Removed_rMBP-NAP在黑色素瘤B16-F10肺转移模型上的抗肿瘤作用及其免疫调节机制

A thesis submitted toZhengzhou Universityfor the degree of MasterStudy on antitumor effect and immunoregulatory mechanism of rMBP-NAP on B16-F10 pulmonary metastatic modelAuthor: Mingxuan DuSupervisor: Prof. Qiaozhen KangDr. Ting WangBiochemistry and Molecular BiologySchool of life sciencesApril 2015原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。

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学位论文作者：日期：年月摘要摘要目的近些年来黑色素瘤发生率不断升高，传统的治疗方法不能取得理想的治疗效果，采用免疫治疗联合传统治疗手段如化疗，激活机体免疫应答是有效治疗黑色素瘤的方法。

肿瘤局部微环境为肿瘤的生长和转移提供了庇护场所，通过诱导血管生成，形成免疫耐受等有利于肿瘤的恶化和转移。

靶向肿瘤微环境是有效治疗肿瘤的方法，通过作用与肿瘤微环境中的免疫抑制有利于机体免疫系统发挥抗肿瘤作用，通过调节肿瘤相关血管生成有利于控制肿瘤恶化和转移等。

为了进一步探讨免疫调节剂rMBP-NAP的抗肿瘤作用，研究rMBP-NAP对肿瘤微环境产生影响，我们利用高转移的B16-F10黑色色素瘤建立小鼠肺转移模型，研究rMBP-NAP对肿瘤微环境产生的影响以及其生物学意义。

方法1.选择鼠源的高转移性黑色素瘤细胞B16-F10细胞株，通过尾部皮下静脉注射肿瘤细胞的方法，建立小鼠黑色素瘤肺转移模型。

2.选择不同给药剂量：低剂量组10 μg/只、中剂量组50 μg/只、高剂量组100 μg/只，每48小时给药一次，连续给药7次。

根据不同给药剂量对肿瘤肺转移的影响，筛选最适给药剂量，研究讨论rMBP-NAP对小鼠黑色素瘤肺转移的抑制作用。

3.采用ELISPOT方法检测肿瘤模型中，rMBP-NAP给药后分泌IFN-γ的脾脏细胞数量的变化；通过实时荧光定量PCR方法检测脾脏中Th1、Th2型细胞因子表达情况；采用细胞杀伤实验研究rMBP-NAP给药后效应细胞对肿瘤细胞的杀伤情况。

4.通过实时荧光定量PCR检测肺组织中Th1型细胞因子的变化情况以及肿瘤微环境中维持肿瘤内部稳态相关的炎性细胞因子、趋化因子的表达情况；通过流式细胞术检测浸润到肿瘤微环境中CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞数量的变化；对肿瘤组织中CD34+血管内皮细胞免疫组化染色，检测肿瘤组织中血管生成并检测血管内皮生长因子（VEGF）的表达变化。

I摘要5.通过体外培养黑色素瘤细胞B16-F10，检测rMBP-NAP与肿瘤细胞共同孵育后对肿瘤细胞粘附和迁移的影响。

结果1. C57BL/6小鼠尾部皮下静脉注射黑色素瘤细胞B16-F10形成肿瘤肺转移成功率100%，成功建立黑色素瘤肺转移模型。

2. rMBP-NAP抑制了黑色素瘤细胞B16-F10肺转移灶形成数量，选择50 μg/只作为rMBP-NAP抗肿瘤药效剂量。

3. ELISPOT检测结果显示，rMBP-NAP作用后分泌IFN-γ脾细胞数量显著增多；脾脏中Th1型细胞因子IL-12、IFN-γ、IL-27表达显著上升，Th2型细胞因子IL-4表达显著下降；外周血单个核细胞和脾脏细胞对黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用增强。

4. rMBP-NAP作用后肺组织Th1型细胞因子表达显著上升；炎性因子如IL-6、TNF-α和趋化因子如CCL2、CCL20表达水平显著下降；浸润到肿瘤微环境中的CD3+CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞数量显著升高；肺组织中VEGF 表达量显著下降,肿瘤血管生成受到抑制。

