广东_海南_福建3省罗非鱼链球菌PCR鉴定和PFGE基因型分析_李莉萍 (1)

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罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性

罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性王蓓;李桂欢;王培;汤菊芬;鲁义善;吴灶和;简纪常【期刊名称】《渔业科学进展》【年(卷),期】2014(000)006【摘要】Streptococcus is a genus of spherical gram-positive bacteria that can infect a wide range of hosts. Streptococcal diseases of cultured fish caused by Streptococcus agalactiae have been frequently reported in South China, which incurred catastrophic economic losses. Vaccine is one of effective ways to control and eradicate infectious diseases, and so far no effective subunit vaccine for S. agalactiae diseases has been developed. To test whether Hemolysin (Hly) is a potential candidate for vaccine development of Oreochromis niloticus, we cloned hly gene based on bioinformatics analysis and constructed and expressed it. The open reading frame of hly gene contains 1335 bp that encodes 444 amino acid residues. Alignment analysis indicated that the Hly protein was highly homologous to Hly proteins from other Streptococcus(99%). SDS-PAGE confirmed the expression of Hly (51.7 kD) in Escherichia coli BL21(DE3). Then, the recombinant Hly protein was purified by affinity chromatography, which was used for vaccination in Tilapia, O. niloticus. Immunogenicity was confirmed by subsequent western blotting. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) analysis demonstrated that Hly produced an observable antibody response in all vaccinated fish, and the maximum antibody titersin the sera reached 1:4096. The RPS value for the Sip vaccine was 70. Tilapia vaccinated with Hly was highly resistant to the infection of the contaminant S. agalactiae. These results indicate that Hly is an effective vaccine candidate against S. agalactiae for tilapia, O. niloticus.%为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin, Hly)对鱼体的免疫保护作用，根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因，定向克隆于原核表达载体pET-28a中，构建原核重组质粒pET-28a-hly，经IPTG诱导表达后，制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼，并分析疫苗的免疫保护力。

罗非鱼无乳链球菌的分离纯化及鉴定

罗非鱼无乳链球菌的分离纯化及鉴定李旻;梁万文;陈汉忠;王凯;陈明;王瑞;陈福艳;米强;吴文德;李雪;黄甜【摘要】目的:对从广西等地暴发链球菌病的罗非鱼养殖场采集的病料分离的几株致病菌进行分离纯化和鉴定.方法:采用传统的常规方法和分子生物学鉴定方法对病菌菌株进行了综合的分析鉴定.结果:根据分离菌株的形态特征、生化特性初步鉴定这三个分离菌株为无乳链球菌株,再进行PCR检测、克隆测序及Blast比对分析,以及动物致病性回归试验等进行综合的分析,最后将分离纯化的三个菌株鉴定为无乳链球菌株.结论:这些无乳链球菌菌株的分离纯化和鉴定,为进一步研究罗非鱼无乳链球菌病的检测、监测方法和各种防控方法奠定了基础.【期刊名称】《大众科技》【年(卷),期】2017(019)011【总页数】5页(P85-89)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;分离鉴定【作者】李旻;梁万文;陈汉忠;王凯;陈明;王瑞;陈福艳;米强;吴文德;李雪;黄甜【作者单位】广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005;广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西水产科学研究院·广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室,广西南宁 530021;广西水产畜牧学校,广西南宁 530021;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005;广西大学动物科技学院,广西南宁 530005【正文语种】中文【中图分类】S965水生动物类链球菌病是一种由链球菌感染引起的疾病，目前，链球菌已成为全球性主要水生动物类致病菌之一。

罗非鱼链球菌病病原鉴定及中草药药敏试验

随着罗非鱼养殖业的迅猛发展，近年在广东、海南、福建、等省的养殖罗非鱼中暴发一种流行病 —链球菌广西
中草药药敏试验显示，陈蒿散、茵黄连解毒散、黄连解毒散改方、三黄散、连有良好的抑菌效果。黄病，论是网箱，是池塘养殖的罗非鱼，有此病的发生，无还都主要危害亲鱼及１０克以上的幼鱼和成鱼。罗非鱼链０
方法对分纯菌株进行革兰氏染色、镜检以及溶血试验。
１４生理生化试验．
备。然后取出含药纸片置于一纱布袋中，以真空抽气使之干燥。干燥后立即装入无菌小瓶中加塞，于干燥器置内或冰箱冰冻层中保存备用。
取分纯细菌，分别接种于各生化培养管中，８Ｃ２￣培养４ｈ每天观察生化管颜色变化。８，
片中心相距不少于２ｍ４ｍ，纸片与平皿边缘不少于
菌圈出现；陈蒿散、茵黄连解毒散、黄连解毒散改方、三黄散、黄连素为中敏， Байду номын сангаас现出良好的抑菌效果。其余各组中药的抑菌圈直径均在ｌｍｍ以下为低敏，抑菌效Ｏ
２ｈ培养后取出检查，用标尺度量各个平板出现４的抑菌圈，记录结果。试验结果表明，照纸片无抑并对
液浓度至ｌｓ／ｌ０个ｍ。将待检菌液各取０２在普通琼．ｍｌ脂平板上均匀涂抹，盖后放置５ｉ，镊子将药敏加ｍｎ用纸片平放在平板上，并轻压使其紧贴在平板表面，纸两

罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定及药敏试验

罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定及药敏试验陆英杰;赖达光;田鑫江;于辉【摘要】为明确广东佛山某罗非鱼鱼场暴发疑似链球菌病的病原情况,应用脑心浸液培养基、胰蛋白大豆琼脂培养基对患病罗非鱼的肝、胆组织进行细菌分离,对获得的革兰氏阳性链球菌应用16S rDNA引物进行基因序列鉴定,并对被确定的链球菌进行基因进化分析,同时进行阿奇霉素、链霉素、阿米卡星等10种抗生素的药敏试验.结果表明,分离获得革兰氏阳性链球菌1株,经16S rDNA基因扩增鉴定为海豚链球菌;基因进化分析显示,该菌与海豚链球菌和禽的副乳链球菌亲缘关系最近;药敏试验结果显示,该菌对阿奇霉素和头孢噻肟中度敏感,对其他抗生素不敏感.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2014(041)007【总页数】4页(P110-113)【关键词】罗非鱼;海豚链球菌;分离鉴定;药敏试验【作者】陆英杰;赖达光;田鑫江;于辉【作者单位】佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山 528200;佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山 528200;佛山市南海百容水产良种有限公司,广东佛山528232;佛山科学技术学院生命科学学院,广东佛山 528200【正文语种】中文【中图分类】S917.1罗非鱼是原产于非洲的一种热带中小型鱼类，因其具有食欲广、适应性强、生长快、繁殖力高等优点，成为联合国粮农组织推荐的养殖品种，目前已被世界各地广泛引种并养殖。

我国是世界上最大的罗非鱼养殖地，罗非鱼也是我国出口的主要养殖品种之一，罗非鱼产业对于我国乃至世界食物供应、增加就业机会以及促进国际贸易等均具有十分重要的意义 [1-2]。

然而，近年来罗非鱼病害的发生逐渐成为我国罗非鱼产业的主要制约因素，且危害呈越发严重的趋势，其中鱼类链球菌是造成鱼类养殖业经济损失的重要致病菌[2-3]。

链球菌（Streptococcus spp.）是一种广泛分布于自然界的革兰氏阳性菌，是人类的重要病原之一，可引起败血病、肺炎及脑膜炎等疾病，同时也是其他多种脊椎动物包括猪、牛、鱼等的重要病原菌。

罗非鱼致病性无乳链球菌的分离鉴定及药敏试验

罗非鱼致病性无乳链球菌的分离鉴定及药敏试验黄艳华;彭亚;刘杰;彭民毅;黄钧;胡大胜;陈明;马旦梅;曾桂忠【摘要】[Objective]Pathogenic bacteria strains were isolated and identified from diseased tilapia cultured in a fish farm in Santang Town, Nanning City, Guangxi. A drug sensitivity test was conducted to seek out the aetiological agent and provide references for effective prevention and control. [Method]The strains were separated from the brain tissue in dying tilapias using routine method. Pathogenicity of the strains was determined by an artificial infection experiment. The strains were identi-fied using API20Strep and the 16S rRNA sequences. K-B was applied to test the drug sensitivity. [Result]Four Gram-positive cocci (GXN01, GXN02,GXN03 and GXN04) possessed strong pathogenicity against healthy tilapia and they might be the aetiological agent causing tilapia to death. The four strains were identified as Streptococcus agalactiae. All the strains shared 99.2%-99.7% similarities with those S. agalactiae strains reported in GenBank (JQ039365,JQ039376,JQ990156, JQ039366, JF423948, HQ645984 andGU217535). These four strains also shared high similarities(99.9%) with each other. Drug susceptibility test results showed that the four strains were sensitive to ofloxacin, cephalosporinVI, cefobid and sarafloxacin hydrochloric,but resistant to gentamicin, norfloxacin, sulfadoxine-6-methoxymethoxypyrimidine and sulfa-methoxy-pyrimidine. [Conclusion]The deaths of tilapia might be caused by S. agalactiae infection. Four kinds of drugs (CephalosporinVI, Ofloxacin, Cefobid andSarafloxacin hydrochloric) could be used for prevention and treatment.%【目的】对广西南宁市郊三塘镇某养殖场患病罗非鱼进行病原菌分离鉴定及药敏试验，旨在找出罗非鱼的发病原因，为该病的有效防治提供依据。

