续进行疫情监测，确保病毒不会再次传播。
2.4 病例报告和监测：建立健全的猪瘟病例报告系统，及时上报和监测疫情，以便于及时制定控制措施。
2.5 强化养殖管理：通过加强养殖环境的卫生管理，减少不洁饲料和水源的使用，提高猪场的防疫意识和技术水平，可以有效减少猪瘟的发生和传播。
2.6 疫苗研发和接种：科学家们正在不断研发猪瘟的疫苗，并推动疫苗的广泛接种，以增强猪类的免疫力，减少疫情的发生。
反向遗传学技术的应用
反向遗传学技术的应用杨彬1,王雪峰1,2,王凤龙1(1.内蒙古农业大学,呼和浩特 010010;2.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨 150001)摘要:反向遗传学是直接从遗传物质入手研究生命现象与规律,其相应的操作技术已在生命科学研究的各个领域显示出了广泛的应用前景。
作者对反向遗传学技术的应用进行了评述。
关键词:反向遗传学技术;病毒基因组;疫苗中图分类号:Q36 文献标识码:A 文章编号:167127236(2008)1220062203 反向遗传学是指对病原微生物的cDNA进行目的性修饰,从而对其进行功能和表型的分析(Berg,1993)。
它是相对于经典遗传学而言的,后者是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上,通过对靶基因进行必要的加工和修饰(如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等),再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组,让其装配出具有生命活性的个体,研究生物体基因组的结构与功能,以及这些修饰可能对生物体的表型、性状的影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
随着基因组序列测定技术的日渐成熟,反向遗传学技术的应用将越来越广泛。
目前反向遗传学技术已广泛应用于生命科学研究的各个领域,且在病毒研究方面已经显示出了巨大的作用。
1 用于病毒基因组结构与功能的研究 利用反向遗传学,可以对病毒的编码基因进行定向突变,从而可以知道该基因的编码产物在病毒生命周期中的作用,为药物和疫苗设计奠定结构生物学和细胞生物学的基础。
反向遗传技术在病毒、动物、植物等基因研究方面具有重大应用价值,并取得了较大进展。
①用于研究高等动植物相关基因功能:一些高等动植物测序完成后,最具有挑战性的工作就是确定所有基因序列的生物学功能,通过基因突变、删除等,利用反向遗传学方法来研究未知基因的功能已受到研究者收稿日期:2008204228作者简介:杨彬(1982-),男,内蒙古人,硕士,主要从事基础兽医学研究。
流感病毒的反向遗传学研究进展
流感病毒的反向遗传学研究进展本文从网络收集而来，上传到平台为了帮到更多的人，如果您需要使用本文档，请点击下载按钮下载本文档（有偿下载），另外祝您生活愉快，工作顺利，万事如意！反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
在病毒学研究中，反向遗传学常利用经修饰的克隆化cDNA用来获得有感染性的病毒，从而可研究这些修饰对表型产生哪些影响。
最早报道的是正链RNA病毒的反向遗传学系统。
将来自正链RNA的病毒全基因组RNA转染真核细胞，可使RNA充任mRNA(s)从而可翻译出病毒蛋白；反过来，这些蛋白又有助于完整病毒的包装。
与正链RNA病毒不同，负链RNA病毒的基因组无信使功能并且无感染性。
从病毒RNA开始转录需要病毒的核糖核蛋白复合体（RNP)的存在。
RNP对病毒RNA转录为mRNA和病毒基因组的复制是必须的。
利用反向遗传学，从cDNA获得的第一个完整负链RNA病毒是狂犬病毒。
另有一些研究者对Semia、Ebola病毒进行了反向遗传学研究，但拯救效率较之正链RNA病毒低得很多。
分节段的负链RNA病毒的反向遗传学操作尤显困难。
通过努力，分节段的负链RNA病毒的反向遗传学最终在布尼亚病毒上获得突破，并随后在流感病毒等取得了一系列进展。
此文就流感病毒的反向遗传学的发展历史及其应用作一综述。
1.流感病毒的反向遗传学发展概述流感病毒属正粘病毒科成员。
同多数负链RNA 病毒不同，流感病毒在感染细胞的核内完成复制。
在受体介导的吞饮和膜融合之后，病毒的核糖核蛋白复合体（vRNP)释放入细胞浆。
vRNP包括病毒RNA、核蛋白（NP)和3个多聚酶蛋白（PB1、PB2和PA)被运送至细胞核，在此完成转录和复制。
猪瘟疫苗在猪瘟防治上的应用技术
猪瘟疫苗在猪瘟防治上的应用技术猪瘟别名为“烂肠癌”，属于急性接触性传染病，该病毒的传染性和致命性非常高，对养猪行业的危害非常之高。
近年来用猪瘟疫苗防治猪瘟取得了突破性的进展，其中猪瘟兔化弱毒疫苗应用最广，然而猪瘟免疫失败的情况也较为常见，免疫失败与猪瘟的发病原理和人们防疫工作不到位有关。
