保存时间及温度对大肠杆菌感受态转化效率的影响
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备原理：大肠杆菌自然条件下极难进行转化，其关键原因是转化因子吸收较为困难。
在转化试验中，通常先采取人工方法制备感受态细胞，代表性方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现多种蛋白质和酶，负责供体DNA结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接收外来DNA分子受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞转化：①在0℃CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促进细胞外膜和内膜间隙中部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能和加入DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜液晶结构发生猛烈扰动，并随之出现很多间隙，为DNA分子提供了进入细胞通道。
一、受体菌培养从LB平板上挑取新活化E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50百分比接种于100ml LB 液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷0.05mol/LCaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油0.05mol/LCaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl小份,贮存于-80℃可保留半年。
大肠杆菌感受态过程中注意事项：1、细菌生长状态：不要用经过数次转接或储于4℃培养菌，最好从-80℃甘油保留菌种中直接转接用于制备感受态细胞菌液。
感受态细胞转化效率计算
感受态细胞转化效率计算感受态细胞（Signal-responsive cells）是指在一定条件下，细胞对外界信号产生反应并改变其细胞命运的现象。
在分子生物学和细胞生物学研究中，感受态细胞转化效率的计算是一项重要的工作。
本文将介绍感受态细胞转化效率的计算方法，以及影响感受态细胞转化效率的因素。
下面是本店铺为大家精心编写的4篇《感受态细胞转化效率计算》，供大家借鉴与参考，希望对大家有所帮助。
《感受态细胞转化效率计算》篇1一、感受态细胞转化效率的计算方法感受态细胞转化效率的计算方法是通过将转化后的细胞数目除以转化前的细胞数目，再乘以 100% 得到的。
即：转化效率（%）=（转化后的细胞数目÷转化前的细胞数目）×100%其中，转化前的细胞数目是指未经转化的细胞数目，转化后的细胞数目是指经过转化后存活下来的细胞数目。
二、影响感受态细胞转化效率的因素感受态细胞转化效率的高低受多种因素影响，包括：1. 细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度，尽量使用对数生长期的细胞。
DH5 菌株 OD600 为 0.5 时细胞密度是5107/ml。
2. 无菌条件和冰上操作：所有操作均应在无菌条件和冰上进行。
3. CaCl2 处理：经 CaCl2 处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24 小时达到最高，之后转化率再下降。
这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的。
4. 化合物及无机离子的影响：在 Ca2 的基础上联合其他二价金属离子（如 Mn2 或 Co2）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。
一般来讲 CaCl2/CoCl2 法及二甲基亚砜（DMSO）等可以提高转化率很多倍（100-1000）。
5. 器皿的干净程度：所使用的器皿必须干净，迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率。
6. 质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA。
影响转化率的因素
影响转化率的因素摘要：通过从载体DNA方面、重组DNA方面、受体细胞方面、转化方法及转化方法操作方面来探讨影响转化率的因素。
关键词：转化、转化率、载体、重组DNA、受体细胞、 Ca2+诱导转化法、电穿孔转化法、三亲本杂交结合转化法、PEG介导的细菌原生质体转化。
重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入细菌受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程称为转化。
转化的广义概念则指细菌细胞从周围介质中吸收DNA而发生基因型改变的生命现象。
转化率是指DNA分子转化受体菌获得的转化子的效率。
通常有两种形式表征转化率，当待转化DNA分子数大于受体细胞数的条件下，转化子数与用于待转化处理的DNA分子数或质量的比例；转化率的另一种表示形式是在受体细胞数相对于转化DNA分子数大大过量时，转化子数与用于转化处理的受体细胞的比例。
实际上转化并不限于实验室内发生，它也可以在自然状态下发生。
曾在肺炎双球菌、枯草芽孢杆菌、嗜血流感杆菌中发现[1]。
只是在自然条件下发生转化的细菌种类较少，即使发生了转化，转化效率也较低。
下面重点探讨影响转化率的因素，转化率的影响因素包括以下四个方面：1.载体DNA方面2.重组DNA方面3.受体细胞方面4.转化方法及转化方法操作方面1.1 载体本身的性质决定了转化率的高低，不同载体转化同一受体细胞，其转化率明显不同。
这根本上取决于载体的类型和其空间构象。
载体的类型方面：与受体细胞亲和性较强的载体进行转化时，其转化率明显比与受体细胞亲和性较低的载体高。
载体的空间构象方面：与开环结构或线性结构的质粒载体相比，自然双螺旋闭环结构的质粒载体的转化率较高。
此外，经体外酶切酶连操作后的载体DNA由于空间构象很难恢复，其转化率比具有超螺旋结构的载体质粒低两个数量级。
2.1 对同一受体细胞而言不同的重组DNA分子在其进行转化时转化率高低也不同。
往往是：分子质量大的重组DNA分子的转化效率比分子质量小的重组DNA 分子高，并且分子质量大于30kb的重组DNA是很难进行转化的。
不同因素对大肠杆菌转化效率的影响