海南罗非鱼无乳链球菌血清型及耐药性研究

第３５卷第５期
２０１３年５月
中国预防兽医学报
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｒｅｖｅｎｉｔｖｅＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｎｅｉ
ＶＯ１．３５．Ｎｏ．５
ＨＵＯＨｕａｎ — ｈｕａｎ，，ＫＥＸｉａｏ — ｌｉ，ＬＵＭａｉ — ｘｉｎ ‘ ，ＬＩＱｉｎｇ－ｙｏｎｇ，，ＧＡＯＦｅｎｇ－ｙｉｎｇ，
ＺＨＵＨｕａ－ｐｉｎｇ，ＨＵＡＮＧＺｈａｎｇ — ｈａｎ ‘
海南省各地罗非鱼养殖场中分离到的２４株病原茵进行常规细茵鉴定，结果显示，病原茵革兰染色阳性、球形、短链状，Ｂ溶血，结合１６ＳｒＲＮＡ基因鉴定确认２４株病原茵均为无乳链球菌。ＰｅＲ法扩增菌株荚膜多糖（ｃｐｓ）基因鉴定其血清型，表明２４株无乳链球菌血清型均为Ｉａ型。采用Ｋ－Ｂ纸片扩散法检测分离茵株对３１种常用抗生素的敏感性，结果表明多数菌株对氨基糖苷类和喹诺酮类药物敏感率低，对强力霉素敏感。对于多数抗生素，２０１１
ｆ１．中国水产科学研究院珠江水产研究所农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州５１０３８０；２．上海海洋大学水产与生命学院，上海２０１３０６）
摘
要：为研究罗非鱼无乳链球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）血清型与耐药性之间的关系，本研究对２０１０年～２Ｏ１１年从

广东地区感染养殖罗非鱼的无乳链球菌分子分型研究

广东地区感染养殖罗非鱼的无乳链球菌分子分型研究方伟;梁宇恒;宁丹;柯碧霞;柯昌文;邓小玲;彭华林;孙九峰;王云新【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2016(055)002【摘要】以广东省内5个罗非鱼 Oreochromis niloticus 主要养殖区内分离的无乳链球菌 Streptococcus agalactiae 为研究目标，通过毒力基因 PCR 检测、多位点序列分型、脉冲场凝胶电泳技术研究广东地区感染罗非鱼的无乳链球菌分子特征。

结果发现170株分离无乳链球菌中毒力基因的携带率介于60.59％～100％之间，毒力基因携带形成10个谱系，dltR-bca-sodA-spb1-cfb-bac （38.24％，65／170），dltr-bca-sodA-spb1-bac （23.53％，40／170）和dltr-bca-sodA-spb1-cfb-bac-scpB （22，35％，38／170）为主要的谱系，dltr-bca-sodA-spb1-bac-scpb （8.24％，14／170）和 dltr-bca-sodA-spb1（4.71％，8／170）次之。

多位点序列分型研究证实170株菌在7个位点均为单一的等位基因，为 adhP （10），pheS （1），atr （2），glnA （1），sdhA （3），glcK （2），tkt （2），序列型为 ST7型。

146株菌脉冲场凝胶电泳结果表明146株菌分为6个簇（A-D，F，G），相似性介于86％～100％之间。

A （18），B （16），C （103），D （7）为主要的遗传簇，占菌株数的98.63％（144／146）。

基因簇 A，C 在4个采样区均有发现；基因簇 B 分布在吴川、茂名和阳江；基因簇 D 分布在茂名、珠海和阳江；基因簇 F 和 G 分别来自茂名和珠海。

在A-D 遗传簇中均有发现来自不同地区的菌株呈现100％的相似性，为同一克隆株。

广东罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及生物学特性分析

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报广东罗非鱼无乳链球菌分离鉴定及生物学特性分析摘要：本研究旨在明确当前罗非鱼无乳链球菌流行状况和生物学特性，为鱼源无乳链球菌病防控提供新的数据。

本研究于2019—2020年，从广东罗非鱼主养区茂名、湛江地区采集病样进行无乳链球菌的分离鉴定。

用PCR 方法对分离株血清型及4个主要毒力基因进行检测，通过纸片法对分离菌株进行31种抗菌药物药敏试验和多重耐药研究，利用斑马鱼模型进行了致病性试验。

结果显示：从261份病样中分离到35株无乳链球菌；血清型检测表明无乳链球菌分离株的血清型均为Ia 型；主要毒力基因的检测证明，cylE 、sodA 、gapC 基因在所有鱼源分离株及人源、牛源和鱼源参考株中检出率均为100%，而scpB 只在人源参考菌株中检出；药敏试验结果发现，无乳链球菌分离株对19种抗菌药敏感率为90%以上，对6种抗菌药耐药率为50%以上，分离株的耐药基因型和表型部分一致，无乳链球菌分离株均多重耐药，其中5重及以上耐药的菌株为27株，占总菌株数的77.1%；斑马鱼致病试验表明，无乳链球菌分离株可导致斑马鱼不同程度的发病死亡。

