发酵工程制药实验链霉菌发酵样本
《生物制药技术》实验指导-实验二
《生物制药技术》实验指导-实验二《生物制药技术》实验指导实验二金霉素链霉菌的定向发酵（验证型）实验目的：1、学习和掌握无菌操作技术。
2、掌握定向发酵四环素的原理。
实验原理：定向发酵是指通过改变培养基组分(加入某些物质)改变微生物代谢途径，使发酵按主观要求产生较多的产物。
金霉素、四环素和土霉素，它们的化学结构极为相似：R1 R2金霉素Cl H土霉素H OH四环素H H金霉菌原是产生金霉素（Chlortetracycline）的菌种，但因金霉素比四环素只多一个氯离子，所以只要在发酵液中加入某些物质，阻止氯离子进入四环素分子，从而使菌种产生较多的四环素。
另外，金色链霉菌在30℃以下时，合成金霉素的能力较强；当温度超过35℃时则只合成四环素。
本实验中，利用溴离子在生物合成过程中对氯离子有竞争性抑制剂作用的原理，以及加入2-硫醇基苯并噻唑(即M—促进剂，分子式：C7H5NS2，通常作为橡胶硫化促进剂)抑制氯化酶的作用，从而增加四环素的产量。
材料、试剂和器材：金霉素链霉菌：购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（菌种保藏号：CGMCC4.1043；订单号20111133 550元）。
超净工作台、摇床（250ml、500ml）酒精灯、酒精棉球、工业酒精、打火机、接种铲、移液枪、剪刀实验步骤：前期准备工作：配制孢子培养基麸皮36.0 g，K2HPO4 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，（NH4）2HPO4 3 g，琼脂15～20 g，定容至1L，pH 7。
1、制备斜面孢子：将保藏的菌种的比例接种于液体培养基中（不加琼脂的斜面培养基），28℃下200 r/min振荡培养，将活化1d后的金霉素链霉菌种接入孢子培养基，28℃培养5～7天，待孢子长成灰色，于4℃冰箱中保藏。
2、种子培养：在斜面上用接种铲挑取1cm2左右生长良好的菌体接入装有50ml四环素种子培养基的250ml锥形瓶中，230 r/min、28℃下振荡培养20～24h。
链霉菌基因实验操作
链霉菌实验操作1录入时间:2009/8/28 16:09:31 来源：食品科技网一、培养基、抗生素、生长因子常用抗生素及其使用浓度抗生素英文名称及缩写抗性基因贮藏液浓度(mg/ml)使用终浓度（μg/ml）链霉菌大肠杆菌MM2CMYEMELA或LB氨苄青霉素氯霉素潮霉素卡那霉素壮观霉素链霉素硫链丝菌素红霉素阿泊拉霉素Ampicillin, AmpChloramphenicol, CmlHygromycin, HygKanamycin, KmSpectinomycin, SpcStreptomycin, StrThiostrepton, ThioErythomycin, EryApramycin, Amblacathygaac或aphaadAstrtsrerm Eaac(3)IV10025(无水乙醇配)5025505025(DMSO配)10050R10102?501051010R－2550502510－50R－－－50－2.5－5050-1002550505025不敏感2030-5*–表示无记录或不能使用，贮存液除特别说明外均用无菌水配制*此表仅供参考！！！*R表示不敏感*Km 和Am有交叉抗性，所以同时具有这两种抗性基因时应适当提高抗生素的量，并作好对照。
*Hyg易见光分解，应用锡箔纸包好。
*有些抗生素需要在低盐的环境（如DNA培养基）下筛选效率较高，如Hyg, Km, VioLB（Luria-Bertani）培养基胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 5g，葡萄糖1g，蒸馏水加至1000ml，pH7.3左右（灭菌后第一次用时还要调一次）LALB中加入终浓度为1.5-2%的琼脂粉(不同的琼脂加的量不同，如青岛琼脂大概需1.5%，而华美的需要2%)。
＊做蓝白斑筛选时不加葡萄糖基本培养基（MM）溶液：L-天冬酰胺0.5g，K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.2g,FeSO4·7H2O 0.01g,蒸馏水至1000ml将每250ml溶液分装到装有2.5g琼脂的500ml三角瓶中，灭菌，使用时每瓶加入50％葡萄糖（8磅灭菌）5ml，调pH7.0。
发酵工程制药ppt课件
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菌种保藏的常用方法
斜面低温保藏法 石蜡油封存法 砂土管保藏法 麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法 液氮超低温保藏法 宿主保藏法
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方法名称 斜面低温保藏法 石蜡油封存法