本文主要阐述国内常见猪瘟疫苗的应用，分析猪瘟失败的原因，提出可行性建议。
一、国内常用猪瘟疫苗在猪瘟防治中的应用情况囿于政治、经济以及技术等方方面面的原因，猪瘟防治工作在我国的发展进程相对缓慢，加上猪瘟本身具备非常强的传染性，传播方式广，因此猪瘟防疫问题已成为世界性的养殖业难题，世界各地养殖场均投入大量资金防治猪瘟。
我国直到上世纪60年代初才开始发展猪瘟防疫，引入猪瘟疫苗并取得了突破性的进展。
近年来猪瘟结晶紫疫苗在猪瘟防御领域中取得了较好的防疫成果，经过多年的攻关研究，动物防疫业界众多专家学者的坚持不懈的努力下，猪瘟兔化弱毒疫苗研制成功，这为猪瘟防治工作开创了新的天地，属于里程碑杯式的成就，该疫苗在猪瘟防疫方面的效果受到国际上广泛认可，众多国家纷纷引入该疫苗。
二、导致猪瘟免疫失败的有关因素国内猪瘟免疫失败的现象非常普遍，其诱发因素，主要与养殖模式有关，个体养殖户采用庭院式的圈养方式，所养殖的猪群数量较少，养殖规模较小，且无统一的养殖标准，养殖的卫生条件较差。
除此之外，养殖户对养猪知识有较大的认知偏差，未能配备相应的养殖防疫器材。
养殖防疫器材配备不到位的情况下，为猪瘟的传播留下养殖隐患，一旦猪圈中有母猪感染上猪瘟，其所产下的猪仔也会成为持续感染体，会导致猪瘟疫苗无法发挥应有的免疫效果，由此形成恶性循环，最终造成猪瘟免疫失败。
三、主流猪瘟疫苗随着我国兽医界在猪瘟防治工作中不断突破，猪瘟疫苗种类也逐渐增多，猪瘟疫苗免疫效果也不断提升。
当前猪瘟防治工作中采用的主流疫苗有猪瘟淋脾苗、猪瘟乳兔苗以及猪瘟兔化细胞苗。
猪瘟淋脾苗借助猪瘟兔化弱毒株用于培育成年母兔，之后通过无菌工艺处理得到高毒量对的淋巴结细胞，最后进行脾脏加工形成了疫苗，淋脾苗的主要防御优势在于该疫苗的免疫响应速率非常快，用其进行接种效果非常之好，一旦接种之后会迅速生成抗体，抗体在体内的维持时间较长。
反向遗传学技术共20页
等的感染性分子克隆，并用多个质粒共同转染法成 功拯 救了一些分节段的负股 R N A病毒 ，如布尼 安病毒、流感病毒等 。
3.反向遗传学研究的重要方法RNA干扰技术的应用
•
1. 生物的每个组织、 细胞所携带的遗传信
1.反向遗传学的定义
•
1.反向遗传学是相对于经典遗传学而提
出的，经典遗传学就是从生物的表型、性状来
推测其遗传物质组成、分布与传递规律等。反
向遗传学则是在已知基因序列的基础上，利用
现代生物理论与技术，通过核苷酸序列的突变、
缺失等手段创造突变体并研究突变所造成的表
型效应。即是直接从生物的遗传物质入手来研
2 反向遗传学技术与病毒
•
病毒亚型众多，且
极易发生变异，给防控
带来很大困难，所以当
务之急应加强其在致病
机理、传播机制等方面
的研究和加快新型病毒
疫苗的开发．近年来，
反向遗传学技术的发展
为病毒基因功能研究和
疫苗制备方面开辟了新
思路．主要有以下几方
面：
1.用于拯救病毒和创造新 的病毒
• 1.根据一些病毒的有关的已知核酸序列，采用 反向遗传学操作技术可以构建出“人为设计” 的病毒，得到以人工合成的寡核苷酸或 已消 失 的病 毒核 酸 序列 为 基 因组 的新 型 病 毒， 这给获得高免疫原性的低致病力毒株来制 造疫苗提供了 一个全新的途径。也可在生产疫 苗时 ， 将流行毒株与高产毒 株进行基因重配， 得到同时具有高产特性和流行毒株抗原性 的重 组毒株， 以提高疫苗产量。
3.反向遗传学技术的建立 ， 大大加快了 R N A病毒在分子水 平上研究进程， 使得对负股 R N A病毒进行遗传学操作成为可 能。早在 1 9 8 9年 L u y 1 j e s 等 利用体外转录技术， 在体外转录 本中插入来源于流感病毒基因组的调控序列， 并在 体外得到 具有 活性 的 RN A .蛋 白复合 物 RN P， 获 得 了在 宿 主细 胞 内 复 制、 表达包装而成的 病毒粒子。此外， 也可利用多个质粒系统 共同转 染细胞， 获得到感染性的病毒。
非洲猪瘟荧光定量pcr检测原理
非洲猪瘟荧光定量pcr检测原理非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是一种严重的猪类传染性疾病，其病毒属于病毒超科阿斯法瑞毒科（Asfarviridae），感染后会导致高死亡率的猪群流行，并对猪类养殖业造成巨大损失。
为了及时、准确地检测非洲猪瘟病毒，荧光定量PCR （qPCR）技术被广泛应用。
荧光定量PCR是一种基于PCR的扩增技术，它结合了荧光探针技术和实时监测技术，能够实现对目标DNA分子的定量分析。
非洲猪瘟荧光定量PCR检测原理如下：1. 样品制备：从猪体组织或血液样品中提取总RNA或DNA，并进行纯化处理，以去除潜在的抑制性物质。
2. 反转录（RT）过程：如果使用RNA作为样品，需要首先将RNA转录成相应的cDNA。
反转录过程中，将RNA模板与反转录酶和引物结合，通过逆转录反应将RNA转录成cDNA。
反转录后获得的cDNA用作PCR的模板。
3. 目标基因扩增：设计引物和荧光探针，使其与非洲猪瘟病毒的特定序列互补。