本研究明确了当前罗非鱼源无乳链球菌的血清型、毒力基因、耐药特性和致病性，为广东乃至全国罗非鱼无乳链球菌病的防控提供了参考。

关键词：罗非鱼；无乳链球菌；分离鉴定；生物学特性中图分类号：S943文献标志码：A文章编号：1674-6422（2024）02-0073-10I solation and Characterization of Streptococcus agalactiae from Tilapia in GuangdongGUO Changming 1, CHEN Huaijun 2, YUAN Cheng 1, YUAN Sheng 1, JIA Guohua 3,WANG Yiren 3, ZHU Shanyuan 1(1. Jiangsu Key Laboratory for High-T ech Research and Development of V eterinary Biopharmaceuticals, Jiangsu Agri-animal Husbandry Vocational College, T aizhou 225300, China; 2. College of Animal Science and T echnology, Guangxi University, Nanning 530004, China; 3. Zhanjiang HengxingBreeding T echnology Service Co.,Ltd., Zhanjiang 524000, China)收稿日期：2022-03-25基金项目：江苏省高等学校自然科学研究面上项目（19KJB230005）；江苏高校“青蓝工程”项目（苏教师函［2021］11号）；泰州市科技支撑计划（农业）项目（TN201916）；泰州市311高层次人才培养工程（[2019]21号）作者简介：郭长明，男，博士，副教授，主要从事兽医微生物学与免疫学研究通信作者：朱善元，E-mail：***************Abstract: The purpose of this study was to investigate the current epidemic status and biological characteristics of Streptococcus agalacti ae in tilapia and to provide new data for the prevention and control of S. agalacti ae disease in ﬁsh. In this study, 261 samples of diseased ﬁ sh were collected from 2019 to 2020 from the main culture area of tilapia in Guangdong. The serotypes and four main virulence genes of the isolated strains were tested in PCR. The antibiotic sensitivity and multiple resistance to antibiotics of 31 kinds of antibiotics were detected. Total 35 S. agalactiae strains were isolated from 261 samples and determined to be serotype Ia. The majorv irulence genes cylE , sodA and gapC were detected in all ﬁ sh isolates and all tested human, bovine and ﬁ sh reference strains while virulence gene scpB2024,32(2):73-82郭长明1，陈怀君2，袁橙1，袁圣1，贾国华3，王义仁3，朱善元1（1.江苏农牧科技职业学院江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室，泰州225300；2.广西大学动物科学技术学院，南宁530004；3.湛江恒兴养殖技术服务有限公司，湛江524000）· 74 ·中国动物传染病学报2024年4月罗非鱼具有食性广、生长速度快、抗病能力强等优点，世界范围内已经有100多个国家和地区在养殖罗非鱼，年产量超过300万吨[1]。

3个罗非鱼种群对4种病原菌的抗病力差异比较

3个罗非鱼种群对4种病原菌的抗病力差异比较作者：敖秋桅朱佳杰来源：《南方农业学报》2020年第03期摘要：【目的】比較吉富罗非鱼F5代（以下简称吉富F5代）、吉富罗非鱼F0代（以下简称吉富F0代）及奥尼罗非鱼对4种病原菌的抗病力差异，为罗非鱼苗种推广养殖提供参考依据。

【方法】检测吉富F5代无乳链球菌（Ia和Ib血清型）、海豚链球菌和嗜水气单胞菌对吉富F5代的半致死浓度（LC50），并对3个罗非鱼种群进行人工腹腔注射感染4种病原菌，根据感染后的累计死亡率评估其抗病力差异。

【结果】无乳链球菌Ia血清型对吉富F5代的LC50为2.14×105 CFU/mL，无链球菌Ib血清型对吉富F5代的LC50为2.14×106 CFU/mL，海豚链球菌对吉富F5代的LC50为2.14×107 CFU/mL，嗜水气单胞菌对吉富F5代的LC50为5.62×107 CFU/mL。

3个罗非鱼种群感染病原菌后连续观察168 h发现，感染无乳链球菌Ia血清型菌株（HN016）的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼;感染无乳链球菌Ib血清型菌株（GX26）的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼;感染海豚链球菌菌株（GX05）的累计死亡率排序为吉富F0代>奥尼罗非鱼>吉富F5代;感染嗜水气单胞菌菌株（GX03）的累计死亡率排序为吉富F0代>吉富F5代>奥尼罗非鱼。

方差分析结果显示，吉富F5代感染HN016、GX26、GX05和GX03后的累计死亡率均显著低于吉富F0代（P<0.05），与奥尼罗非鱼差异不显著（P>0.05）。

【结论】经过连续5代选育后，吉富罗非鱼对无乳链球菌（Ia和Ib血清型）、海豚链球菌及嗜水气单胞菌的抗感染能力均得到显著提高，并已接近奥尼罗非鱼的抗病水平。

关键词：罗非鱼;抗病性;无乳链球菌;海豚链球菌;嗜水气单胞菌0 引言【研究意义】我国自20世纪90年代后期引进吉富罗非鱼并大面积推广养殖后，罗非鱼产业得到飞速发展，并逐步发展成为全球最大的罗非鱼养殖及出口国家（陈胜军等，2007;袁永明等，2013）。

