Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol mRNA的分离纯化

Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol
6的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）1.细胞计数（约1×10；
2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次，转至500ul EP管（2000rpm×5min）；
3.去上清，后甩一次，将上清去尽；
6的细胞加50ul loading buffer 加入2×10×loading；4.按每15.Vortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝；
6.每次煮好将其放于冰上，静置约2min，Vortex一下，再甩一下；
7.三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；
8.每次上样约5ul（50ug/ul蛋白）
RIPA裂解抽提总蛋白Protocol
7的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；1.细胞计数（约1×102.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次，转至1.5ml EP管（2000rpm×5min）；
3.去上清，后甩一次，将上清去尽；
4.按照如下比例加入裂解试剂：
7细胞300ul/1×10 ：RIPA
PMSF ：3ul(1:100)
Cocktail ：0.3ul(1:1000)
5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟Vortex一次；
6.4℃预冷离心：10000rpm ×10min；
7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。

【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为200ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不变】
核，浆蛋白抽提Protocol
一.收核-浆蛋白
收浆蛋白
7的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min×10）1.；细胞计数（约1.5用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL2.的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）；
7 cell，重悬，4℃放置10min，3.离心（加入A Buffer 1mL/1×102500rpm去上清，×3min，4℃）；
7 cell4.，重悬，4℃放置3min，离心加入A' Buffer 250uL/1.5×10（5000rpm去上清，×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；
收核蛋白
再用A' Buffer 500uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×5.
，把上清完全吸干净；，吸走上清，12000rpm×30sec1min，4℃）6.℃放置40min （每RAPI)50uL，重悬（振荡），4剩余沉淀中加入B' Buffer (或者振荡一次）；隔10min7.，取上清即为核蛋白，－80℃保存。

℃）离心（12000×10min，4
! O补足至要求体积ddH剩余体积用2
的配制：Buffer A'Buffer A'(2ml) = 1960ul Buffer A + 40uL 10%NP-40 + 20uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin
Buffer A'(1ml) = 980ul Buffer A + 20uL 10%NP-40 + 10uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin （Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的时候可以不加）
2
的配制：'Buffer B)
代替cockltail可以用= 1mL Buffer B + 10uL 10mg/mLPMSF + 0.5uL Aprotinin('Buffer B
核基质蛋白抽提Protocol
7的细胞），离心（1100rpm×5min细胞计数（约1×10）收集细胞；、1
2、用4℃预冷的PBS重悬，将细胞移至1.5ml EP管中，1×PBS洗一遍；
7的细胞，裂解细胞，至冰上15-30min；300ul RIPA/1×10加3、
RIPA＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）
4、4℃预冷离心：13000rpm ×10-15min；
5、将离心后的上清转移至新的已4℃预冷的1.5ml EP管，冰上备用(总蛋白)；
6、用１×PBS洗管底的pellet×2遍；
7、加入Urea-Lysis buffer 10-15ul裂解pellets，vortex 10min；
8、4℃预冷离心：13000rpm ×10min；用BufferA 90ul稀释，此为核基质蛋白。