引物的5'端和3'端各位于荧光探针结构的两个相邻区域。
扩增反应用荧光标记的引物，在PCR反应体系中，引物与模板DNA碱基互补，引物结合并扩增目标DNA。
4. 荧光信号检测：荧光信号检测系统包括荧光DNA探针、荧光素酶等。
在PCR的扩增过程中，当荧光探针与目标DNA靶标序列匹配时，探针被引物的3'端剪切酶切割，释放荧光信号。
系统通过光学检测设备实时监控荧光信号强度，并记录下来。
5. 数据分析：荧光强度与扩增的目标DNA数量成正比，可以根据标准曲线或特定算法计算出非洲猪瘟病毒的总量。
非洲猪瘟荧光定量PCR的优点在于：高度敏感、高度特异性、快速、准确、自动化和多重检测。
该方法能够在几个小时内完成检测，并且能够在感染早期就进行检测，有助于控制病情的扩散。
参考文献：1. Yanez RJ, Rodriguez JM, Nogal ML, et al. Analysis of the complete nucleotide sequence of African swine fever virus. Virology. 1995;208(1):249-278.2.서성배, 박성진, & 김연희. (2017). 동물마약물검사증탁-polymerase chain reaction 적용미국합동작전편성부대의비구루비르스검출률나타내기 / Evaluation of Bovine viral diarrhea virus detection rate in thiacloprid-polymerase chain reaction applied combined force conducting animal narcotics test. Korean Journal of Veterinary Research, 57(3), 163-168.3. Gallardo C, Nieto R, Soler A, et al. Experimental Transmissionof African Swine Fever (ASF) Low Virulent Isolate NH/P68 by Surviving Pigs. Transbound Emerg Dis. 2013.4. Zhang Z, Geng G, Wang N, et al. Development of a TaqMan-Based Real-Time PCR Assay for Rapid and Specific Detection of Nigerian Isolate of African Swine Fever Virus. J Sci Food Agric. 2016;97(12):3986-3991.5.Zhai S, Zou J, Wang L, et al. Comparative transcriptome analysis shows that the extracellular matrix receptor interaction contributesto the venous metastases of hepatocellular carcinoma. Cancer Genomics Proteomics. 2020;17(3):297-311.。
猪瘟病毒Erns基因的克隆与序列分析
摘 要 ： 了解 山 东地 区猪 瘟病 毒 的变 异情 况 ， ６份 经 ＲＴ Ｐ Ｒ方 法鉴 定为猪 瘟病 毒 （ Ｓ Ｖ） 为 将 —Ｃ Ｃ Ｆ 阳性 的
株 的 方 向 变 异 ［ ］ 因 此 ， 展 猪 瘟 病 毒 分 子 流 行 病 ２ 。 开
基 因的变 异及 生 物学 功能研 究提 供参 考 。
Hale Waihona Puke １ 材 料 与 方 法 １ １ 材 料 ．
１ １ １ 病料 ． ．
病料 采集 山东 省 济南 、 州 、 坊 、 德 潍 济
学 调查 ， 了解 猪瘟 病 毒流行 株 的变 异 情况 ， 猪 瘟 流 对 行 及其 防控 具有 重要 意义 。
山东地 区患病 猪 的病料 接种 Ｐ — ５细胞 ， 离得 到 ６株 猪 瘟病 毒 。 对该 ６株猪 瘟 病 毒 的 Ｅ 。 因主要 抗原 Ｋｌ 分 基
编 码 区序 列 进 行 了 Ｒ — Ｃ 扩 增 、 隆 、 序 ， 经 Ｄ ＴＰ Ｒ 克 测 并 ＮＡ ｔｒ 件 对 测 序 结 果 与 ＨＣ Ｖ 疫 苗 株 、 ｈｍｅ Ｓａ 软 Ｌ Ｓ ｉ ｎ株 及 Ａｌ ｒ 株 Ｅ 基 因进 行 比较 和 分 析 ， 建 了 Ｃ Ｆ 遗 传 进 化 树 。 结 果 扩 增 的 ６株 山 东 Ｃ Ｆ 分 离 株 Ｅ 。 ｆ ｔ ｏ 构 Ｓ Ｖ Ｓ Ｖ 基 因 同 源性 为 ９ ． ～ １ ０ ， ＨＣ Ｖ 疫 苗 株 ， ｈｍｅ ８５ ０ 与 Ｌ Ｓ ｉ ｎ株 及 Ａｆ ｒ 株 的 同 源 性 为 ８ ． ～ ８ ． ；６株 ｌ ｔ ｏ ２９ ５２
反向遗传操作技术（reversegenetics）与经典的从表型改变到进行基..