广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性

广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性柯剑;赵飞;罗理;姜兰;卢迈新;邹为民【摘要】从广东省5个罗非鱼主养区患暴发性的罗非鱼中分离到15株菌,挑选其中的5株(不同地域、不同组织分离的菌株)进行人工感染试验,表现出自然发病的症状,确定此5株分离菌为导致罗非鱼暴发病的主要病原.通过形态学观察和生理生化实验,并结合16SrRNA基因序列分析,5株分离菌株均为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae).5株分离菌在形态学和生理生化实验结果上保持一致,16SrRNA基因序列同源性达98.6%～99.8%,但在致病性和对药物的敏感性上却呈现一定的差异.另外10株分离菌株通过生理生化实验鉴定也为无乳链球菌.研究表明,广东省罗非鱼流行性暴发病的病原菌主要为无乳链球菌.【期刊名称】《广东海洋大学学报》【年(卷),期】2010(030)003【总页数】6页(P22-27)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;致病性;细菌鉴定【作者】柯剑;赵飞;罗理;姜兰;卢迈新;邹为民【作者单位】中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;上海海洋大学水产与生命学院,上海,200090;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380;中国水产科学研究院珠江水产研究所,广东,广州,510380【正文语种】中文【中图分类】S941.42我国是世界上最大的罗非鱼养殖地，罗非鱼是我国出口的主要养殖品种之一[1]。

然而，近年来罗非鱼病害的发生逐渐成为我国罗非鱼产业的主要制约因素，且危害呈越发严重的趋势。

国外报道引发罗非鱼病害的主要病原为海豚链球菌（Streptococcus iniae） [2-4]和无乳链球菌（S.agalactiae）[5-6]。

广东、海南、福建3省罗非鱼链球菌病流行菌株PCR鉴定和PFGE基因型分析

ＨＵＡＮＧＹａｎ，ＬＥＩＡｉ－ｙｉｎｇｌＣＨＥＮＭｉｎｇ・ ¨ ，
，
ＬＩＡＮＧＷａｎ — ｗｅｎ‘ ’
（１．ＧｕａｎｇｘｉＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｒｆＡｑｕａｉｔｃＧｅｎｅｔｉｃＢｒｅｅｄｉｎｇａｎｄＨｅａｌｔｈｙＡｕａｑｃｕｌｕｒｔｅ，ＧｕａｎＩ【ｎｓｉｔｔｕｔｅｏｆＦｉｓｈｅｉｒｅｓ，ＧｕａｎｇｘｉＮａｎｎｉｎｇ５３００２１，Ｃｈｉｎａ；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅｎｄａＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧｕｎｇａｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＧｕａｎｇｘｉＮａｎｎｉｎｇ５３０００５，Ｃｈｉｎａ；３．ｅａＧｎ￣ＣｅｎｔｅｒｆｏｒＤｉｓｅａｓｅＣｏｎｔｒｏｌｎｄａＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＧｕｎｇａｘｉＮａｒｍｉｎｇ５３００２１，Ｃｈｉｎａ）
广东、海南、福建３省罗非鱼链球菌病流行菌株ＰＣＲ鉴定和ＰＦＧＥ基因型分析
李莉萍，王瑞，黄婷，甘西，李健２，
黄维义，黄彦，雷爱莹，陈明，，梁万文ｈ
（１．广西水产研究所广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁５３００２１；２．广西大学动物科学技术学院，广西南宁