广东化工2019年第7期·52 · 第46卷总第393期不同因素对大肠杆菌转化效率的影响谢恩诚，曹璐，蒋慧慧(巢湖学院化学与材料工程学院，安徽巢湖238000)The Study on Transformation Efficiency of Escherichia coli Affected by DifferentFactorsXie Encheng, Cao Lu, Jiang Huihui(School of Chemistry and Material Engineering, Chaohu University, Chaohu 238000, China) Abstract: There were numerous factors which can affect transformation efficiency in plasmid transformation process. In this study, we took two the most common strains of E.coli in transformation operation-BL21 and DH5a as our study objects and obtained optimum transformation conditions through deep explorations of ice-incubation time, heat shock time, preservation temperature and time. The result showed that we can attain the maximum transformation efficiency when competent cells were ice-incubated 60 min and heat shocked 90 s towards E. coli BL21, and the efficiency of it will extremely enhance when competent cells were preserved in -20 ℃. What’s more, 30 min ice-incubation and 120 s heat shock were the conditions that bring the maximum transformation efficiency to DH5a, and the efficiency could be sustained during preservation at -20 ℃, but sharply decline a half at 4 ℃.Keywords: transformation efficiency；ice-incubation time；heat shock time；preservation temperature；preservation time分子克隆是现今生命科学研究中最基础，也是最重要的一环。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DN A分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12 X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌BL21感受态的制备和保存方法研究
⼤肠杆菌BL21感受态的制备和保存⽅法研究⼤肠杆菌BL21感受态的制备和保存⽅法研究焦亮（细胞⽣物学 2009111107000732）[摘要] ⽬的：描述⼀种改良的⼤肠杆菌感受态制备和保藏及质粒的转化⽅法．⽅法：将CaCl2溶液改为TB溶液；其次是将培养基由LB换成NZY，并分别⽐较了不同冷冻保护剂(7%DMSO，10％⽢油)于－20℃、－80℃冰箱保存感受态细胞的效果。
结果：以TB溶液制备感受态细胞，冰浴转化10min后直接涂平板筛选转化⼦，获得与常规转化⽅法相当的转化效率,⽽以7％的DMSO为冷冻保护剂保存感受态细胞可维持107以上的转化率40d以上。
[关键词] ⼤肠杆菌；感受态细胞；制备⽅法；转化率；保存Study on Preparation and Storage of Competent Escherichia coli BL21 CellsJiao Liang[Abstract]Objective: An efficient method was described for the E. coli preparation，storage and plasmid transformation. Methods: Normal conditions were changed, from CaCl2 solution to TB solution, LB medium to NZY medium and compared different conditions for storage of competent cells.Results:High transformation efficiency was achieved by preparing the competent cells with TB solution, transforming for 10 minutes, and then following the direct selection on Amp+ LB plate, and Cells stored with dimethylsulfoxide in -80℃could keep consistently high transformation efficiency at least 40d.[Key words] competent cells; Escherichia coli; Preparation; storage⼤肠杆菌感受态细胞的制备是实验室分⼦克隆的重要试验之⼀，在实际操作中，由于感受态细胞的转化效率受到诸多因素的影响，如离⼦强度、热击参数、培养条件、保存温度及时间等，转化效率很不稳定。
大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告
分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1 引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。
体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。
感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。