反向遗传操作技术反向遗传操作技术( reverse genetics)与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思路相反，是指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在病毒cDNA 分子水平上对其进行体外人工操作，也被称为“病毒拯救( the rescue of virus) ”。
反向遗传学是相对于经典遗传学而言的。
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入\缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。
与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。
RNA病毒的反向遗传学,是采用病毒的遗传材料,在培养细胞或易感宿主中重新拯救出活病毒或类似病毒物质。
能够拯救病毒的遗传材料称为感染性克隆,一般是在细菌质粒中含有整个病毒基因组的cDNA拷贝,使得cDNA本身或从cDNA体外转录所得的RNA具有感染性。
RNA病毒的反向遗传系统通过定向修饰病毒的基因组序列,检测被拯救的人工改造病毒的表型,可以在体内(in vivo)有效地研究病毒基因结构、功能和病毒-宿主相互作用。
自1978年第一例RNA病毒Qβ噬菌体的成功拯救以来,各类RNA病毒的分子生物学研究取得了长足的进展,这主要归功于各种RNA病毒反向遗传系统的建立和发展。
该技术的核心是首先构建RNA病毒的全长cDNA分子，并使之受控于RNA聚合酶启动子，通过体外转录过程再次得到病毒RNA，然后将该转录物RAN转染哺乳动物细胞可拯救到活病毒，由于这种拯救病毒是来自全长cDNA分子,因此可以在DNA水平上对病毒基因组进行各种修饰或改造,然后通过拯救病毒的表性变化来判断这些基因操作的效果,从而达到对病毒基因组表达调控机制,病毒致病的分子机理等进行研究的目的,甚至还可以得到减毒毒株，开发新型的疫苗。
畜禽抗病遗传育种研究进展
WENKU DESIGN
猪抗病育种案例
猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）
通过全基因组关联分析（GWAS）和基因编辑技术，发现并验证了多个与 PRRS抗性相关的基因，成功培育出抗PRRS的猪品种。
猪瘟（CSF）
利用基因组学和分子生物学技术，筛选出与猪瘟抗性相关的基因，并在生产中 推广抗猪瘟的种猪。
鸡抗病育种案例
PART 02
畜禽抗病遗传育种基础知 识
REPORTING
WENKU DESIGN
抗病性的遗传基础
01
抗病性基因
抗病性基因是决定畜禽抗病能力 的主要因素，通过研究这些基因， 可以了解抗病性的遗传机制。
02
基因组学
基因组学研究有助于发现与抗病 性相关的基因和变异，揭示抗病 性的遗传基础。
03
表型与基因型关联 分析
牛病毒性腹泻（BVD）
通过全基因组关联分析和基因编辑技术，发现并验证了多个与牛病毒性腹泻抗性相关的 基因，培育出抗牛病毒性腹泻的牛品种。
PART 05
结论与建议
REPORTING
WENKU DESIGN
研究结论
01
畜禽抗病育种研究取得显著进 展，成功培育出多个抗病性能 强的新品种，有效提高了畜禽 的抗病能力和生产效益。
高育种效率。
完善育种政策，加强知识产权保 护，鼓励企业加大研发投入，推 动抗病育种成果的转化和应用。
研究展望
深入研究畜禽抗病的分子机制 和遗传基础，为抗病育种提供
更加精准的育种靶标。
探索新型育种技术与方法， 如基因编辑、细胞工程等， 提高抗病育种的技术水平和
效率。
加强国际合作与交流，引进国 外先进的抗病育种技术和理念， 推动全球畜禽抗病育种研究的
反向遗传技术的原理及应用
反向遗传技术的原理及应用1. 原理介绍反向遗传技术是一种通过逆向操作模拟自然选择的方法，用于加速生物进化或优化基因组。
其基本原理是通过改变目标物种的DNA序列，进而改变其表现形态或性状，实现对目标物种的自然选择并加速进化过程。
反向遗传技术的主要步骤包括：•DNA序列编辑：通过基因编辑技术，如CRISPR-Cas9或TALEN等，将目标物种的DNA序列进行修改。
这些修改可以涉及单个基因的突变、插入或删除，也可以是多个基因的同时改变。
•体外选择：将编辑后的目标物种进行体外培养或实验室筛选，利用特定条件或选择因子来筛选出具有所需性状或表现形态的个体。
•基因传递：通过基因传递技术，将经过选择的个体的改变后的基因传递给下一代物种，进一步推动整个种群的进化。