5.体外rMBP-NAP与黑色素瘤细胞B16-F10共同孵育，对肿瘤细胞的粘附和迁移没有明显影响。

结论1. rMBP-NAP显著减少黑色素瘤细胞B16-F10的肺转移灶数量。

2. rMBP-NAP引起Th1反应，激活系统性的抗肿瘤免疫应答。

3. rMBP-NAP显著增强肿瘤微环境中Th1细胞因子表达，逆转肿瘤微环境的炎症微环境和免疫抑制微环境并能通过下调VEGF抑制肿瘤血管生成。

4. rMBP-NAP在体外对黑色素瘤细胞B16-F10的粘附和迁移作用没有直接的影响。

关键词：rMBP-NAP ;Th1 肿瘤微环境 ; 肿瘤转移 ; 免疫调节剂IIAbstractAbstractObjectiveMelanoma incidence has been rising for many years. The stimulation of immune response against tumors via combined immunotherapy with conventional chemotherapy or targeted therapy is a promising approach for melanoma. tumor microenvironment provide a field to keep tumor grow and metastasis. The microenvironment was characteristiced as angiogensis and immune suppression situation.The forming vessel could afford oxygen and nutrient to keep tumor cells proliferation;the immune supression situation protect the tumor tissue from immune surveillance.We can inhibit tumor progression via target the tumor microenvironment. In this work, we aimed to figure out the anti-tumor effects and immunoregulatory mechanism of rMBP-NAP,and explore the effect of rMBP-NAP on modulating the microenvironment.Methods1.The B16-F10 metastatic melanoma cells were injected into the tail vein of C57BL/6 mice and established the pulmonary metastatic model.2.The pulmonary metastatic models were randomly divided into several different groups: rMBP-NAP low dose group (10μg/mice/48h); middle dose group (50μg/mice/48h) and high dose group (100μg/mice/48h). The optimal dose was selected according to the inhibit ration and the influence on normal mouse events.3.The number of IFN-γ-secreting spleen cells was calculated with ELISPOT assay, the expression of Th1、Th2 cytokines and the cytotoxicity of effector cells ,such as PBMC、spleen cell were analysised after rMBP-NAP treatment.4.The expression of cytokines such as:Th1、inflammatory cytokines、chemokines and adhesion molecule and the infiltration of CD3+CD4+T cells；CD3+CD8+T cells were calculated after mouse sacrificed.. Immunohistochemical staining for CD34 antibody against endothelial cells and the expression of VEGF in tumor microenvironment were analysised.IIIAbstract5.Study of the effect of rMBP-NAP on melanoma cell B16-F10 adhesion and migration.Results:1.The pulmonary metastatic model was successfully established .2.rMBP-NAP significantly inhibited the formation of lung metastatic nodules.3.The result of ELISPOT assay indicated that IFN-γ-secreting spleen cells were significantly increased. Moreover, the expression of Th1 cytokines and Th2 cytokines and the