广东省罗非鱼主养区无乳链球菌的分离、鉴定与致病性

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文章编号：１７ — １９（０００－０２－６３９５２１）３０２－６－０
Ｉｏａｉｎ，ｄｅｔｆｃｔｏｎｔｇｎｉｉｙｏｔｇｎｃＢａｔｒａｏｓｌｔｏＩｎｉａｉｎａｄＰａｈｏｅｃｔｆＰａｈｏｅｉｃｅｉｆｉＦｕｌｉｎｓａｅｏｌｐａｉｕａｇｎｏｎｅｍｎａｔＤｉｅｓｆＴｉａｉｎＧｎｄｏｇＰｒｖｉｃ
但在致病性和对药物的敏感性上却呈现一定的差异。另外ｌ株分离菌株通过生理生化实验鉴定也为无乳链球菌。０
研究表明，广东省罗非鱼流行性暴发病的病原菌主要为无乳链球菌。
关键词：罗非鱼；无乳链球菌；致病性；细菌鉴定
中图分类号：￥４．９１２４文献标志码：Ａ
ＧｕｎｄｎｒｖｎｅｗｈｒｎｕｔｒｄｔａｉｒｅｏｓｆｃｅｙｔｅｆｌｎｎｉａｅＦｖａｇｏｇｐｏｉｃｅｅｍａｙｃｌｅｉｐａｗｅｅｓｒｕｌｉｅｔｄｂｕｍｉａｔｓｓ．ｉｅｕｌｉｙｎｈｄｅｓａｎｉｈｗｅｅｉｏａｅｏｄｆｅｅｔｔｓｅｉｐａａｄｄｆｅｅｔｔａｉｕｔｒｇａｅｒｔｉｓｗｈｃｒｓｌｔｄｆｍｉｒｎｉｕｓｉｔｌｉｎｉｒｎｉｐａｃｌｉａｗｅｅｒｒｓｎａｌｕｎｒｓｓｌｃｅｏｒｉｃａｆｃｉｎｅｐｒｍｅｔｎｅｔｓｆｓｐｅｅｅｓｍｉｘｅａｉｎｆｔｅｅｅｔｄｆｒａｔｉｌｉｅｔｘｅｉｎｓａｄｔｅｔｉｈａｐａｄｔｉｌｅｔｍｌｓｓｏｉｆｎｏｈｒｈｒａｇｈｎｔｒｌｉｆｃｅｌｐａｈｒｆｒ，ｆｅｓａｎｒｏｆｒｄａｈａｔｒａｐｏｅａｓｎｅａｕａｎｅｔｄｆａｉ．Ｔｅｅｏｅｉｔｉｓｗｅｅｃｎｍｅｓｔｅｂｃｅ￣ｈｇｎｃｕｉｇｔｉｖｒｉｉｈｆｌｎｎｉｅｓｆｔａｉ．ｈｖｔｉｓｗｅｅｆａｌｅｔｅｓｔｐｔｃｃｕｇｌｃｉｅｔｒｕｈｕｍｉａｔｄｓａｅｏｌｐａＴｅｆｅｓｒｎｒｉｌｉｎｉｄａｒｏｏｃｓａａａｔｈｏｇｉｉａｎｙｄｉｆＳｅａｐｙｉｌｇｃｌｎｉｃｅｃｌｅｔ，ｏｐｏｏｙｏｓｒａｉｎａｄｔｅ１ＳＲｈｓｏｏｉａｄｂｏｈｍｉａｓｓｍｒｈｌｇｂｅｖｔｒＮＡｅｅｓｑｅｃｎｌｓｓａｔｏｎｈ６ｇｎｅｕｎｅａａｙｉ．Ｔｈｖｅｔｄｓａｎｈｅｈａｉｃｅｃｌｈｒｃｅｓｉｓｔｅｓｍｉｒｙｏｅ１ＳＲＮＡｅｅｅｆｅｔｓｔｉｓｓａｄｔｅｓｍｅｂｏｈｍｉａａａｔｒｔ，ｈｉｌｉｆｔｒｉｅｒｒｃｉｃａｔｈ６ｇｎ

鱼类无乳链球菌病的研究进展

鱼类无乳链球菌病的研究进展邓永强;汪开毓【摘要】无乳链球菌是常见的人兽共患病原菌，常导致新生儿肺炎、脑膜炎、败血症及奶牛乳腺炎。

近年来，在水生动物体内也频繁分离到该菌，尤其是自2007年以来，该菌每年都在中国广东、海南、福建、广西等罗非鱼主要养殖区暴发流行，严重威胁着罗非鱼养殖业的健康发展。

作者综述了当前国内外对鱼类无乳链球菌病的病原学、流行病学、症状、病理变化、毒力因子(荚膜多糖、CAMP 因子、表面免疫原性蛋白、α蛋白、C5a 肽酶)和防控等方面的研究进展，以期为中国鱼类无乳链球菌病的防控提供参考。

%Streptococcus agalactiae is common zoonotic bacteria,which cause neonatal pneumonia, meningitis,septicemia and mastitis in dairy cows.In recent years,it was also be isolated from aquatic animals frequently.Especially since 2007,diseases caused by the bacteria outbreak in Guangdong,Hainan,Fujian,Guangxi and other tilapia aquaculture areas and had a serious threat to the healthy development of tilapia aquaculture in china.In this paper,research progresses on fish Streptococcus agalactiae disease were reviewed.Theetiology,epidemiology,symptoms,path-ological changes,virulence factors (capsular polysaccharide,CAMP factor,Sip,protein alpha,C5a peptidase)and prevention and control were included in the review,which would provide refer-ences for the fish Streptococcus agalactiae disease prevention and control.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2016(043)009【总页数】6页(P2490-2495)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;进展【作者】邓永强;汪开毓【作者单位】四川农业大学，成都 611130; 四川省动物疫病预防控制中心，成都610041;四川农业大学，成都 611130【正文语种】中文【中图分类】S852.61+1无乳链球菌(Streptococcus agalactiae，S.agalactiae)是一种革兰氏阳性球菌，最初常因引起奶牛乳腺炎，造成奶产量下降而引起关注[1]。

论文：基于HSP60基因序列分析的致病弧菌的分子鉴定技术

基于HSP60基因序列分析的致病弧菌的分子鉴定技术梁丽萍，李艳兰，郑玉英汕头大学理学院生物系，广东汕头515063摘要：本实验在从海水及海产品中通过TCBS平板的分离出一批弧菌，采用TENS 法提取菌体DNA，继而利用PCR技术扩增弧菌的HSP60基因，得到5个菌种的PCR 扩增物，PCR扩增物再通过序列测定、比对，发现5个菌种的辨识度最高的同源序列并非属于弧菌菌属，实验讨论的部分对造成这个结果的原因进行了分析。

关键词：致病弧菌；HSP60基因序列分析；分子鉴定由弧菌属细菌(Vibrio spp.)引起的弧菌病(Vibriosis)是在世界各地海水养殖鱼、虾、贝类等动物中普遍流行、危害最大的细菌性疾病。