砂土管保藏法
麸皮保藏法 甘油悬液保藏法 冷冻真空干燥保藏法
自然选育 诱变育种 杂交育种 原生质体融合 基因工程
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从自然界中获得新菌种
土壤、空气、动植物等，严重污染的水域，极端 环境等
基本程序：
采样→预处理→富集培养→筛选→鉴定→野生型
菌株
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诱变育种
物理或化学方法诱发突变。 物理诱变剂：紫外线、X-射线、γ-射线等 化学诱变剂：氮芥、亚硝酸、5-氟尿嘧啶等
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第三节 发酵方式
（一）分批培养 （二）连续培养 （三）其它培养方法
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（一）分批培养
•1、分批培养的定义 •2、分批培养的生长过程 •3、分批培养过程中影响细胞生长的因素
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分批培养的设备要求较少 操作也较简单
工业微生物生产中经常采用
1、分批培养的定 义
• 分批培养是一种间 歇式的培养方法，
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真菌之其它
牛肝菌属：含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺膘呤、 胆碱和腐胺等生物碱。
灵芝属：灵芝多糖、灵芝多肽、三萜类、16种氨基酸(其 中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、 香豆精苷、生物碱、有机酸（主含延胡索酸），以及微量 元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。
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发酵菌种的选育要求
饲料工业（单细胞蛋白） (Antibiotics…)
发酵工程制药实验链霉菌发酵
发酵工程制药实验：链霉菌发酵发酵工程制药实验是制药技术中的重要环节，通过对发酵过程的研究和实验，可以获得制造高质量药品的关键信息。
本文将介绍在实验室中进行链霉菌发酵的方法和步骤，并分析其中的关键因素。
实验目的链霉菌（Streptomyces）是一种广泛存在于自然界中、能够产生许多重要生物活性分子的细菌。
它们具有产生抗生素、抗肿瘤剂、免疫抑制剂等药物的能力，因此被广泛用于制药和医疗领域。
链霉菌的发酵实验可以帮助我们掌握其生长和代谢规律，了解影响链霉菌生长的因素如何调控，探索最优的发酵条件以提高目标产物的产量和纯度等。
因此，本实验的主要目的是：通过链霉菌发酵的实验，掌握发酵工程制药实验的基础理论和操作技巧，探索链霉菌发酵的优化条件。
实验步骤1. 配置培养基链霉菌生长需要适当的培养基，因此我们需要配置基于木质素和琼脂的培养基，其中需添加铁、镁等元素和麦芽糊精等营养成分。
将制备好的固体培养基加入烧过的三角瓶中，用自来水洗净后，用酒精灯加热瓶口和瓶颈，使其不受污染。
2. 实验前消毒和预先培养试管将消毒瓶（80%乙醇）放在洁净桌面上，将三角瓶紫外线灯消毒30分钟，然后将三角瓶横放在洁净桌面上，从洁净试管中取出玻璃珠，放入三角瓶内，用酒精灯烘干瓶口后盖上。
将预备菌株（常见的链霉菌菌株如海洋链霉菌、链霉菌菌株NRRL2234）在木质素琼脂平板上通过接种的方式进行预先培养。
3. 移液接种在曝气装置中注入适量空气使溶液震荡，将链霉菌菌液铸在劳氏肉汤培养基中，在摇床上进行培养。
培养过程中要定时观察并调节培养条件如温度、曝气速率和PH值等。
通过留取一定量的液体给种管，在适当的体积下移液接种，使样品达到合适的菌落密度。
4. 发酵条件的优化掌握适宜的链霉菌发酵条件对于产品的质量和产量至关重要。
在实验的不同时间点，进行样品的收获和检测，并结合实验室提供的分析工具和技能对链霉菌发酵进行分析和诊断，探寻出最适宜的发酵条件，从而可提高产品产量和质量，开发出更多的新药品。
链霉素发酵工艺验证方案
链霉素发酵工艺验证方案1.目的：确认链霉素发酵系统工艺流程，确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺，验证该发酵系统工艺的稳定性和可靠性及制备的发酵液能否达到中间体规格要求。
2.范围：此方案包括一个50吨大罐链霉素发酵液的生产过程。