本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。
2 材料和方法2.1 实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competent cell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA 的目的。
进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calcium chloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。
大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关。
而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。
感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。
本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。
转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
本实验以E coli DH5α菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。
大肠杆菌感受态多种方法
当前位置：生命经纬 > 实验技术 > 生物化学与分子生物学实验技术大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 2005-4-14 10:53:00 来源：生命经纬第一节概述在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。
转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。
受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。
进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但CaCl2 法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛。
为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素：1. 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
连接体系问题解答
关于连接的提问多集中在连接的体系、DNA的用量、vector和insert的比例、连接酶等。
但是我认为，连接不成功，问题并不一定出在连接这步上。
有很多环节影响连接的成败，如酶切的好不好、回收的质量好坏、连接时的浓度或比例、感受态等。
以下我详细说明。
1，PCR引物的设计。
通俗的不说，需要指出的是设计引物时一定要考虑切点的甲基化问题。
做普通的克隆会涉及到甲基化形式有两种：dam甲基化和dcm甲基化。
常用的大肠杆菌都有这两种甲基化酶。
dam甲基化酶识别GATC位点并甲基化；dcm甲基化酶识别CCWGG位点（W是A或T）并甲基化。
如果有这两种位点那么多数情况内切酶是切不开了。
容易受甲基化影响的内切酶有：Dpn1（GA/TC）天生就甲基化；Cla1（ATC/GAT）如果前面加个G或后面加个C那么恭喜你，dam甲基化；Xba1（T/CTAGA）如果前面加个GA或后面加个TC也是dam甲基化，等等有好多。
这些容易甲基化的切点设计引物时一定要注意，避免引入甲基化位点。
如果真是避免不了或者后来才发现问题，那么把甲基化的质粒转化到甲基化酶缺陷型大肠杆菌中再提质粒就没有甲基化，可以切了。
甲基化缺陷型菌有：DM1（Invitrogen）、INV110（invitrogen）、JM110等。
2，PCR产物。
两种方式：一种纯化后直接酶切连接；一种连T载体再往下切连接。
我个人强烈建议第二种，连T载体。
因为PCR产物直接酶切我觉得有两个缺点：①由于两头把手太短，虽说有保护碱基，但我觉得还是不如从质粒上往下切好切，而且容易切坏、切碎；②无法从电泳上看出来切没切开，因为也就切下了几个十几个bp，带形没啥变化。
连T载体的优点：①进载体后，大提一次的质粒夸张点说够用一辈子的，不用总PCR往出调了，再说PCR 那东西还不太稳定，一把多一把少的。
②酶切会很清晰，切下来了就是有带，没切动就是没有，没连上也能知道不是没切开而是别的步骤有问题。
大肠杆菌感受态制备
摇床
用于大肠杆菌的振 荡培养。
恒温振荡器
用于大肠杆菌的恒 温振荡培养。
03 实验步骤
细菌培养
01
02
03
培养基选择
选择适合大肠杆菌生长的 培养基，如LB培养基，以 保证细菌正常生长。
培养温度
将细菌培养在37℃恒温摇 床中，振荡培养至对数生 长期。
细菌密度
通过观察细菌的生长情况， 控制细菌密度，通常在 OD600值为0.6-0.8时进 行后续操作。
参考文献2
02
03
参考文献3
大肠杆菌感受态制备技术进展， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
大肠杆菌感受态制备实验指南， 作者：XXX，出版日期：XXXX 年X月，出版社：XXX出版社。
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实验原理
感受态
感受态是指细菌处于一种生理状态，能够接受外源DNA并与之结合， 进而发生转化。
转化过程
外源DNA通过细菌的细胞膜进入细胞内，并在DNA结合蛋白的作 用下与细菌染色体上的同源序列发生交换，从而实现基因的克隆和 表达。
影响因素
影响感受态形成的因素包括细菌生长状态、培养基成分、温度、渗透 压等。
转化子的筛选和验证
筛选方法
转化子可以通过抗生素筛选、蓝白斑筛选等方法进行 筛选。
验证方法
验证转化子是否含有目的基因，可以通过PCR、酶切、 测序等方法进行。
注意事项
在筛选和验证过程中，需要注意避免假阳性或假阴性 的结果，确保实验结果的准确性。
优化实验条件
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温度
感受态细胞的转化需要在一定的温度下进行，不 同的温度可能会影响转化效率，因此需要选择适 宜的温度进行实验。
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法
