组织工程皮肤研究进展_张君毅

国内第三军医大学最新的一项研究，通过组织 工程方法在体外重建毛囊，建立了毛囊器官培养模 型。在胶原凝胶中利用毛囊真皮细胞首次在体外培 养条件下诱导了毛囊上段角质形成细胞，形成了毛 囊 结 构 。 在 此 基 础 上 ， 将 胶 原 、硫 酸 软 骨 素 、壳 多 糖 等及成纤维细胞按比例分布混合在一起，形成真皮 替代物，再接种表皮细胞，生产出了组织工程化人 工皮肤。这种人工皮肤在组织学和功能上接近天然 皮肤，具有分化良好的表皮层和真皮层，力学性能 较好，有一定弹性，可随意剪切和缝合。更为重要的 是它是目前唯一具有主动抗感染作用的组织工程 产品。通过在兔、裸鼠的动物移植试验，表明人工皮 肤移植后能很好地与动物皮肤融合，人工真皮内新 生血管明显，表皮分化良好，真表皮间结合良好［１９］。
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外科医院
干细胞， 或者按一定的程序分化， 形成新的功能细 胞， 从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。 目前研究较多的干细胞除 ＥＳＣ 外， 还有 ＡＳＣ 如造血 干细胞（ ＨＳＣ） ， 骨髓间充质干细胞（ ＭＳＣ） ， 神经干细胞 （ ＮＳＣ） ， 皮肤干细胞， 肌肉干细胞， 成骨干细胞， 内胚 层干细胞和视网膜干细胞等。从分化潜能看， ＥＳＣ 是最具有临床应用前景的种子细胞， 但目前仍存在 材料来源困难， 体外培养 ＥＳＣ 生长缓慢， 分化机制不 清 等 问 题 并 且 定 向 诱 导 还 存 在 许 多 技 术 问 题 。 ＥＳＣ 来源的移植材料用于临床还存在免疫排斥问题， 甚 至有发生肿瘤的隐患。与 ＥＳＣ 相比，ＡＳＣ 具有离成熟 细胞距离较近、来源丰富、可塑性强及具有多向分化 潜能等特点， 最大特色是可实现个体化治疗， 无免 疫排斥问题， 在临床应用方面显示出真正的希望。
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整形再造外科杂志 ２００５ 年 ９ 月第 ２ 卷第 ３ 期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００５，Ｖｏｌ ２，Ｎｏ．３
·综述·
组织工程皮肤研究进展
张君毅 王春梅
中图分类号： Ｒ３１８．５ 文献标识码： Ｂ 文章编号： １６７２－４６１５（２００５）０３－１７６－０４
目前组织工程皮肤研究的热点问题主要是： ① 皮肤种子细胞的分离与体外培养。②表皮组织和支 持基质。③真皮组织和支架材料。④复合人工皮肤。 ⑤临床应用所面临的问题。
１ 皮肤种子细胞
干细胞是机体内存在的一类特殊细胞， 它们显 著的生物学特性即自我更新能力和多向分化的潜 能促使他们成为皮肤种子细胞的首选。干细胞按其 发育阶段可分为胚胎干细胞 （ＥＳＣ） 和成体干细胞 （ ＡＳＣ） 。当受精卵分裂发育成囊胚时， 内层细胞团的 细胞即为 ＥＳＣ。胚胎发育早期阶段， ＥＳＣ 可分化为各 种类型的体细胞甚至可独立地产生完整的机体； 当 胚胎发育至胚囊期， ＥＳＣ 虽不能形成完整的 个 体 但 却有发育的多能性即有分化为成体中所有类型体 细胞的潜能。ＡＳＣ 存在于成人的多种组织中， 具有向 一种或几种类型的成熟细胞分化的潜能， 即具有多 能性或专能性。在特定条件下， ＡＳＣ 或者产生新的