2. 应用领域反向遗传技术在各个领域都有广泛的应用，以下列举几个常见的应用领域：2.1. 农业•改良作物品质：通过反向遗传技术可以改变作物的品质，使其具备更好的抗病性、适应性或产量等性状。
•新品种培育：通过反向遗传技术可以快速培育出具备特定性状的新品种，以满足市场需求。
2.2. 医学•基因疾病研究：反向遗传技术可以帮助科学家研究基因与疾病之间的关系，为疾病的防治提供理论依据。
•基因治疗：通过修改患者的基因，使用反向遗传技术可以治疗一些遗传性疾病，如囊性纤维化等。
2.3. 生态保护•物种保护：反向遗传技术可以帮助保护濒危物种，改变其基因以增强其存活能力。
•生态修复：通过反向遗传技术，可以改变某些生物的基因，使其能够适应污染环境或帮助生态系统的修复。
3. 优点与挑战3.1. 优点•加速进化：反向遗传技术可以加速物种的进化过程，使得科学家能够更快地获得具备特定性状的物种。
•精准修改：反向遗传技术基于现代基因编辑技术，可以精确修改目标物种的DNA序列，实现精准的基因改变。
3.2. 挑战•安全性问题：反向遗传技术可能带来一些未知的风险或副作用，需要在实际应用中进行充分的安全评估。
人工智能在非洲猪瘟诊断和监测上的应用探索
人工智能在非洲猪瘟诊断和监测上的应用探索人工智能（Artificial Intelligence，简称AI）作为一项新兴技术，正在各个领域展现出巨大的潜力和广阔的前景。
近年来，非洲猪瘟（African Swine Fever，简称ASF）在全球范围内蔓延，给猪业带来了严重的损失，而人工智能的应用则为ASF诊断和监测提供了新的解决方案。
一、人工智能在ASF诊断上的应用1. 图像识别技术人工智能技术的核心之一是图像识别，利用深度学习算法，可以对ASF猪只的外观特征进行快速准确的识别。
通过将ASF猪只的图像输入人工智能系统，系统可以自动识别ASF相关特征，如皮肤瘀斑、发热、食欲下降等，从而实现快速诊断。
2. 声音识别技术人工智能还可以利用声音识别技术辅助ASF的诊断。
ASF猪只在患病过程中会产生特征性的声音，人工智能系统可以通过分析这些声音的频谱、频率等特征，进行疾病诊断。
声音识别技术不仅可以提高ASF的诊断准确率，还可以实现无接触式的诊断，减少感染传播的风险。
3. 数据挖掘与分析ASF的诊断离不开大量的数据支持。
人工智能通过数据挖掘和分析技术，可以从各种数据来源中提取、整理和分析ASF疫情的相关信息。
例如，可以通过分析猪场的运营数据、猪只的体温、饲养环境参数等，建立数据模型，预测ASF的传播趋势，提前制定防控方案。
二、人工智能在ASF监测上的应用1. 基于遥感技术的监测遥感技术结合人工智能可以实现对ASF疫情的远程监测。
利用遥感卫星、无人机等平台获取的图像数据，结合人工智能的图像识别算法，可以实时监测ASF疫情的扩散范围和疫点的分布情况。
这为相关部门采取针对性的应对措施提供了及时准确的数据支持。
2. 基于社交媒体的监测社交媒体平台是人们信息交流与获取的重要途径之一。
人工智能可以通过对ASF相关信息的监测，包括用户发布的文字、图片、视频等内容进行筛查与分析，提前发现ASF的疫情动态和传播风险。
此外，人工智能还可以通过对用户行为和情感的分析，及时反馈疫情对社会心理的影响，为精准防控提供参考。
092406123李文宣RN_A_病毒反向遗传
毒致病机理、 构 建病毒载体 及感染性克隆 等 。
负股 RN A病毒能启动感染宿主细胞的最小单 位是基因组 或反义基因组 R NP复合物和病毒RNA 聚合酶。因此构 建重组 负股 RN A病毒首先要合成 有活性的 RN P复合物。 可以通过体外和体 内两种 方法来合成有感染性 RN P。E n a mi 等 ( 1 9 9 0 ) 首次 成功地在体外合成了有活性的 RNP： 他将经人工改 造的流感病毒的一个 RNA节段 NA 与提纯的病毒 N蛋 白、 病毒 RNA聚合酶共 作， 形 成 了 有 活性 的RN P， 再通过与辅助病毒共感染细胞获得有 感染性的含有插入 的 NA基因的拯救病毒。P l e s c h k a s等( 1 9 9 6 ) 首次采用细胞内方法合成 RN P： 第一个质 粒是人聚合 酶启动子驱动的流感病毒 RNA片段 ， 两侧 为人丁型肝炎核酶序列 ， 该质粒同 P o l l l酶驱 动的反式 表达病毒聚合酶蛋 白 P B 1 、 P B 2 、 P A和核蛋 白NP 的质粒共转染细胞 ， 在胞 内形成具有复制转 录功能 的