一种优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法一、本文概述随着生物技术的快速发展，大肠杆菌作为常用的基因工程受体菌，其感受态细胞的制备及转化方法对于基因克隆、表达以及基因功能研究等领域具有至关重要的意义。
传统的感受态细胞制备及转化方法往往存在转化效率低、细胞活性不稳定等问题，优化大肠杆菌感受态细胞的制备及转化方法成为当前研究的热点。
本文旨在介绍一种经过优化的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法，旨在提高转化效率，保证细胞活性，并简化操作步骤，为相关领域的研究提供更为可靠、高效的实验手段。
二、材料与方法1 大肠杆菌菌株：选用的大肠杆菌菌株应具备易于转化、生长迅速且遗传背景清晰的特性。
（1）从LB平板上挑取单菌落，接种至5ml LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床培养过夜。
（2）次日，按1:100的比例将菌液转接至新鲜的LB液体培养基中，继续培养至OD600达到4-6。
（3）将菌液冰浴10分钟，然后4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体。
（4）弃去上清液，用预冷的1M CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30分钟。
（5）再次4℃、4000rpm离心10分钟，收集菌体，并用预冷的含15%甘油的1M CaCl₂溶液重悬菌体。
（6）将感受态细胞分装至无菌的EP管中，每管50μl，液氮速冻后存于-80℃冰箱备用。
（2）向感受态细胞中加入适量的质粒DNA（或连接产物），轻轻混匀，冰浴30分钟。
（4）向EP管中加入500μl LB液体培养基，37℃、200rpm摇床复苏45分钟。
（5）将复苏后的菌液涂布于含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养箱倒置培养过夜。
为了提高转化效率，我们在传统的大肠杆菌感受态细胞制备及转化方法上进行了以下优化：（1）在菌液OD600达到4-6时进行感受态细胞的制备，此时菌体处于对数生长期，活性较高，有利于后续的转化。
（2）在制备感受态细胞时，使用预冷的1M CaCl₂溶液进行重悬，并在其中加入15%的甘油，以提高细胞的稳定性并防止冰晶形成。
长期保存活力低下的大肠杆菌制备感受态细胞条件的优化
长期保存活力低下的大肠杆菌制备感受态细胞条件的优化作者：晏国洪姜山来源：《江苏农业科学》2015年第05期摘要：研究了CaCl2，溶液处理方法、长期保存的原始菌种活化次数、离心条件对感受态细胞最终转化效率的影响，并分析其最佳转化效率参数、优化感受态制备和转化方法。
结果发现：使用过滤处理的GaCl2比灭菌处理的CaCl2制备的感受态细胞转化效率高。
在其他条件相同的情况下，长期保存的大肠杆菌菌种活化3次以上的转化率最高；制备感受态细胞第1次离心在4℃、4 000g条件下离心15min，第2次离心时在4℃、4000g条件下离心5min得到的感受态细胞转化率最高。
关键词：大肠杆菌；感受态细胞；转化率；优化中图分类号：Q813.1+1 文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2015）05-0046-03DH5α是一种常用于质粒克隆的菌种。
感受态细胞的制备和转化是分子生物学实验室频繁使用的一项重要的常规操作。
大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α在使用含NPTⅡ质粒载体转化时，可用卡那霉素鉴别重组菌株。
重组DNA转化细菌技术的关键是通过物理或者化学的方法，人工诱导细菌细胞成为敏感的感受态细胞，这种细胞易接受外源DNA，但由于转化是一个很复杂的过程，具体的作用机理尚不明确。
一些优良的大肠杆菌菌种价格较贵或获得途径较难，而实验室保存的大肠杆菌菌种一般时间较长（约5～10年），导致菌种部分死亡和活力降低，在实际操作中制得的感受态细胞转化效率常常不能满足试验的要求。
对于大肠杆菌而言，外源DNA导入主要有电穿孔转化法、MgCl2-DMSO法、Inoue法、CaCl2法等多种。
电穿孔转化法需要特殊的仪器设备，MgCl：-DMSO法和Inoue法操作比较复杂。
而CaCl2转化法操作相对简单、方便，而且成本非常低廉，已成为实验室进行基因克隆操作常用方法。
CaCl2法制备感受态细胞的关键因素有CaCl2溶液的质量、大肠杆菌DH50z生理状况、制备过程中的离心条件。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
板。
2、Amp母液：
称取氨苄青霉素100mg溶于1mlddH2O中，0.22μm滤 器过滤除菌，用EP管分装后储存于-20℃冰箱.
3、0.1mol/L CaCl2 溶液: 称0.56gCaCl2(无水分析纯),溶于50ml重蒸水中,定容至
0.1mol/L CaCl2是一种低渗溶液,在0℃冷冻处理大肠杆菌细胞 时,细胞膨胀成球形，DNA可吸附在其表面。在短暂的热冲击下，细胞 可吸收外源DNA。
摄入了外援DNA的细胞在丰富培养基内复制并增殖，表达外源基 因。带有选择标记基因的外源载体在受体细胞内表达时，受体细胞表 现标记基因的表型，使转化子与非转化子在选择培养基上区分开来。
（五） 次日（12-14小时后）观察和计算转化率 ：观察记录转化情况并统计 转化率。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计 算出转化子总数和转化频率，公式如下：
转化子总数＝该皿的菌落数×稀释倍数 （注：稀释倍数 = 涂布前总体积／涂板用菌液体积 ）
转化频率＝转化子总数／质粒DNA加入量(μg) （注：理想值可达5×106～ 2×107转化子/ μg DNA）
3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水 配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。
4. 防止杂菌和杂DNA的污染：严格来说，整个操作过程均应在无菌条件 下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所 有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛选、鉴定带来不必 要的麻烦。
100ml,用0.22μm滤器过滤除菌or高压灭菌。EP管分装于 0℃冰箱储存 .