皮肤干细胞是目前引起广泛关注的一类成体干 细胞， 它的分离对于皮肤损伤修复具有重要意义。 ７０ 年代中期就已经能够进行自体皮的培养和移植， 目前结合各种生物材料，利用皮肤干细胞的增殖特 性制备人工皮成为皮肤干细胞的主要研究方向。在 皮肤皮脂腺开口处与立毛肌毛囊附着处之间的毛囊 外根鞘处含有丰富的干细胞。干细胞在表皮基底层 呈片状分布，在没有毛发的部位（手掌等）， 表皮干细 胞位于与真皮乳头顶部相连的基底层，其它有毛发 的皮肤表皮干细胞则位于表皮脚处的基底层。表皮 基底层中有 １％～１０％的基底细胞为干细胞， 随着年 龄的增大，表皮干细胞的数量也随之减少［４］。正常情 况下，大部分的表皮干细胞处于静息状态，只有部分 干细胞脱离干细胞群落进入分化周期，维持皮肤的 更新。表皮干细胞的细胞周期可达两年之久，连续 传代可进行 １４０ 次分裂， 能产生 １×１０４０ 个子代细 胞。培养的表皮中含有干细胞，可用于自体和异体移 植治疗重度烧伤、慢性溃疡等。从发生机制来看，干 细胞所处的微环境对干细胞分化调控的影响极为重 要，干细胞分化依赖于一组相邻细胞相互作用的总 合，细胞处于一种三维空间结构中，接受三维分化信 号 。 干 细 胞 的 分 化 受 细 胞 与 细 胞 、细 胞 与 细 胞 外 基 质间相互作用的影响，甚至连机械作用力也可以影
５ 临床应用上所面临的问题
现有的几种组织工程化皮肤虽然在治疗烧伤 及慢性溃疡上取得了长足进步，但无论在功能上还 是在外形上仍有待进一步改善。目前此领域的研究 方向是： ①最适于细胞生长基质的选择与开发； ② 生长因子基因转染表皮细胞，以缩短表皮细胞培养 时间，提高创面修复质量； ③表皮细胞与基质的相 互 作 用 ； ④同 种 异 体 成 纤 维 细 胞 、表 皮 角 朊 细 胞 的 应 用 与 转 归 ； ⑤将 黑 色 素 细 胞 、朗 格 罕 氏 细 胞 引 入 皮肤构建等［２０］。⑥组织工程化组织的移植与自体组 织移植一样，植入体内后同样存在一个血运重建的 过程，小块的移植组织由于可以尽快建立血液供应 而获得成活，而大块的移植组织如果不能尽快建立
表 １ 真皮替代物制作方法及分类
方法
支架成分
种子细胞
方法 １
胶原 壳聚糖 糖胺细胞
Ｎｅｌｌ法［１２］
方法 ３ 胶原 聚乳酸 － 聚羟基乙酸共聚物（ＰＬＧＡ）
方法 ４
胶原 硫酸软骨素 硅胶膜
Ｙａｎｎｓ法［１３］
方法 ５
异种（猪） 异体脱细胞真皮 基质
Ｇｒｉｌ－Ｍｃｋ法［１４］
３ 真皮组织和支架材料
真 皮 替 代 物 的 研 究 是 随 着 ＣＥＡ 的 发 展 而 不 断 引起人们关注。研究证实真皮组织能增强移植皮的 韧性， 抑制肉芽组织生长和瘢痕形成， 降低创面挛 缩程度， 由此可见真皮组织在皮肤移植中的重要 性， 所以在组织工程化皮肤领域，有关真皮替代物 的研究最多，取得的成果也最显著。
４ 复合人工皮肤
理想的组织工程化皮肤应包含表皮与真皮 ２
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整形再造外科杂志 ２００５ 年 ９ 月第 ２ 卷第 ３ 期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００５，Ｖｏｌ ２，Ｎｏ．３
层，因为无论在解剖上还是在功能上两者都是相互 依存的整体。在上述真皮替代物上接种角质细胞， 经过培养后形成人工复合皮肤［１７］。１９８１ 年，Ｂｅｌｌ 等 培养、扩增的 ＳＤ 大鼠成纤维细胞融铸于胶原网格 中， 胶原收缩后成为一种真皮类似物，５～７ 天后再 在其表面种入未经培养的自体表皮细胞，这种人工 复合皮肤被固定在供体鼠背部的开放创面上。表皮 细胞植入后第 ４ 天，就可观察到胶原网格被表皮细 胞部分覆盖，５ 周后可见多层分化的表皮细胞覆盖 创 面 并 且 具 有 规 整 、光 滑 的 基 底 层 ； 移 植 后 １ 周 就 有血管长入真皮层，７ 周时血管形成情况与周围组 织无明显差别； 术后 ５０ 天，８０％的移植物仍保持原 来的大小和形状。这种人工皮肤类似物应该是第一 种真正意义上的复合皮替代物［１８］。