RIPA（PH 8.0）：
150mM NaCL
1% NP-40
0.5% DOC
0.1% SDS
50mM Tris
Urea-Lysis buffer（PH 8.0）：
100mM NaH2PO4
10mM Tris-HCL
300mM NaCL
8M urea
Buffer A：
100mM NaH2PO4
10mM Tris-HCL
300mM NaCL
1% Triton X-100
cytoplasmic cell fractions were prepared by incubating the cells in icecold
Iso-Hi buffer
140 mM NaCl
25 mM Tris [pH 7.4]
1.5 mM MgCl2)
0.5% Nonidet P-40
for 5 min and then subjecting them to low-speed centrifugation to collect the nuclei. Nuclei were incubated in
high-salt extraction buffer
20 mM HEPES (pH 7.9)
25% (v/v) glycerol
0.5 MNaCl
1.5 mM MgCl2
0.2 mM EDTA
0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
0.5 mM DTT;
for 1 h at 4C. The DNA-particulate fraction was pelleted by microcentrifugation (15,000 rpm), washed once in high-salt buffer, solubilized in radioimmunoprecipitation assay buffer(RIPA), and sonicated to sheer the DNA. Equal amounts of all fractions were precipitated with trichloroacetic sulfate
dodecyl sodium a on separated and buffer, sample protein in resuspended acid,
(SDS)–10% polyacrylamide gel.
Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated (nuclear extraction)
buffer A :
10 mM HEPES (pH 7.9 at 4C)
1.5 mM MgCl2
10 mM KC1
0.5 mM DTT;
buffer B
0.3 M HEPES (pH 7.9)
1.4 M KC1
0.03 M MgCl2;
buffer C
20 mM HEPES (pH 7.9)
25% (v/v) glycerol
0.42 MNaCl
1.5 mM MgCl2
0.2 mM EDTA
0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
0.5 mM DTT;
buffer D
20 mM HEPES (pH 7.9)
20% (v/v) glycerol,
0.1M KCl,
0.2 mM EDTA
0.5 mM PMSF
0.5 mM DTT
DTT and PMSF were added fresh to the buffers just before use.
1，Pelleted cells were then suspended in five volumes of 4C phosphate buffered saline and collected by centrifugation as detailed above; subsequent steps were performed at 4°C.
2，The cells were suspended in five packed cell pellet volumes of buffer A and allowed to stand for 10 min.
3，The cells were collected by centrifugation as before and suspended in two packed cell pellet volumes (volume prior to the initial wash with buffer A) of buffer A and lysed by 10 strokes of a Kontes all glass Dounce homogenizer (B type pestle).
The homogenate was checked microscopically for cell lysis and centrifuged for 10 min at 2000 rpm in a Sorvall HG4L rotor to pellet nuclei. The pellet obtained from the low speed centrifugation of the homogenate was subjected to a second centrifugation for 20 min at 25,000 ga (Sorvall SS34 rotor), to remove residual cytoplasmic material an d this pellet was designated as crude nuclei. These crude nuclei were resuspended in 3 ml of buffer C per 109 cells with a Kontes all glass Dounce homogenizer (10 strokes with a type B pestle). The resulting suspension was stirred gently with a magnetic stirring bar for 30 min and then centrifuged for 30 min at 25,000 g (Sorval SS34 rotor). The resulting clear supernatant was dialyzed against 50 volumes of buffer D for five hours. The dialysate was centrifuged at 25,000 g (Sorvall SS34 rotor) for 20 min and the resulting precipitate discarded. The supernatant, designated the nuclear extract, was
frozen as aliquots in liquid nitrogen and stored at -80°. The protein concentration was usually 6
to 8 mg per ml and 15 to 20 mg of protein were obtained from 109 cells.
mRNA的分离纯化【实验原理】分子是单顺反子，是编码蛋白质的基因转录产物。

真核生物的所有蛋白真核生物的mRNA的分离纯化是克隆基因、提高的翻译产物，因此，高质量mRNA质归根到底都是mRNA1x10-5g RNAcDNA文库构建效率的决定性因素。

哺乳动物平均每个细胞含有约，理论上认为每克细胞可分离出5～10mg RNA。

其中rRNA为75％～85％，tRNA占10％～16％，而mRNA仅占1%～5％，并且mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，表达丰度也不一样。

真核生物mRNA有特征性的结构，即具有5'端帽子结构（m7G）和3'端的poly(A)尾巴——绝大多数哺乳动物细胞的3'端存在20~300个腺苷酸组成的poly（A）尾，通常用poly （A+）表示，这种结构为真核mRNA分子的提取、纯化，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。

一般mRNA分离纯化的原理就是根据mRNA 3' 末端含有多poly(A)尾巴结构特性设计的。

当总RNA流经寡聚（dT）（即oligo(dT)）纤维素柱时，在高盐缓冲液作用下，mRNA 被特异地吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA可被洗下，经过两次oligo(dT)纤维素柱，即可得到较纯的mRNA。

目前常用的mRNA的纯化方法有：
（1）寡聚（dT）－纤维素柱层析法，即分离mRNA的标准方法；
（2）寡聚（dT）－纤维素液相离心法，即用寡聚（dT）－纤维素直接加入到总的RNA溶液中并使mRNA与寡聚（dT）－纤维素结合，离心收集寡聚（dT）－纤维素／mRNA 复合物，再用洗脱液分离mRNA，然后离心除去寡聚（dT）－纤维素；
）－磁性球珠法等。

dT）其它一些方法：如寡聚（3（
本实验应用方法（1）进行mRNA的分离纯化。

【试剂与器材】
（一）试剂
1．0.1mol/L NaOH ，每组200mL
2．寡聚Oligo（dT）-纤维素
3．加样/洗涤缓冲液1：0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL
或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。