感染性要强得多， 而且全 长 c DN A克隆相当稳定【 柏 J 。已有报 道由全长 c D N A克隆获 得的正链 R N A病毒的毒性要超过原毒株。 P e e t e r s 等在新 城疫病毒 L a S o t a 毒株 F蛋白的裂解位点引 入 3个碱基的突 变， 拯救出的 N DV毒力大大增加， 脑内致病指数 (intracere— bral pathogenicity index，ICP I ) 达到 1 ． 2 8 【 7 J 。通过病毒的反 向遗传操作技术现人们可 获得 已经绝种的流感病毒株， 如 1 9 1 8 年西班牙流感病毒剧毒株 【 4 引。人工合成的转录本具 有生物活性， 在病毒复制过程中也 可能会发生 R NA重组或 基因突变。所有这些均提示， 研究者在利 用该技术时要充分 考虑到生物安全问题， 不能盲 目和随意地去构
猪瘟病毒蛋白的结构与功能
猪瘟病毒蛋白的结构与功能李 军 杨 威3 陈凤莲 赵 武 (广西兽医研究所 广西南宁 530001) 猪瘟是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一种急性、热性和高度接触性的病毒性传染病。
猪瘟因其流行广泛、发病率和死亡率高,给许多国家的养猪业造成巨大的经济损失,在世界动物卫生组织制定的《国际动物卫生法典》中,它被列为A类16种法定传染病之一;在我国制定的《家畜家禽防疫条例实施细则》中也被列为一类传染病。
当前猪瘟防治主要还是依赖于疫苗,虽然猪瘟疫苗的使用降低了猪瘟的发病率和死亡率,但是CSFV持续性感染导致的免疫失败,使人们开始把研究重点转向对病毒与宿主相互作用的研究。
反向遗传学技术的出现,为我们了解病毒的基因结构、蛋白功能、基因重组提供了技术平台,得以从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的基因组和蛋白组,这使得CSFV的病原学研究取得了新突破。
本文现将国内外近年来对CSFV基因结构、病毒蛋白功能上的研究作一综述。
1 病毒的基因组结构CSFV是一种有囊膜的正链单股RNA病毒,与牛病毒性黏膜腹泻病毒(BVDV)和羊边界病毒(BDV)同属黄病毒科瘟病毒属成员。
CSFV基因组大小约12.3kb,5’非编码区由373个核苷酸组成,含有RNA复制所需的顺式作用元件和一个帽不依赖性翻译所需的内部核糖体进入位点;3’非编码区约由229～244个核苷酸组成,参与RNA的复制。
CSFV 只编码一个大约3900氨基酸残基的多聚蛋白开放阅读框(ORF),该多聚蛋白在翻译过程中和翻译后,在病毒编码的蛋白酶和宿主细胞酶的作用下,分解成为4个结构蛋白(C、E rns、E1和E2)和8个非结构蛋白(N pro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。
2 病毒的蛋白CSFV蛋白在病毒基因组的编码顺序为:N pro、C、E rns、E1、E2、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。
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动物医学进展,2005,26(2):9212Progress in Veterinary Medicine逆向遗传学技术在猪瘟病毒研究中的应用张淼涛,张彦明(西北农林科技大学动物科技学院,陕西杨陵712100)中图分类号:S852.651;S821.2文献标识码:A文章编号:100725038(2005)022*******摘 要:猪瘟是猪的最严重疾病之一,其病原是猪瘟病毒,基因组为单股正链RNA。
猪瘟弱毒疫苗在猪瘟的免疫防治中发挥了巨大作用,但由于弱毒疫苗免疫的动物不能从血清学上与自然感染动物区分,使其应用受到很大限制,研制标记疫苗是解决这个问题的重要途径。
由于RAN的结构不稳定成为阻碍RNA病毒研究的主要障碍,所以病毒分子生物学是新型猪瘟疫苗研究的必要手段。
近年来兴起的逆向遗传研究将RNA病毒的基因组转化为cDNA,文章就猪瘟病毒逆向遗传研究的意义、方法、概况及其在猪瘟新型疫苗研究中的应用进行了全面综述。
关键词:逆向遗传学;猪瘟病毒;全长cDNA 猪瘟(Hog cholera,HC),又称为古典猪瘟(Classi2 cal swine fever,CSF),是世界范围内猪的最严重的疾病之一,因而被OIE列为A类传染病。
猪瘟病毒(CSFV或HCV)是黄病毒科(Flaviviri dae)猪瘟病毒属(P estivirus)的成员,为有囊膜的病毒,基因组为单股正链RNA,含有一个大的开放性阅读框(open reading frame,ORF),ORF两侧分别是5′2端非翻译区(5′2U TR)和3′2非翻译区(3′2U TR)。