2.1验证地点：403车间发酵工段：2.2验证对象：2.2.1原斜面2.2.2代1、代2斜面2.2.3母瓶2.2.4子瓶2.2.5小小罐2.2.6小罐2.2.7中罐2.2.8大罐2.3验证步骤：确定验证方案，确定验证计划，内容、步骤，以便准确验证链霉素发酵系统。
3.验证措施概要：3.1生产记录：原斜面：冷藏期≤10天外观无菌外观集落:白色丰满、正常代1或代2斜面：冷藏期≤14天外观无菌外观集落：白色丰满、正常母瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价68小时≥1700u/ml效价96小时≥3500u/ml效价120小时≥6700u/ml冷藏期≤5天菌龄50~64小时菌丝II—III子瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝效价120小时≥7000u/ml效价144小时≥7500u/ml冷藏期≤7天菌龄30~44小时菌丝II—III小小罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥800u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5小罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥1200u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5中罐：菌丝II—III镜检无菌放罐效价≥1800u/ml，残C≤3.5g/100ml，残N≤140mg/100ml，PH≤7.5大罐：放罐残糖≤2.0克/100毫升放罐残氮≤120毫克/100毫升放罐透光度≥40%放罐效价≥14000u/ml3.2原材料：生产过程中所用的各种原材料及其规格（见原材料一览表）3.3设备：生产链霉素所及设备见设备一览表。
发酵法制备链霉素最后定稿
皖西学院生物与制药工程学院（制药设备与工程设计）课程设计班级姓名学号指导教师二○年月日皖西学院生物与制药工程学院制药设备与工程设计课程设计任务书课程设计说明书目录第一章设计资料（宋体，小三号）一、产品设计简介（宋体，四号）第3页二、设计参数和质量标准第4页第二章工艺设计与说明一、工艺流程图第5页二、工艺说明第5页第三章物料衡算与设备选型一、物料衡算第7页二、主要设备选型第9页第四章设计总结第11页附录：1.设备一览表第12页2.参考文献第13页第一章设计资料一．产品设计简介1. 筹建概况发酵厂厂区周围大气中的含尘量应在一定范围以下。
发酵工厂建在一级或二级区域中，周围没有散发大量有害气体的化工厂和产生大量灰尘的炼钢厂、炼焦厂、热电厂等。
并且与铁路及公路主要干线保持适当距离。
发酵工厂是耗能大户，并要求是二类负荷用电户。
该厂选址时注意到厂区用电能得到充分保证，并有充足水源。
六安用水主要来自于淠河，可将厂建于淠河中上游处，便于生产用水的供应。
我国规定在地震6度烈度或以下时在建设时不设防，六安属于此类地区，所以不考虑抗震设防。
2.产品方案与建设规模产品名称：链霉素生产规模：年产50吨产品主要物性：链霉素为白色或类白色粉末，无臭或微臭。
易溶于水，微溶于，不溶于、和。
抗菌范围比较广。
对革兰阴性细菌、结核杆菌和某些革兰阳性细菌都有抑制作用。
主要用于结核杆菌感染，也可用于布氏杆菌病、鼠疫等。
用于的，除外，还有、等。
本品能被植物植株吸收，对革兰氏阴性菌和阳性菌杀伤力强，预防效果明显，低温时持效期一般为7天左右，晴天3～4天。
本品适用于防治蔬菜软腐病，柑桔溃疡病，烟草野火病，黄瓜霜霉病、角斑病，辣椒炭疽病，番茄疮痂病，桃叶细菌性穿孔病，水稻拜叶枯病及其他植物细菌性病害。
使用方法：1、可喷雾（每袋加水50～100kg）、灌根或浸种；2、用于预防，每袋加水50kg（相当于200r），根据病害程度每亩用2～3袋；施药时间最好在上午10点前、下午3点后，喷药8小时内遇雨应补喷。
发酵工程实验
实验五、变温发酵对目的产物产量 的影响
一、实验目的 初步了解不同温度对菌体生长和抗生素发 酵效价的影响，理解变温发酵对提高目的 产物的意义。
二、实验原理 微生物在发酵过程中，首先要进行菌丝体 的生长，对于分批发酵或实验室三角瓶发 酵来说，随着营养物质的消耗、其他有害 因素的积累，其生长由对数期进入稳定期， 菌丝体生长量达到最大，此时微生物便通 过次级代谢途径，迅速将初级代谢产物转 变为次级代谢产物。对于许多微生物产生 的抗生素来说，此时发酵温度适度降低， 将大大提高目的产物的产量。
2．接种与培养：将生长良好的种子液按 15%的接种量进行接种，接完种后置于 28℃、180 rpm的摇床上进行培养，培养 时间为6d。 3．发酵产物初步提取：发酵结束后，将发 酵液进行超声破壁30min，加入乙酸乙酯 30ml，100rpm摇床振荡20min，再用滤纸 滤去菌丝体，滤液用分液漏斗将乙酸乙酯 相分离出来，进行减压浓缩至4~5ml液体。