在已知的弧菌中,有10多种是海洋养殖动物的病原菌。

近十年来,对病原弧菌的致病机理研究已成为对弧菌病研究的重点和最活跃的研究领域。

研究工作主要包括对常见的病原弧菌在养殖动物体内外环境中的生存能力、侵袭能力及抗宿主的防御能力等方面的研究。

对病原弧菌致病机理的研究最终将会为弧菌病的防治提供可靠的科学依据［1］。

长期以来,人们对病原弧菌的致病性研究一直是利用分离菌株对养殖动物进行各种方式的人工感染,通过观察实验动物是否发病来判断病原弧菌的致病性［2］,虽然随着医学微生物学及分子生物学技术的不断发展,当今对病原弧菌致病机理的研究热点已进入到了分子生物学和超微结构观察阶段，但这些研究都需要对不同来源，不同特性的弧菌进行大量的研究，因此，对致病弧菌进行分离和鉴定，能为后续的病原弧菌致病机理的研究提供重要的研究材料。

Anita Y.C. Kwok等人研究表明，HSP60(Heat shock protein 60)基因能作为弧菌鉴定中一个非常有用的分子标签，通过对HSP60基因中一段长约600bp的序列进行扩增、测序，再和数据库中的序列比对，确定弧菌的种类［3］。

1.材料与方法TCBS琼脂培养基：用于弧菌的分离培养，酵母膏5g，蛋白胨10g，蔗糖20g，硫代硫酸钠10g，柠檬酸钠10g，牛胆酸钠3g，牛胆汁粉5g，氯化钠10g，柠檬酸铁1g，溴麝香草酚蓝（2%溶液）20mL，草酚蓝（1%溶液）4mL，琼脂15g，pH8.6；LB培养基（100ml）：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，NaCl 1g，琼脂1.5g，PH 7.0, 121℃高压灭菌；肉汤培养基（1L）：牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g（弧菌较耐盐，所以增加到3.0g，即3%），PH7.0，121℃高压灭菌；TENS提取液（100ml）：50mM Tris 0.6057g，20 EDTA 0.7444g，100 NaCl 0.5844g，1%SDS 1g ；PCRMix：即TaqDNA聚合酶：4dNTPs：10×PCRbuffer = 1：1：5 ；1.0%琼脂糖凝胶：1g琼脂糖溶于100ml的TAE缓冲液中，微波炉加热至沸3次以上，倒板前让凝胶稍冷并加入1/10000的EB；1.1水样的采集及菌种的分离2008年9月在南澳采集海水样品。

罗非鱼无乳链球菌LrrG-Sip融合蛋白免疫原性研究

Ｖｏｌ＿１３．Ｎｏ．３
Ｊｕｎ．，２０１７
罗非鱼无乳链球菌ＬｒｒＧ — Ｓｉｐ融合蛋白免疫原性研究
曾祖聪一，可小丽，卢迈新，刘志刚，曹建萌，高风英，朱华平，王淼
（１．中国水产科学研究院珠江水产研究所，农业部热带亚热带水产资源利用与养殖重点实验室，广东广州，５１０３８０；２．上海海洋大学水产与生命学院，上海２０１３０６）
摘要：为探究无乳链球菌ＬｒｒＧ（Ｌｅｕｃｉｎｅ — ｒｉｃｈｒｅｐｅａｔｐｒｏｔｅｉｎｆｒｏｍＧＢＳ）和表面免疫原性蛋白Ｓｉｐ（ｓｕｒｆａｃｅｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｐｒｏｔｅｉｎ）串联表达的ＬｒｒＧ．ｓｉｐ重组融合蛋白的免疫原性，该研究将原核表达的ＬｒｒＧ — ｓｉｐ重组融合蛋白分别以０．５ｔｘｇ・ｇ（Ｒ１组）、１．０恤ｇ・ｇ（Ｒ２组）和１．５Ｉ．ｚｇ・ｇ（Ｒ３组）每尾２００腹腔注射免疫尼罗罗非鱼（Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓ
ＺＥＮＧＺｕｃｏｎｇ，ＫＥＸｉａｏｌｉ，ＬＵＭａｉｘｉｎ，ＬＩＵＺｈｉｇａｎｇ，ＣＡＯＪｉａｎｍｅｎｇ，
ＧＡＯＦｅｎｇｙｉｎｇ，ＺＨＵＨｕａｐｉｎｇ。ＷＡＮＧＭｉａｏ
，

罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量 PCR 检测方法建立

罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量 PCR 检测方法建立王瑞;李莉萍;黄婷;梁万文;梁聪;雷爱莹;陈明【摘要】为建立一种罗非鱼组织内无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）的定量检测方法，以无乳链球菌 cfb 基因为靶标建立了 TaqMan 荧光探针实时定量PCR 方法，并对该方法的特异性、敏感性及实用性进行了验证。