4．洗涤缓冲液2：0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6)，每组250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。

配制时可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA（pH 8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SDS 至终浓度。

5．5 mol/L NaCl，每组10mL
6．3 mol/L NaAc pH5.2，每组10mL
7．无RNase双蒸水(DEPC水)，每组100mL
8．70%乙醇，每组10mL
注意：溶液5，6的配制都应该加0.1% DEPC处理过夜，溶液1，3，4，8则用经0.1% DEPC 处理过的无RNase双蒸水配制，Tris应选用无RNase的级别。

溶液配制后，最好能够按一次实验所需的分量分装成多瓶（如10ml或50ml/瓶）保存，每次实验只用一份，避免多次操作造成对溶液的污染。

（二）器材
1．恒温水浴箱
2．冷冻高速离心机
3．紫外分光光度计
4．巴斯德吸管
5．玻璃棉
6．5ml一次性注射器
【操作方法】
（一）oligo(dT)纤维素的预处理
1．用0.1mol/L NaOH悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。

2．将悬浮液装入填有经DEPC水处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床体积为0.5-1.0mL，用3倍柱床体积的无RNase的灭菌双蒸水冲洗oligo(dT)纤维素。

3．用3-5倍柱床洗涤缓冲液I冲洗oligo(dT)纤维素，直到流出液的pH值小于8.0。

4．将处理好的oligo(dT)纤维素从巴斯德吸管倒出，用适当的柱床洗涤缓冲液I悬浮，浓度约为0.1g/mL，保存在4℃待用。

（二）总RNA浓度的调整
1．把实验一所提的总RNA转到适合的离心管中，如果总RNA的浓度大于0.55mg/mL，则用无RNase的双蒸水稀释至0.55mg/mL，总RNA的浓度对除去rRNA是很重要的。

把RNA 溶液置于65℃水浴加热5 分钟，然后迅速插在冰上冷却。

2．加入1/10体积5 mol/L NaCl使RNA溶液中盐的浓度调至0.5 mol/L。

（三）mRNA的分离
1．mRNA与Oligo(dT)-纤维素结合：用移液器重新悬浮oligo(dT)-纤维素，按下表取适量的oligo(dT)-纤维素到RNA样品中，盖上盖子，颠倒数次将oligo(dT)-纤维素与RNA混匀。

于37℃水浴保温并温和摇荡15分钟。

总RNA 寡聚Oligo(dT)-纤维素洗涤缓冲液1，2 洗脱体积(mL) (mL) (mg) (mL)
1.0 <0.2 1.0 0.2
1.5 0.2-0.5 0.5 1.5
3.0 0.5-1.0 1.0 3.0
5.0
1.0-
2.0 5.0
2.0
的一次性注射器，取适量经过高温灭菌的玻璃棉塞紧前端，并把它2．个5ml转移：取1悬浮液转移到注射器，推进塞子纤维素/RNAoligo(dT)-RNase固定在无的支架上，再把的离心管中（保留至确定获得足够RNase直至底部，把含有未结合上的RNA液体排到无的mRNA）。

，温和振荡，充分重新悬浮洗涤：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量的洗涤缓冲液1 3．的离心管收集洗出液。

测定每一管的RNasemRNA-oligo(dT)-纤维素，推进塞子，用无0为时准备洗脱。

OD260，当洗出液中OD或无倍柱床体积）的洗脱缓冲液2-32洗脱：根据上表直接用注射器慢慢吸取适量（．4
柱床双蒸水到注射器内充分重悬RNasemRNA-oligo(dT)-至1/3纤维素，推进塞子以1/2 体
积分管收集洗脱液。

分钟，的洗脱液组分于RNAOD260测定每一管的5．，合并含有2-3，离心2500g4℃，纤维素。

oligo(dT)-上清转移至新的离心管中，去掉残余的．
6．沉淀：洗脱液中加入1/10体积的3mol/L NaAc （pH5.2）, 再加入2.5倍体积的冰冷乙醇，混匀后，-20℃30分钟或放置过夜。