三、实验材料 菌种：摇瓶培养48 h一株链霉菌的种子液。 培养基成分：大米，大豆粉，米糠。 其他材料、设备仪器：乙酸乙酯等有机试 剂、灭菌锅，超净工作台，酒精灯，三角 瓶，紫外分光光度计，层析缸等。
四、实验步骤 1．培养基的配制与灭菌： 大米50 g，大豆粉30 g，米糠20 g，H2O 100 mL，装入500 mL三角瓶； 采用高压蒸汽灭菌，温度121℃，时间 60min，灭完菌后趁热将培养基振散。 2．接种：将生长良好的种子液接入固体发 酵培养基中，每瓶接种量为25ml。接完种 后置于28℃恒温培养箱内进行静置培养。
4．目的组分提取：将发酵物加入乙酸乙酯 50ml超声破壁30min，再置于100rpm摇床 上振荡30min，用滤纸过滤，滤液用分液漏 斗将乙酸乙酯相取出，进行减压浓缩，浓 缩液加乙酸乙酯进行定容。 5．发酵效价检测：取0.2 ml样品溶液，进 行划线点样，待样品干后进行展层，将目 的组分条带刮下，用一定体积溶剂浸泡， 取上清液进行吸光度检测。 6．根据吸光度，计算两个样品中的目的组 分的发酵效价。
发酵工程应用实例 酶制剂生产
酶发酵生产的一般工艺流程图
[ 麸皮等原料 ] ↓
[ 配制培养基] (灭菌)
[ 发酵池(固体发酵) ]
[ 成品曲 ]
{固体粗酶制剂}
（二）常用的产酶微生物
1、细菌
大肠杆菌
谷氨酸脱羧酶、天冬氨 酸酶、青霉素酰化酶、天冬 酰胺酶、β-半乳糖苷酶、 限制性核酸内切酶、DNA聚 合酶、DNA连接酶、核酸外 切酶等。
（2）过滤与膜分离
过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。 过滤介质多种多样，常用的有滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金 属和各种高分子膜等，可以根据需要选用。
过
非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质
滤
膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质
过滤的分类及其特性 ( ) 根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同
（2）酶作用底物的类似物；
（3）酶的反应产物；
（4）底物和底物类似物的前体物。 3、诱导物的浓度：必须控制在适当浓度。
（二）控制阻遏物的浓度
1、解除终产物阻遏的方法 降低培养基中酶作用产物的浓度； 添加终产物的类似物。
2、解除分解代谢产物阻遏的方法 控制培养基中葡萄糖等容易利用的碳源浓度，可采用其他较
1）机械破碎 2）物理破碎 3）化学破碎 4）酶解破碎
DY89-I型 电动玻璃匀浆机
高 压 细 胞 破 碎 机
细 胞 破 碎 珠
2、酶的提取
• 酶的提取是指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分 溶解到溶剂或溶液中的过程。也称为酶的抽提。
• 酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性 物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易 溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。
发酵工程实验 讲义 2015
2. 再在各孔中加入25 µl 高碘酸钠溶液，迅速震荡混匀。
3. 混匀后，室温静置10 min，期间震荡混匀1-2次。 4. 10 min后，各孔加入L-鼠李糖50 μl，迅速震荡混匀。
5.混匀后各孔加入Nash试剂100 μl，放入自封袋中，53℃水浴15 min。
6. 15 min后，以未加稀释的甘油标准液的孔作为空白对照，在酶标仪上测各孔A412的平 均值。 7. 以各孔的A412平均值为纵坐标，对应的甘油浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。
粗滤
超滤 酒精沉淀
SDS-PAGE电泳
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1. 培养基 孢子培养基、种子培养基、发酵培养基 2.种子的制备 孢子的制备，种子的制备，菌龄，接种量
3 2
4
1
茂原链霉菌生长曲线
1.调整期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期
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3. 液体深层培养的几个关键点 a. 灭菌 b. 温度控制 c. 通气和搅拌
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4. 四联罐介绍
3L 的发酵罐，由罐体、空压机、主机、水源组成。
本实验用的发酵罐