真皮替代物是含有活细胞（体外接种成纤维细 胞培养） 或不含细胞成分的支架结构，用来诱导成 纤 维 细 胞 的 迁 移 、增 殖 和 分 泌 细 胞 外 基 质 ， 它 的 基 础就是二倍体成纤维细胞的培养。理想的真皮支架
材料应具备的条件： ①较好的生物可降解性； ②较 好的生物相溶性； ③材料本身及其降解物都应无毒； ④具有三维结构，利于细胞生长和粘附； ⑤多孔率， 以提供细胞间基质生长的空间； ⑥可塑性，便于加工 裁剪。⑦有一定的机械强度。真皮支架研究有天然物 和人工合成二种， 前者如胶原、明胶和硫酸软骨素 等，这类材料的优点是本身就有许多生物信息，能够 使细胞产生并维持各种功能， 缺点是在大规模生产 过程中难以控制质量， 性能变化与结构变化不成比 例。后者如聚乳酸、聚四氟乙烯和羟基磷灰石等，这 类材料的优点是可以精确控制其分子量、降解时间 等性能， 缺点是不能与细胞发挥理想的相互作用［１１］。 真皮替代物主要制作方法分类见表 １。
尽管 ＣＥＡ 技术是大面积烧伤治疗的一大进步， 但经过长期的临床观察，单纯 ＣＥＡ 移植技术存在一 些缺点， 如耗时长，从取材到培养成完整的膜片需 ３～４ 周； 细胞膜片菲薄易碎，难以操作； 移植到创面 后，接受率低，极易造成移植物脱失； 即使在上皮化 后，新生表皮不耐摩擦，容易发生水泡，造成残余创 面 ， ［１０］ 而 且 创 面 愈 合 后 仍 会 出 现 瘢 痕 增 生 严 重，抗 感染能力差，弹性欠佳，柔软度不足等，因而这种方 法在临床的应用受到了很大限制。为了克服上述缺 点，我们今后需继续寻找一种既能支持表皮细胞生 长，又便于 操 作 的 基 质，如 胶 原 、硫 酸 软 骨 素 、透 明 质酸膜、纤维蛋白胶以及脱细胞真皮基质等。
整形再造外科杂志 ２００５ 年 ９ 月第 ２ 卷第 ３ 期 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｓｔｉｃ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２００５，Ｖｏｌ ２，Ｎｏ．３
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响 干 细 胞 的 分 化 进 程［５］。 多 种 相 关 细 胞 因 子 或 天 然 物 质 、异 体 或 异 种 皮 肤 覆 盖 等 可 刺 激 创 面 周 围 及 底 部 残 存 的 表 皮 干 细 胞 增 殖 、分 化 、移 行 ， 可 促 进 受 损 部位皮肤干细胞的再生和分化［６］。
２ 表皮组织和支持基质
１９７５ 年，Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ 和 Ｇｒｅｅｎ 以 ３Ｔ３ 细 胞 作 为 滋养层连续培养人类表皮角阮细胞获得成功， Ｇｒｅｅｎ 随即提出构想：培养的表皮细胞融合成片后 可用于修复自体皮肤缺损［７， ８］。１９８１ 年，Ｏ′Ｃｏｎｎｏｒ 等首次应用此方法在体外培养出适于移植的人自 体 表 皮 细 胞 膜 片 （ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ａｕｔｏ－ ｇｒａｆｔ，ＣＥＡ），在 ２ 例 烧 伤 后 的 肉 芽 创 面 上，培 养 的 表皮细胞膜片附着良好，４ 年后移植的上皮仍可见 到［９］。ＣＥＡ 技术在随后的十几年中不断得到改进，在 处理大面积烧伤患者时仍是被全世界所认可的治 疗方案之一。