血凝仪

血凝仪－APTT 法测定肝素的效价
肝素( heparin) 系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖，血凝仪是一种多相性成分的生物制品，具有延长凝血时间的作用，临床上广泛应用于各种血栓栓塞性疾病的防治。

效价测定是其质量控制的重要内容。

现行中国药典( ChP 2010) 收载的肝素生物测定法为家兔全血法和兔( 猪) 血浆法，分别首载于1977 年版中国药典和1985 年中国药典增补本，至今已沿用20 余年无修改。

此 2 种方法操作复杂，人为干扰因素多，客观性欠佳，因此亟待寻求更为科学、客观、简便的方法替代。

目前，肝素效价的测定方法除我国的家兔全血法和兔( 猪) 血浆法外，还有羊血浆移位均值法( USP 33) 、抗Ⅹa 因子效价测定法( USP 33、JP 2006 和BP 2008) 以及活化部分凝血活酶时间法( APTT 法，BP 2008) 。

作为药典标准的检验方法应当具备客观，准确，重现性好，精密度高的特点，同时还应便于操作，成本低廉。

本实验室在活化部分凝血活酶时间法( BP 2008) 的基础上，建立了一种基于血液凝固分析仪测定活化部
分凝血活酶时间的肝素生物测定法( 以下简称血仪－APTT 法) 。

本文对该方法用于肝素钠的生物效价测定进行了方法学考察，并从实验方法的客观性、可操作性、准确性、精密性以及成本角度与家兔全血法和羊血浆法进行了比较，同时考察了不同仪器对血凝仪－APTT 法的影响，为建立新的肝素生物测定法提供参考。

1 仪器与材料
1. 1 仪器和试剂LG －PABER 血小板聚集凝血因子分析仪( 北京) ; ACL ELITE PRO 全自动血液凝固分析仪( 美国) ; 肝素钠标准品( 批号: 0509 －9911，效价204 IU·mg－1，约20 mg，中国食品药品检定研究院组织标定第11 批肝素钠国家标准品) ; 0. 9%氯化钠注射液( 北京双鹤药业股份有限公司) ; 柠檬酸钠( AR，北京化学试剂公司) ; APTT 试剂盒( 北京世帝科学仪器公司) ; 肝素钠注射液( 2 mL∶12500 单位，批号101022，1108505，A 厂) ; 肝素钠注射液( 2 mL∶12500单位，批号1112108，B 厂) 。

1. 2 动物兔( 日本大耳白) ，购自北京维通利华公司，动物许可证号: SCXK( 京) 2005 －0002。

2 方法
2. 1 标准品稀释液的制备精密称取肝素钠标准品适量，按标示效价溶于灭菌注射用水配制成100 IU·mL －1的标准品储备液。

精密量取标准品储备液适量，用生理盐水精确配制为高、中、低 3 个剂量的标准品稀释液，剂间(r) 为1∶0. 85。

2. 2 供试品稀释液的制备供试品按标示量或估计效价，配制成与标准品稀释液相同浓度的高、中、低3 个剂量的供试品稀释液，剂间比( r) 与标准品稀释液一致。

2. 3 血浆的制备迅速收集兔血置预先放有109 mmol·L－1枸橼酸钠溶液的容器中，枸橼酸钠溶液与血液容积之比为1∶9，边收集边轻轻振摇，混匀，室温下2500 r·min－1离心15 min，立即分离出血浆。

新鲜血浆在4 h 内使用，或分成若干份分装于适宜容器内，－20 ℃冻结贮存，临用时置( 37 ±0. 5) ℃水浴中融化，用两层纱布或速滤纸过滤后使用。

2. 4 测定方法取血凝仪样品杯，每孔加入兔血浆50 μL 和一种浓度的标准品或供试品稀释液50 μL，然后加入磁珠搅拌混匀，再加入APTT 试剂50 μL，37 ℃准确预温180 s 后，加入CaCl2试剂50 μL，然后立即用LG －PABER 血小板聚集凝血因子分析仪测定各孔的凝血时间。

2. 5 结果统计每组标准品和供试品的稀释液平行测定3 ～5 次，将凝血时间进行对数转换，按生物检定统计法中的量反应平行线
3. 3 法计算供试品的效价。

3 方法学考察结果
3. 1 线性范围考察由于样品的含量与测定指标在一定范围内线性关系良好是生物检定法适用的前提，因此本文对肝素钠浓度与活化部分凝血活酶时间( APTT) 的对数值进行了相关性分析。

配制一系列不同浓度的肝素钠标准品稀释液，按照“2. 4”项下方法测定试验系的APTT，以测得的APTT 的对数值( 对数凝血时间) 为纵坐标，以肝素钠浓度为横坐标，进行线性回归，回归方程为:Y = 0. 2815X + 1. 258，r = 0. 9965肝素钠的浓度在0. 7 ～3 IU·mL－1范围内，试验系的对数凝血时间与肝素钠浓度呈良好的线性关系。