谷氨酰胺转胺酶(MTGase)的发酵
轮枝链霉菌接种量：5～10％（v：v） 培养条件：温度，30℃；搅拌转速为200rpm；通 气量，3vvm（通气量与发酵液体积比-VVM）；培 养时间：40h左右 。 监测发酵罐的T、通气量、搅拌转速等状态，按照 一定时间取样。 测定发酵液的pH、酶活、甘油含量和生物量。
链霉素发酵实验分析及总结
链霉素发酵实验分析及总结一、实验目的通过链霉素发酵获得链霉素，并测定相关参数；了解发酵的各个环节，综合运用本科阶段所学习的技能及知识。
二、实验材料及步骤略三、实验结果1、标准曲线的绘制管号1.002mg/ml葡萄糖浓度（ml）蒸馏水（ml）DNS（ml）葡萄糖浓度（mg/ml）OD值0 0.0 1.0 1.0 0.000 0.0001 0.1 0.9 1.0 0.100 0.0912 0.2 0.8 1.0 0.200 0.2103 0.3 0.7 1.0 0.301 0.3444 0.4 0.6 1.0 0.401 0.4395 0.5 0.5 1.0 0.501 0.5866 0.6 0.4 1.0 0.601 0.687所得的葡萄糖标准曲线回归方程为y=1.1985-0.0275，R2=0.9979.2、链霉素发酵密度、pH、氨态氮变化从表中我们可以知道：pH变化先降后生，变化曲线较为正常；密度的变化处于平稳状态；而氨态氮含量缓慢上升。
3、链霉素发酵还原糖、总糖、菌体湿重变化从图中可知：还原糖、总糖含量一直在减小，菌体湿重总体上升。
四、实验分析及感想本次发酵实验做的较为失败，没有发酵出链霉素，效价无法检测。
可能原因有以下几点：第一，实验过程中发生过空压机的“罢工”，具体多少时间也不知道导致罐内缺氧；第二，链霉菌虽然生长，但可能是因为缺乏表达活性，无法表达链霉素；第三，通过镜鉴前期菌体量在逐步增加，后4-8天菌体量基本不变，到最后菌体量有所衰减，这样的现象可能是环境导致。
实验虽然没有成功，但实验过程中我收获良多：我学会了用dns法，见习了发酵罐的用法和接种的火焰圈法。
还有发酵罐的使用注意事项，对分光光度计有了更深的认识和了解，我相信这对我以后会有很大的帮助。
还有和同学共同完成实验的经验。
发酵工程制药实验-链霉菌发酵
实验2灰色链霉菌的活化一、实验目的学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。
二、实验原理高氏一号斜面培养基是一种合成培养基，用于培养放线菌。
三、实验试剂与仪器1. 菌种：灰色链霉菌；2. 培养基：可溶性淀粉20g，硝酸钾1 g，氯化钠0.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸亚铁0.01 g，琼脂20 g，水1000毫升，PH7.2—7.4（配制时注意，可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中）；3. 器材：天平、500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、18mL×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤1. 高氏一号培养基的制备（1）按配方称量药品，加热搅拌至琼脂完全熔化，补水至1000mL。
趁热分装于18mL×180mL试管，斜面以8mL为宜。
（3）分装完毕后，塞好棉塞并将试管捆扎好。
高压蒸汽灭菌：121℃灭菌20min，灭菌后趁热摆斜面。
2. 斜面接种接种是将纯种微生物，在无菌操作条件下，移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。
为了获得微生物的纯种培养，要求接种过程中必须严格进行无菌操作。
一般是在无菌室内，超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。
（1）左手拿试管菌种，右手拿接种环，先将金属环烧灼灭菌，再将接种环在空白培养基处冷却，挑取菌落，在火焰旁稍等片刻。
（2）左手将试管菌种放下，拿起斜面培养基。
在火焰旁用右手小指和手掌边缘拔下棉塞并夹紧，迅速将接种环伸入空白斜面，在斜面培养基上轻轻划线，将菌体接种于其上。
划线时由底部向上划一直线，一直划到斜面的顶部。
注意勿将培养基划破，不要使菌体沾污管壁。
（3）灼烧试管口，在火焰旁将棉塞塞上。
接种完毕，接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
（4）斜面置于28℃恒温箱中，培养5～6d观察结果。
实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备一、实验目的学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。
大实验五 发酵罐认知及链霉素发酵.