CSFV的所有结构蛋白和非结构蛋白均由ORF所编码,翻译成一个含3898个氨基酸的多聚前体蛋白。
这一大型前体蛋白以共翻译和后翻译的形式在细胞蛋白酶和病毒特异的蛋白酶作用下,加工成结构蛋白和非结构蛋白。
逆向遗传学技术在猪瘟病毒研究中的应用,有力地推动了猪瘟病毒的研究。
它的基本内容包括通过R T2PCR获得猪瘟病毒的cDNA拷贝,进一步连接构建出猪瘟病毒的全长cDNA克隆,通过对该全长cDNA特定基因工程操作,利用反转录等方法再将其转变为RNA,然后用改造后的病毒RNA转染适宜的宿主细胞,从而研究猪瘟病毒基因组的功能、病毒的致病和致弱机理等重大问题,使猪瘟新型疫苗的研制呈现出令人鼓舞的局面。
收稿日期:2004207210 基金项目:陕西省科技攻关项目(2003K22G11201) 作者简介:张淼涛(1963-),男,陕西礼泉人,副教授,主要从事动物生理学及病毒分子生物学研究。
Progress of Study on Major Virulence F actors in Enterotoxigenic Escherichi a coli YUAN G Wan2zhe1,H E K ong2wang2,L U Cheng2ping3,HAO Qin2zong1,Q IU Xiao2liang1,ZUO Yu2zhu1(1.College of A ni mal S cience Technolog y,Hebei A g ricult ure Universit y,B aoding,Hebei,071001,Chi na;2.Key L ab of A ni mal Poult ry Diseases Diagnostic,Minist ry of A g ricult ure,J iangsu A cadem y of A g ricult ure S cience,N anj ing,J iangsu,210014,China;3.College of V eterinary Medicine,N anj ing A gricult ure Universit y,N anj ing,J iangsu,210095,Chi na) Abstract:The virulence factors of Escherichi a coli(ETEC)include adhesin,enterotoxin,edema disease p rinciple,endotoxin,haemolysin and EatA,of which t he adhesin and enterotoxin are very important in pat hogenesis and immunology.K88,K99,987P and F41are t he most prevalent.Enterotoxins include heat2 labile enterotoxin and heat2stable enterotoxin.K ey w ords:adhesin;enterotoxin;virulence fator;ETEC1 猪瘟病毒逆向遗传学研究的意义尽管以C株为主的弱毒疫苗在猪瘟的防制中功不可没,但在数十年来的免疫接种压力下,猪瘟抗原逐渐产生变异,猪瘟流行和发病特点在世界范围内发生了很大变化。
用弱毒疫苗免疫常常造成免疫失败。
另外,注射普通弱毒疫苗已影响到国际贸易问题,因为在美国等发达国家已消灭了猪瘟,禁止了弱毒疫苗的使用。
由于担心在普通免疫的“保护伞”下隐藏有猪瘟野毒,因此,这些已宣布消灭了猪瘟的国家,严密注视其他国家的疫情,不从任何有猪瘟和注射猪瘟弱毒疫苗的国家进口猪肉类制品,其主要原因是用弱毒疫苗免疫的动物不能用血清学方法鉴别猪群是感染了野毒,还是注射了疫苗。
许多经济发达国家采取扑杀的办法净化疫区[1]。
1996年至1998年,荷兰等8个国家发生猪瘟,扑杀2000余万头猪,造成了巨大的经济损失。
因此,研制新型安全、高效并能区分自然感染的带有标记的猪瘟疫苗已成为当务之急。
通过基因工程手段研制新型猪瘟疫苗是目前疫苗研制的最主要方法。
猪瘟病毒的遗传结构是RNA,通过逆向遗传学技术将其转变为DNA形式,才使猪瘟病毒的基因工程操作成为可能。
2 猪瘟病毒感染性cDNA的构建2.1 病毒RNA的提取一般采用商品化的RNA提取试剂盒,如Total RNA isolation system,或Trizol reagent等。