3. 2 重复性考察按照上述线性范围，对同一份肝素钠供试品( 用肝素钠标准品模拟，理论效价为204 IU·mg－1) ，按“2. 4”和“2. 5”项下方法连续进行6 次生物效价的测定。

结果该供试品的平均测得效价为
( 206. 45 ±2. 98) IU·mg－1，RSD 为1. 45%，平均可信限率为3. 74% ±0. 61%。

3. 3 中间精密度考察按照上述线性范围，独立配制6 组标准品和供试品( 用肝素钠标准品模拟，理论效价为204 IU·mg－1) 稀释液，独立制备 6 份血浆，按“2. 4”和“2. 5”项下方法进行6 次完生物效价测定。

结果该供试品的均测得效价为( 20
4. 50 ±3. 30) IU·mg－1，RSD 为1. 61%，平均可信限率为 3. 70% ±0. 72%。

3. 4 回收率试验精确配制5 组供试品稀释液( 用肝素钠标准品模拟) ，使每组高、中、低3 个剂量分别相当于标准品稀释液高、中、低 3 个剂量的70%，80% ，100% ，120% ，130% ，即5 组供试品稀释液相对应的 5 个供试品的理论效价分别为142. 8，163. 2，20
4. 0，244. 8，26
5. 2 IU·mg－1。

按“2. 4”和“2. 5”项下方法，分别测定5 个供试品的效价，计算测得效价与理论效价之比(%) ，即为该条件下肝素钠的回收率。

结果见表1。

4 讨论
线性范围考察结果显示，在本试验条件下，肝素钠的浓度在0. 7 ～3 IU·mL－1范围内时，试验系的对数凝血时间与肝素钠的浓度呈良好的线性关系。

试验中观察到，当肝素钠的浓度＜0. 7 IU·mL－1时，凝血时间比较集中，2 个剂量间的间距不易拉开; 当肝素钠浓度＞ 2. 5 IU·mL－1时，凝血时间过长( 超过100 s) ，不利于本法的测定操作。

因此，应用血凝仪－APTT 法测定肝素钠效价时，可以将肝素钠标准品和供试品的稀释液的浓度设定在0. 7 ～2. 5 IU·mL－1范围内。

回收率考察结果表明，当供试品与标准品的效价比值＜80%时，可靠性检验不能通过; 当供试品与标准品的效价比值＞120%时，供试品的回收率超出98% ～102% 的范围，测定结果偏差较大。

因此认为，使用血凝仪－APTT 法测定供试品的效价时，供试品和标准品的稀释液浓度应尽可能接近。

当供试品的测得效价与估计效价的比值在80% ～120% 范围内时，测定结果精密、准确、可靠; 若超出此范围，则可能需重新估计供试品的效价进行试验。

血凝仪－APTT 法测定肝素钠效价的结果与兔全血法和羊血浆法一致，三者的测得效价无显著性差异( P ＞0. 05) ，说明血凝仪－APTT 法的测定结果准确; 血凝仪－APTT 法与兔全血法比较，测得效价的RSD 更小，可信限率更低，提示其精密性可能较兔全血法更好。

乔德水等曾经做过血凝仪－APTT 法的精密性和回收率考察，结论与本文一致。

使用LG －PABER 血小板聚集凝血因子分析仪和ACL ELITE PRO 全自动血液凝固分析仪测定样品效价的结果基本一致，表明血凝仪－APTT 法适用于半自动和全自动血凝仪; 其中使用全自动血凝仪比半自动血凝仪测定结果的可信限率更低，提示仪器或检测方法的精密性可能会在一定程度上影响结果的精密性。

本文中血凝仪－APTT 法可采用新鲜的兔血浆或新融的冷冻兔血浆作为试验系，试验中发现新融的冷冻兔血浆的稳定性优于新的兔血浆。

关于血凝仪－APTT 法试验系的选择，作者已在另一篇文章中进行了说明。

家兔全血法是我国药典现行的肝素生物测定方法，该实验操作复杂，存在大量较为主观的人工操作，如家兔颈动脉放血加样、压板法判断凝固点、人工计时等，容易导致实验中出现加样量的不准确和凝血时间测定的误差。

羊血浆法采用目测方法判定血浆的凝固度，也存在主观因素，难以标准化，且该实验受血浆质量的影响较大，每次实验前均需预试，实验用时长，血浆用量大，实验成本高，不适于在我国广泛应用。

上述 2 种方法都存在客观性和精密性较差的问题，难以准确有效地控制肝素的含量。

APTT 在临床上广泛应用于肝素抗凝后病人血浆肝素浓度的监控，原理符合肝素的抗凝机理。

血凝仪－APTT 法采用全自动或半自动血凝仪测定反应终点，判断准确客观，且试验周期短、试剂用量少操作简便易掌握，具有良好的应用前景。

综合分析认为，血凝仪－APTT 法具备客观、简便、成本低等优点，且能够符合检验方法的客观、准确、重现性好、精密度高的要求，可以用于肝素钠生物效价的测定。