实验步骤 (continued)
2、发酵过程
1) 灭菌
① 插入所需电极，调整消泡电极高度，关闭罐盖上所用接口(确认无 任何软管连接)。
② 启动搅拌，设定转速在300-500 r/min。
③ 设定温度setp1的值为“0”，使夹套进水。保持约2分钟后，再改 回培养温度。
④ 打开排气，装上不锈钢夹套。
第一部分发酵罐认知第部分发酵罐认知第二部分发酵罐操作演示第三部分利用发酵罐发酵生产链霉素第四部分发酵液抗菌活性测定实验步骤continued瑞士比欧公司生产l1523型机械搅拌通风发酵罐第一部分发酵罐认知1罐体2搅拌装置3加热及冷却装置4通气及排气5测量装置温度排气5测量装置温度搅拌转速phpo2泡沫6接种7取样及排料8空气产生净化计量9控制装置搅拌转速ho2泡实验步骤continued实验步骤continued第二部分发酵罐操作演示不投料不接种l1523发酵罐操作流程1发酵前准备工作1把进气过滤器补料瓶及可能用到的各种插针在高压锅内灭菌
向斜面菌种中加入约5ml无菌水，用移液器吹打制备孢 子悬液。 将孢子悬液接入高氏一号液体培养基（100ml/500ml三 角瓶）。 28℃，200rpm振荡培养48h。
实验步骤 (continued)
4、在L1523型发酵罐中发酵 （演示）
1) 发酵培养基：
黄豆饼粉浸液（1%浓度）1000ml，葡萄糖10g，NaCl 2.5g，蛋白胨 20g，CaCO3 2g；pH 7.2
Selman Abraham Waksman
USA
Rutgers University New Brunswick, NJ, USA
b. 1888 (in Priluka, Ukraine, Russia
实验原理 (continued)
液体发酵法生产链霉素
实验名称：液体发酵法生产链霉素姓名：学号：系别：实验日期：同组同学名单：摘要】本实验包含了链霉素液体的发酵以及链霉素的检测、鉴定两个部分。
通过实验结果表明，链霉素发酵液的抑菌效果大于链霉素样品。
【实验目的】1.学习链霉素液体发酵方法2.学习链霉素的检测和鉴定方法【实验材料】菌种：E. coli，放线菌5406培养基：豌豆培养基、高氏1号培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基其他材料：水饱和正丁醇、层析缸、滤纸、毛细管、培养皿【实验方法及步骤】1、斜面孢子的制备用接种环挑取冰箱中保藏的菌种接种于豌豆培养基斜面培养基上，于27℃恒温培养基中培养6—7d,即可得到斜面孢子。
2、母瓶培养液的制备用接种环挑取斜面培养表面上的孢子接种于灭菌的含有50ml豌豆培养基的三角瓶中，于27℃摇瓶200r/min培养72h即成母瓶培养液。
3、种子培养基的制备无菌操作取2ml母瓶培养液接种于含有100ml豌豆培养基（或者高氏1号培养基）的三角瓶中，于27℃恒温摇床200r/min培养3—4d。
4、发酵培养取4ml种子培养液接种于含有200ml豌豆培养基（高氏1号培养基）的500ml 大三角瓶中，于28℃恒温摇床200r/min培养12—15d进行链霉素发酵。
5、发酵液预处理发酵结束后，将发酵液在低温条件下 12000r/min离心，上清即为含链霉素的样品。
6、发酵液抑菌实验0.2ml大肠杆菌菌液，待其表面干燥后，均匀贴上三个小滤纸片，分别在滤纸片上加等量（5μl）的发酵液、链霉素样品、水，于37℃恒温培养24h后观察结果。
7、链霉素的纸层析鉴定1)点样：在距滤纸底端1cm处一道横线，用毛细管将发酵液和标准链霉素溶液（10mg/ml）点在滤纸的横线上，每个样品之间距离1cm。
2)层析：将点好样的滤纸竖立在含有展层剂系统（水饱和的正丁醇）的层析缸中，室温下扩展10cm后取出，挥发除净溶剂。
3)显影（生物显影法）：首先将滤纸片在紫外下灭菌20min，铺一薄层牛肉膏蛋白胨固体平板，待凝固后，将灭菌的滤纸正面朝上铺在平板上，再倒一层牛肉膏蛋白胨固体，凝固后均匀涂布0.2ml大肠杆菌菌液，37℃培养20h,根据平板上样品抑菌区的位置判断抗生素的类型。
链霉菌发酵各阶段菌丝形态
40h
5
64h
71h
80h
88h
6
空泡形成，并逐渐增加，产素活跃，黏度开始下降，糖耗旺盛，耗氧也逐渐减弱
112h
119h
136h
152h
7
出现返青现象，菌丝出现断裂，抗生素合成减缓，黏度继续下降，耗氧继续减弱