应用建立的方法检测无乳链球菌标准菌株和阳性菌株均为阳性，阴性对照菌株均为阴性；无乳链球菌基因组 DNA 最低检测质量浓度为3.42×10-7 ng·μL -1，每个反应体系检测下限低于10个细胞；人工感染罗非鱼肝、脾、中肠和肾组织样品无乳链球菌检测结果均为阳性，组织样品每微克 DNA 可检测到无乳链球菌细胞数量分别为2.95×103个、2.45×107个、2.34×103个和4.54×104个，对照组为阴性。

结果表明建立的罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量PCR 检测方法具有准确性高、特异性和敏感性强等特点，可对罗非鱼组织内无乳链球菌进行快速定量检测，可用于罗非鱼无乳链球菌病的监测与预防。

%By designing primers and probe based on the conserved region of cfb gene of Streptococcus agalactiae isolated from tilapia, we developed a real-time fluorescent PCR assay for detection of S. agalactiae from tilapia tissue and verified thespecificity,sensitivity and practicability of the assay. The standard and positive strains of S. agalactiae were positive,and all negative controls were negative. The minimum detectable concentration of S. agalactiae genome DNA was 3. 42 × 10 - 7 ng·μL - 1 ,and the detection limit of the assay was less than 10 cells per reaction system. The genome DNA samples of midgut,liver,spleen and kidney which were collected from tilapia artificially infected with S. agalactiae were tested by real-time PCR and were positive.The quantities of S. agalactiae detected in per μg DNA of tissue samples were 2. 95 × 103 cells,2. 45 × 107 cells,2. 34 × 103 cells and 4. 54 × 104 cells,respectively,and the controls were negative. The results show that the real-time quantitative PCR assay which we developed was accurate,specific and sen-sitive,and could detect S. agalactiae from various tilapia tissues rapidly. The method can be used for surveillance and prevention of S. agalactiae disease of tilapia.【期刊名称】《南方水产科学》【年(卷),期】2015(000)003【总页数】6页(P41-46)【关键词】罗非鱼;无乳链球菌;实时荧光定量 PCR;TaqMan 荧光探针【作者】王瑞;李莉萍;黄婷;梁万文;梁聪;雷爱莹;陈明【作者单位】广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁530021;广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021;广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021;广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021;广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021;广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021;广西水产科学研究院，广西水产遗传育种与健康养殖重点实验室，广西南宁 530021【正文语种】中文【中图分类】S943.125中国是罗非鱼养殖量最大的国家，2004年开始年产量均占世界总产量40%以上[1]。

罗非鱼链球菌病检测技术

养殖与饲料2017年第2期摘要为了解并掌握罗非鱼链球菌检测技术，探索罗非鱼链球菌不同致病性菌株及其基因分型，给有效防控罗非鱼链球菌病提供科学依据，采用PCR 扩增技术及PFGE 图像分析技术对罗非鱼链球菌致病菌株进行分离鉴定，检测分离菌株的致病性特点。

结果表明罗非鱼链球菌病分别由海豚链球菌及无乳链球菌2种病因引起。

罗非鱼链球菌菌株基因型复杂，不同地区的优势菌群存在很大差异，PCR 与PFGE 相结合的鉴定方法可高效、准确地检测到罗非鱼链球菌。

关键词罗非鱼；链球菌病；检测技术罗非鱼链球菌病检测技术吴山楠海南出入境检验检疫局，海口570311收稿日期：2016-12-28基金项目：海南省科技兴海专项“罗非鱼链球菌病快速检测技术研究（XH201409）”吴山楠，男，1981年生，兽医师。

罗非鱼是我国南方的主要鱼种之一。

在广东、广西、海南、福建四省是罗非鱼的主要养殖地，广东省每年罗非鱼的产量约60万t[1]；广西罗非鱼仅2010年养殖总产量达到21.6万t [2]。

因其肉质鲜美，营养丰富而远销欧美等发达国家，因此成为我国水产养殖业不可或缺的重要组成部分。

但目前已有许多国家报道食用罗非鱼引发罗非鱼链球菌病的暴发与流行事件[3]。

罗非鱼链球菌病已成为我国乃至世界重要的细菌性疾病之一，不仅危害人类健康，也同时给水产养殖业造成了巨大的经济损失。

据文献报道，仅2012年罗非鱼链球菌病给我国造成直接经济损失10亿～15亿元[4]，严重制约了罗非鱼养殖业的健康发展[5]。

因此，本次研究过程中将罗非鱼链球菌菌株进行临床分离，探索罗非鱼链球菌病快速检测的高效技术。

1材料与方法1.1选用的检测试剂及标准菌株1）标准菌株。

自中国微生物菌种贮藏中心购置海豚链球菌ATCC29178、无乳链球菌ATCC27956。

2）检测试剂。

分别自Omega 公司购置质粒DNA 提取试剂盒及胶回收试剂盒；自Invitrogen 公司购置Novagen His Band 蛋白纯化试剂盒；自广东环凯微生物科技有限公司购置DAB 显色试剂盒；自上海生工生物技术有限公司购置EX-Taq DNA 聚合酶；自Promega 公司购置SDS ，EDTARNase Free DNase I 。