cytotoxicity of PBMC and spleen cells against B16-F10 were significantly changed after rMBP-NAP treatment.4.The infiltration of CD3+CD4+T cells；CD3+CD8+T cells was significantly increased, the expression of adhesion molecules(VCAM-1、ICAM-1) which play an important role in infiltration of effector cell were significantly increased；the tumor-promoting factor, such as inflammary cytokine(IL-6、TNF-α), chemokines (CCL2、CCL20) were significantly decreased within tumor microenvironment after rMBP-NAP treatment. Moreover, the rMBP-NAP treatment significantly limited angiogenesis and limited expression of VEGF.5.There is no effect of rMBP-NAP on the cell adhesion and cell migration after rMBP-NAP coincubated with melanoma B16-F10, in vitro.Conclusions1.rMBP-NAP significantly inhibited the formation of lung metastatic nodules.2.rMBP-NAP is capable of enhancing Th1 immune response and inducing systemic anti-tumor immune response.3.rMBP-NAP could modulated tumor microenvironment and regulated the existed inflammatory microenvironment and tumor immune-suppressed microenvironment, furthermore, the cancer associated angiogenesis progression was delayed by rMBP-NAP.4.The anti-tumor effect of rMBP-NAP was not the result from inhibiting tumor cells adhesion or migration.Key words: rMBP-NAP; Th1; tumor microenvironment; tumor metastasis; immunomodulatorIV目录目录摘要 (I)ABSTRACT (III)常见英文缩写一览表（按字母顺序） (X)1 引言 (1)1.1选题背景 (1)1.2系统性的免疫应答对肿瘤的影响 (2)1.3肿瘤微环境对肿瘤生长和转移的影响 (3)1.4肿瘤血管生成 (4)1.5研究目的和意义 (5)1.6研究内容与方法 (6)1.7课题技术路线 (7)2 r MBP-NAP抗黑色素瘤细胞B16-F10肺转移作用的研究 (8)2.1仪器与材料 (8)2.1.1 主要仪器设备 (8)2.1.2 主要药品与试剂 (9)2.1.3 主要工作液 (9)2.1.4 细胞株 (10)2.1.5 实验动物 (10)2.2实验方法 (11)2.2.1 重组融合蛋白rMBP-NAP蛋白的制备 (11)2.2.2 黑色素瘤细胞B16-F10的培养 (13)2.2.3 C57BL/6小鼠黑色素瘤B16-F10肺转移模型建立 (14)V目录2.2.4 rMBP-NAP在黑色素瘤肺转移模型上的抗肿瘤作用研究 (14)2.2.5 rMBP-NAP对黑色素瘤B16-F10肺转移模型小鼠生存期的影响 (16)2.2.6 统计学分析 (16)2.3实验结果 (16)2.3.1 重组融合蛋白表达纯化 (16)2.3.2 C57BL/6小鼠黑色素瘤B16-F10肺转移模型建立 (17)2.3.3 rMBP-NAP在黑色素瘤B16-F10肺转移模型上的抗肿瘤作用研究 (18)2.3.4 rMBP-NAP对黑色素瘤B16-F10肺转移模型小鼠生存期的影响 (21)2.4结果讨论 (21)3 rMBP-NAP给药诱导系统性抗肿瘤免疫应答 (23)3.1仪器与材料 (23)3.1.1 主要仪器设备 (23)3.1.2 主要药品与试剂 (24)3.1.3 主要工作液 (24)3.1.4 细胞株 (25)3.1.5 实验动物 (25)3.2实验方法 (25)3.2.1 rMBP-NAP给药后ELISPOT法检测小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ能力 (25)3.2.2 rMBP-NAP给药后对荷瘤小鼠脾脏组织中细胞因子的影响 (27)3.2.3 rMBP-NAP给药后LDH方法检测效应细胞对黑色素瘤细胞B16-F10的杀伤作用的影响 (29)3.2.4 统计学分析 (32)3.3实验结果 (32)3.3.1 rMBP-NAP给药后ELISPOT法检测小鼠脾脏细胞分泌IFN-γ能力 (32)3.3.2 rMBP-NAP给药后信使RNA水平检测肺转移小鼠脾脏细胞中细胞因子表VI目录达变化 (33)3.3.3 rMBP-NAP给药后对效应细胞细胞毒作用的影响 (34)3.4结果讨论 (35)4 