化稀 泡沫
8
链霉菌发酵各阶段菌丝形态
• 链霉菌斜面
链霉菌斜 面，孢子
车间链霉菌发酵菌丝过程分析
接种后 （0h)
2
5h 积蓄能量 始出现小分枝 新老交替 染色深浅差别
3
8h 分枝增长 新菌丝明显增加 染色加深 菌丝粗壮 生长繁殖活跃 耗氧开始变强
4
16h
24h
32h
分枝逐渐伸长，菌丝由蜷缩逐渐伸展，表观黏度快速增加，抗生素开始合成
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实验2灰色链霉菌的活化
一、实验目的
学习制备高氏一号斜面培养基的方法以及斜面接种技术。
二、实验原理
高氏一号斜面培养基是一种合成培养基, 用于培养放线菌。
三、实验试剂与仪器
1. 菌种: 灰色链霉菌;
2. 培养基: 可溶性淀粉20g, 硝酸钾1 g, 氯化钠0.5 g, 磷酸氢二钾0.5 g, 硫酸镁0.5 g, 硫酸亚铁0.01 g, 琼脂20 g, 水1000毫升, PH7.2—7.4( 配制时注意, 可溶性淀粉要先用冷水调匀后再加入到以上培养基中) ;
3. 器材: 天平、 500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、 18mL ×180mL试管、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤
1. 高氏一号培养基的制备
( 1) 按配方称量药品, 加热搅拌至琼脂完全熔化, 补水至1000mL。
趁热分装于18mL×180mL试管, 斜面以8mL为宜。
( 3) 分装完毕后, 塞好棉塞并将试管捆扎好。
高压蒸汽灭菌: 121℃灭菌
20min, 灭菌后趁热摆斜面。
2. 斜面接种
接种是将纯种微生物, 在无菌操作条件下, 移植到已灭菌并适宜该菌生长
繁殖所需要的培养基中。
为了获得微生物的纯种培养, 要求接种过程中必须严格进行无菌操作。
一般是在无菌室内, 超净工作台或实验台酒精灯火焰旁进行。
( 1) 左手拿试管菌种, 右手拿接种环, 先将金属环烧灼灭菌, 再将接种环在空白培养基处冷却, 挑取菌落, 在火焰旁稍等片刻。
( 2) 左手将试管菌种放下, 拿起斜面培养基。
在火焰旁用右手小指和手掌
边缘拔下棉塞并夹紧, 迅速将接种环伸入空白斜面, 在斜面培养基上轻轻划线, 将菌体接种于其上。
划线时由底部向上划一直线, 一直划到斜面的顶部。
注意勿将培养基划破, 不要使菌体沾污管壁。
( 3) 灼烧试管口, 在火焰旁将棉塞塞上。
接种完毕, 接种环上的余菌必须灼烧灭菌后才能放下。
( 4) 斜面置于28℃恒温箱中, 培养5～6d观察结果。
实验3 灰色链霉菌的摇瓶种子制备
一、实验目的
学习制备摇瓶种子培养基的方法以及种子扩大培养技术。
二、实验原理
种子扩大培养简称种子扩培, 是发酵工程的一个组成部分, 其指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后, 再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯种过程。
其目的首先是出于接种量的需要与菌种的驯化, 同时对于缩短发酵时间、保证生产水平也有帮助。
种子扩培的一般过程是:
斜面菌种→ 一级种子培养( 摇瓶) → 二级种子培养(种子罐) → 发酵对于种子制备过程, 其大致可区分为实验室阶段和生产车间阶段, 前期不用种子罐, 所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备, 在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成, 因此将这一培养过程称为实验室阶段的种子培养。
而后期种子培养在种子罐里面进行, 一般在工程上归为发酵车间管理, 因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
并非所有的种子扩大培养都采用从摇瓶到种子罐的二级发酵模式, 其实际发酵级数受到发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