7．离心收集：12000g, 4℃离心15分钟，小心弃去上清，mRNA沉淀此时往往看不见，用70%乙醇漂洗沉淀，12000g, 4℃离心5 分钟，小心弃去上清液，沉淀空气干燥10分钟，或真空干燥10分钟。

将mRNA沉淀溶于适当体积的无RNase的双蒸水，立即用于cDNA合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。

8．定量：测定OD260和OD280，计算产率以及OD260/OD280的比率（同上一实验）。

【注意事项与提示】
1．整个操作过程必须严格遵守无RNase操作环境规则。

2．提取的总RNA必须完整，不能被降解，这是mRNA质量的先决条件。

3．总RNA与Oligo(dT)-纤维素的比例要适当，过量的总RNA，容易造成mRNA不纯。

4．RNA溶液与Oligo(dT)-纤维素结合前必须置于65℃加热5 分钟，这一步很重要，其作用（1）破坏mRNA的二级结构，特别是poly(A+)尾处的二级结构，使poly(A+)尾充分暴露，提高poly(A+)RNA回收率；（2）解离mRNA与rRNA的结合。

加热后应立即插入冰上，以免由于温度的缓慢下降使mRNA又恢复其二级结构。

5．应注意mRNA不能被DNA污染，即使是1 ppm DNA污染，也可严重影响实验结果。

6．mRNA制备后，可用变性琼脂糖凝胶电泳捡测其完整性和有无DNA污染。

提取的mRNA 应该在0.5~8.0kb之间呈现弥散状，无明显区带，但大部分的mRNA应在1-2.0kb范围内（如下图）。

一般来说，经过一次纯化分离的mRNA还会有微量的rRNA残留，但一般来说不会对
后续实验造成很大的影响，如果样品充足，可将经过一次纯化分离的mRNA 再纯化一次，进一步提高其纯度。

．
图3.1 mRNA变性琼脂糖凝胶电泳示意图
Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker;
Lane 2, 老鼠肝脏总RNA;
Lane 3, 老鼠肝脏mRNA
7．为防止mRNA降解，应避免多次冻融，可将mRNA少量分装后保存。

另外，如果有低温冰箱,最好在-70℃～-80℃保存。

也可将mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。

8．寡聚(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。

每次用前需用NaOH、灭菌ddH2O、层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。

9．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。

【实验安排】
1．第一天：试剂的配制和所用一次性塑料制品和玻璃器皿的去RNase处理（0.1TPC浸泡或高温干烤）。

2．第二天：进行（一）、（二）和（三）1-6。

mRNA和变性琼脂糖凝胶电泳捡测7第三天：进行（三）．3．
4．为了避免由于保存时间过长造成的RNA降解，最好能将总RNA提取、mRNA的分离纯化、RT-PCR和cDNA文库构建实验安排在连续的时间内进行。

其他：
引物的设计一般遵循的原则：
1）典型的引物20-24个核苷长。

引物需要足够长，保证序列独特性，并降低序列存在于非目的序列位点的可能性。

但是太长的引物可能会与错误配对序列杂交降低了特异性，同时因为比短序列杂交慢，从而降低了产量。

2）设计5'端和中间区为G或C，且GC含量为50％~60％的引物，以增加引物的稳定性及其与目的序列杂交的稳定性。

3）3'末端尽量不要富含GC。

设计引物时保证在最后5个核苷中含有3个A或T。

但因为3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸，为了避免3'末端的错误配对，所以末端尽量避免为核苷A。

4）在引物对3'末端尽量避免互补序列以免形成引物二聚体，抑制扩增。

如果引物序列可能产生内部二级结构会破坏引物退火稳定性，也要尽量避免。

此外，目的序列上并不存在的附加序列，如限制位点和启动子序列，可以加入到引物5'端而不影响特异性。

有时候，仅有有限的序列信息可供用于引物设计。

比如，如果仅知道氨基酸序列，可以设计简并引物，同时使用较高的引物浓度（1μM到3μM），因为许多简并混合物中的引物不是特异性针对目的模板。

为了增加特异性，可以参考密码子使用表，根据不同生物的碱基使用偏好，减少简并性。

次黄嘌呤可以同所有的碱基配对，降低引物的退火温度。

不要在引物的3'端使用简并碱基，因为3'端最后3个碱基的退火足以在错误位点起始PCR。