rMBP-NAP药物干预对肿瘤微环境的影响及其生物学作用 (37)4.1仪器与材料 (38)4.1.1 主要仪器设备 (38)4.1.2 主要药物与试剂 (38)4.1.3 主要工作液 (39)4.1.4 细胞株 (40)4.1.5 实验动物 (40)4.2实验方法 (40)4.2.1 rMBP-NAP给药后荷瘤小鼠肺组织微环境中Th1型细胞因子表达变化404.2.2 rMBP-NAP给药后荷瘤小鼠肺组织微环境中炎性细胞因子、趋化因子和粘附因子表达变化 (40)4.2.3 rMBP-NAP给药后荷瘤小鼠肺组织微环境中效应细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润变化 (41)4.2.4 rMBP-NAP给药后免疫组织化学CD34染色检测肺组织中肿瘤血管生成情况 (42)4.2.5 rMBP-NAP给药后信使RNA水平检测荷瘤小鼠肺组织中血管内皮生长因子表达变化 (43)4.2.6 统计学分析 (43)4.3实验结果 (43)4.3.1 rMBP-NAP给药后荷瘤小鼠肺组织微环境中Th1型细胞因子表 (43)达变化 (43)4.3.2 rMBP-NAP给药后荷瘤小鼠肺组织微环境中炎性细胞因子、趋化因子和粘附因子表达变化 (44)VII目录4.3.3 rMBP-NAP给药后荷瘤小鼠肺组织微环境中效应细胞CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润变化 (45)4.3.4 CD34免疫组织化学染色法检测rMBP-NAP给药后肺组织中肿瘤血管生成情况 (47)4.3.5 信使RNA水平检测rMBP-NAP给药后荷瘤小鼠肺组织中血管内皮生长因子表达变化 (48)4.4结果讨论 (49)5 rMBP-NAP在体外对黑色素瘤细胞B16-F10粘附、迁移的影响.. 515.1仪器与材料 (52)5.1.1 主要仪器设备 (52)5.1.2 主要药品与试剂 (52)5.1.3 常用试剂配制 (52)5.2实验方法 (53)5.2.1 CCK-8法检测rMBP-NAP对黑色素瘤细胞B16-F10增殖的影响 (53)5.2.2 CCK-8法检测rMBP-NAP对黑色素瘤细胞B16-F10粘附的影响 (53)5.2.3 划痕实验检测rMBP-NAP对黑色素瘤细胞B16-F10迁移的影响 (53)5.2.4 统计学分析 (54)5.3实验结果 (54)5.3.1 CCK-8法检测rMBP-NAP对黑色素瘤细胞B16-F10增殖的影响 (54)5.3.2 CCK-8法检测rMBP-NAP对黑色素瘤细胞B16-F10粘附的影响 (55)5.3.3 划痕实验检测rMBP-NAP对黑色素瘤细胞B16-F10迁移的影响 (56)5.4结果讨论 (57)6 结论与讨论 (59)参考文献 (62)个人简历、在学期间发表的学术论文和研究成果 (68)VIII目录致谢 (69)IX常见英文缩写一览表常见英文缩写一览表（按字母顺序）英文缩写英文全称中文名称bp Base pair 碱基对CAF Carcinoma-associated-fibroblasts 肿瘤相关纤维母细胞CD3 Cluster of differentiation 3 表面抗原分化簇3CD4 Cluster of differentiation 4 表面抗原分化簇4CD8 Cluster of differentiation 8 表面抗原分化簇8DNA Deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸ELISPOT Enzyme-linked immunospot assay 酶联免疫斑点测定法HP-NAP Helicobacter pylori neutropHil-activating protein 幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白IFN-γInterferon-γγ-干扰素IL-2 Interleukin-2 白介素2IL-6 Interleukin-6 白介素6IL-10 Interleukin-10 白介素10IP-10 Interferon induced protein 10 干扰素诱导蛋白10IR Inhibition rate 抑制率kDa Kilodalton 千道尔顿MBP Maltose binding protein 麦芽糖结合蛋白MCP-1 monocyte chemoattractant protein-1 单核细胞趋化蛋白- 1MDSC Myeloid-derived suppressor cell 骨髓源性抑制细胞NK Natural killer cell 自然杀伤细胞NKT Natural killer T cell 自然杀伤T细胞PBS PHospHate-buffered saline 磷酸盐缓冲液RNA Ribonucleic acid 核糖核酸SFU Spot-forming units 斑点形成单位TAM Tumor Associated Macrophages 肿瘤相关巨噬细胞TGF-βTransforming Growth Factor β转化生长因子βTh1 T helper 1 cell T细胞辅助细胞1Th2 T helper 2 cell T细胞辅助细胞2TLR Toll-like receptor Toll样受体TNF-αTumor necrosis factor-α肿瘤坏死因子αX常见英文缩写一览表Treg regulatory T cell 调节性T细胞VI Viscera index 脏器指数VEGF Vascular endothelial growth factor 血管内皮细胞生长因子XI引言1 引言1.1 选题背景随着社会的进步，人们生活节奏加快和环境污染愈演愈烈，全球范围内肿瘤发生率在逐年增加。