摇瓶培养技术问世于本世纪30年代, 由于其简便、实用, 广泛用于微生物菌种筛选、实验室大规模发酵试验、种子培养等。
摇瓶培养设备主要有旋转式
摇床和往复式摇床两种类型, 其中以旋转式最为常见。
振荡培养中所使用的发酵容器一般为三角烧瓶, 也有使用特殊类型的烧瓶或试管。
振荡培养技术一般见于微生物菌种的筛选或生产工艺的改良和工艺参数的优化。
在摇瓶培养过程中振荡的目的在于改进活细胞的氧气和营养物的供给。
摇瓶培养一般以特定生长条件下的培养物接种, 也可用孢子接种。
振荡培养是建立深层发酵的开始, 就一特定微生物而言, 振荡培养时存在一最佳培养基配方和最佳培养基容量。
细胞或孢子接种浓度对试验的成功极为重要, 不同的微生物细胞或孢子以及不同的振荡培养过程的接种浓度差异可能是十分显著的, 且各自存在一最适浓度。
三、实验试剂与仪器
1. 菌种: 灰色链霉菌( 由实验二活化得到) ;
2. 培养基: 豆饼粉20g、淀粉40g、酵母膏5g、蛋白胨5g, 硫酸铵3g, 硫酸镁0.25g, 磷酸二氢钾0.2g, 碳酸钙4g, 自来水1000mL、 pH7.2-7.4。
3. 器材: 天平、 500mL刻度量杯、小刀、牛角匙、玻棒、纱布、 250mL 三角瓶、棉花、电炉、烧杯、记号笔、酒精灯、接种环等。
四、实验步骤
1. 摇瓶种子培养基的制备
取干净三角烧瓶, 250ml三角瓶分装培养基30-50ml, 用棉塞包扎瓶口, 再加牛皮纸包扎, 在0.1MPa下灭菌45-60min。
2. 接种
将活化的菌种斜面, 在无菌的条件下, 注入10mL无菌水, 震荡成孢子悬浮液( 孢子浓度约为8×104个/mL) 。
待发酵培养基灭菌后冷却到28℃时, 分别将孢子悬浮液接入三角瓶中, 接种量为2mL, 标好记号。
3. 培养与观察
28℃、 200r/min旋转式摇床培养24h, 观察菌丝体形态及浓度。
实验4 灰色链霉菌摇瓶发酵
一、实验目的
学习和掌握摇瓶发酵培养的原理和方法。
二、实验原理
链霉素是一种从灰链霉菌的培养液中提取的抗菌素, 属于氨基糖甙碱性化合物, 它与结核杆菌菌体核糖核酸蛋白体蛋白质结合, 起到了干扰结核杆菌蛋白质合成的作用, 从而杀灭或者抑制结核杆菌生长的作用。
链霉素是含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族中的主要成员, 由链霉胍、链
霉糖和N－甲基-L-葡萄糖胺构成的糖苷, 其结构式如下。
链霉素中链霉糖部分的醛基被还原成伯醇基后, 就成为双氢链霉素, 它的抗菌效能和链霉素大致相同, 当前临床上使用的是链霉素或双氢链霉素的硫酸盐。
生产过程分为两大步骤: ①发酵, 将冷干管或沙土管保存的链霉菌孢子接
种到斜面培养基上, 于27℃下培养7天。
待斜面长满孢子后, 制成悬浮液接入
装有培养基的摇瓶中, 于27℃下培养45～48小时待菌丝生长旺盛后, 取若干个摇瓶, 合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中, 通入无菌空
气搅拌, 在罐温27℃下培养62～63小时, 然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中, 通入无菌空气, 搅拌培养, 在罐温为27℃下, 发酵约7～8天。
②提取精制, 发酵液经酸化、过滤, 除去菌丝及固体物, 然后中和, 经过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换, 再用稀硫酸洗脱, 收集高浓度洗脱液──链霉素硫酸盐溶液。
洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐, 此时溶液呈酸性, 用阴离子树脂中和后, 再经活性炭脱色得到精制液。
精制液经薄膜浓缩成浓缩液, 再经喷雾干燥得到无菌粉状产品, 或者将浓缩液直接做成水针剂。
1. 菌种: 灰色链霉菌摇瓶种子( 由实验三获得)
2. 摇瓶发酵生产培养基: 水解糖160g、尿素5g( 单独灭菌) 、 MgSO
4
0.5g、
Na
2HPO
4
1.6g、玉米浆25~35g、 FeSO
4
和MnSO
4
各20mg/L, 消泡剂0.3g, , 水
1000mL, pH7.2。
3. 仪器: 500m1三角烧瓶、旋转式摇床等。
四、实验步骤
三、实验试剂与仪器。