BL21(DE3)pLysS感受态细胞使用说明
BL21(DE3)pLysS感受态细胞BL21(DE3)pLysS Chemically Competent CellBL21(DE3)pLysS感受态细胞基因型：F-omp T hsd S(r B-m B-) gal dcm(DE3)pLysS Cam rBL21(DE3)pLysS感受态细胞说明：BL21(DE3)pLysS菌株携带pLysS质粒，具有氯霉素抗性。
pLysS含有表达T7溶菌酶的基因，T7溶菌酶可以作用于大肠杆菌细胞壁上的肽聚糖溶解大肠杆菌，能够降低目的基因的背景表达水平，但不干扰IPTG诱导的表达，适合表达毒性蛋白和非毒性蛋白。
该菌株染色体整合了λ噬菌体DE3区(DE3区含有T7噬菌体RNA聚合酶)。
BL21(DE3)pLysS 感受态细胞由特殊工艺制作，pUC19质粒检测转化效率高达108 cfu/µg DNA。
BL21(DE3)pLysS感受态细胞操作方法：1.BL21(DE3)pLysS感受态细胞从-80℃拿出，迅速插入冰中，5分钟后待菌块融化，加入目的DNA（质粒或连接产物）并用手拨打EP管底轻轻混匀(避免用枪吸打)，冰中静置25分钟。
2.42℃水浴热激45秒，迅速放回冰上并静置2分钟，晃动会降低转化效率。
3.向离心管中加入700μl不含抗生素的无菌培养基 (2YT或LB)，混匀后37℃，200rpm复苏60分钟。
4.5000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含34 µg/ml氯霉素及所选质粒筛选抗生素的2YT或LB培养基上。
5.将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。
BL21(DE3)pLysS感受态细胞注意事项：1. 感受态细胞最好在冰中缓慢融化，插入冰中8分钟内加入目标DNA，不可在冰中放置时间过长，长时间存放会降低转化效率。
2. 混入质粒时应轻柔操作。
3. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。
4. 诱导时，IPTG浓度可选(0.1-2mM均可)。
新景生物 DH5α 感受态细胞 说明书
产品组成DH5α感受态细胞Cat.No.10支830101020支8301020DH5α感受态细胞100µl×10支100µl×20支Control DNA（pUC19，0.1ng/μl）10μl×1支20μl×1支说明书1份1份产品运输与储存1.感受态细胞必须用干冰运输，融化后的感受态细胞不能再冻结储存。
如果用户收到感受态细胞后发现泡沫箱中的干冰已经挥发殆尽，应予以拒收。
2.收到感受态细胞后应立即储存于-70℃或更低温度的冰箱中，在6个月内使用不影响转化效率；感受态细胞不可反复冻融，不要与限制性内切酶等经常使用的分子生物学试剂放在一起，避免因温度的波动而影响的效率。
技术支持杭州新景生物试剂开发有限公司研发部：，电话：400-0099-857。
产品介绍本公司生产的DH5α感受态细胞是采用大肠杆菌DH5α菌株经特殊工艺处理得到的感受态细胞，可用于DNA的化学转化。
经pUC19质粒检测，转化效率可达108cfu/μg。
每支感受态可以酌情分装使用，以降低实验的成本。
DH5α菌株介绍基因型：F-，φ80，lacZ△M15，△(lacZYA-argF)U169，endA1，recA1，hsdR17(rk-,mk+)，supE44，λ-，thi-1，gyrA96，relA1，phoA。
特点：本菌株是一种常用于质粒克隆的菌株。
其φ80、lacZ△M15基因的产物可与pUC载体编码的β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，用于蓝白斑筛选。
recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。
质量标准1.使用1ng pUC19Plasmid质粒DNA转化100µl Competent Cells DH5α测试，产生的菌落数＞1×108transformants/1µg pUC19Plasmid。
2.β-半乳糖苷酶、α-互补性的确认：对E.coli Competent Cells DH5α使用pUC19DNA进行转化后，在含有100µg/ml的Ampicillin、40µg/ml的X-Gal的L-琼脂平板培养基上，产生蓝色菌落。