用试剂盒提取RNA,可防止RNA的降解,并能提高RNA的纯度和产量。
2.2 R T2PCR技术对病毒基因组的扩增参考所测序列或公布的其他毒株的序列合成引物,将基因组分成几个重叠小片段,单独进行逆转录和PCR反应。
一般对于1kb以下的片段,可将逆转录和PCR反应置于同一体系中进行,但对于2kb ～3kb或更长的片段,为取得良好的PCR效果,最好使逆转录和PCR反应分开进行,PCR下游引物可用逆转录引物,亦可设计一位置适当前移的引物作为PCR的下游引物。
2.3 连接构建全长cDNA对扩增的各个片段进行克隆,测序验证,然后按照一定的技术路线连接起来以构建全长cDNA。
实验的每一步都应该作严格的筛选和鉴定,一般将基因组分为5′端和3′端2个半长分子,每个半长分子按照单独的路线进行连接,然后将这两个半长分子连接于一个载体中。
为确保连接构建的顺利进行,重组质粒的抽提最好选用商品化的质粒提取试剂盒取代传统的碱裂解法,如选用Wizard plus mini2 p rep s system。
以LA2PCR为主的PCR技术在很大程度上减少了全长构建的环节,一些耐热逆转录酶如GIBCO 公司的SuperScriptⅡRNase H–在较大程度上限制了逆转录过程中RNA二级结构对反应的影响,另外,Taq DNA聚合酶性能的提高,对该技术的应用起了直接的推动作用。
但亦有研究者发现,L A2 PCR的结果不稳定,PCR产物分子间、分子内容易发生重组,同时在PCR产物内常常有大量的点突变,因此该技术仍有待进一步完善[2]。
3 体外转录使用RNA聚合酶在体外将全长cDNA转录为基因组RNA,通常在转录后用无RNase的DNase 降解转录产物中的DNA模板,然后,对RNA进行纯化,再通过电泳初步鉴定转录产物。
应该注意的是,操作过程中使用的枪头及试剂应防止RNase的污染,以避免转录产物RNA的降解,同时应根据RNA电泳的结果证实全长转录产物达到一定的相对含量,以保证继后的转染。
4 转染和感染性的鉴定猪瘟病毒的核酸为正链RNA,单独就具有感染性,所以将纯化后的转录产物直接转染适宜的宿主细胞如P K215细胞或S K26细胞,就可能产生病毒离子。
由于猪瘟病毒通常对宿主细胞不产生细胞病变,因而无法通过细胞的形态变化来判定病毒的复制。
一般采用抗原检测如免疫荧光抗体检测抗原、EL ISA检测抗原等,再进行动物试验作进一步鉴定,对于弱毒疫苗株C株用兔体热反应可特异性地检测病毒的复制。
感染性鉴定中应注意以母本病毒为对照。
5 猪瘟病毒逆向遗传学研究概况对RNA直接进行基因操作的困难成为长期以来阻碍猪瘟遗传工程疫苗研制的主要障碍,逆向遗传学技术的应用加速了猪瘟病毒及猪瘟新型疫苗的研究步伐。
Meyers G等在测定了CSFV5′端和3′端序列后,构建了CSFV全长cDNA克隆[3]。
将由cDNA 体外转录得到的RNA转染猪肾细胞后,复活了感染性的CSFV。
同时以来自致细胞病变的CSFV缺损干扰颗粒(defective interfering particles,Dis)基因组的相应片段替换构建的全长cDNA导入缺失,从体外转录的RNA可以复活致细胞病变的猪瘟病毒,这个发现证实了先前基因组中的缺失与它们的01动物医学进展 2005年 第26卷 第2期(总第136期)致细胞病变性有重要关系的假说。
该系统的建立使猪瘟病毒分子生物学研究,尤其使病毒致弱和细胞致病性的分子基础的研究更为深入。
Ruggli N等以CSFV Alfort/187株几个R T2 PCR独立体系所得到的DNA片段克隆构建了3个cDNA文库[4],然后将克隆片段组装后得到了全长cDNA克隆pA18721。
第1个CSFV基因组核苷酸放在T7启动子的转录启始位点,在病毒cDNA3′末端精确导入的S rf I限制性位点,确保了转录的正确终止。
这种RNA在猪肾细胞中证明具有感染性。
从培养和克隆10代的细菌中分离的来自质粒DNA的RNA转录产物,仍具有感染性,这表明全长感染性克隆在细菌细胞中极其稳定。
将一个沉默点突变导入到基因组1182位点,在从感染细胞中复活的重组病毒中被保留下来。
用CSFV CA P株相应的cDNA片段换掉pA18721中一个长696bp 的片段,得到一个感染性的嵌合体,可被用来详细研究病毒的分子生物学特性及其致病机理。
Moser C等将编码细菌氯霉素乙酰转移酶(chloramp henicol acet hl t ransferase,ACT)基因插入到CSFV Alfort/187株全长cDNA克隆pA18721的N pro基因中,从重组质粒中体外合成的RNA转录产物转染S K26猪肾细胞。