农杆菌介导玉米遗传转化影响因子的研究

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农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立

农杆菌介导的玉米遗传转化及再生体系的建立摘要:为了建立玉米高频再生及高效遗传转化体系，本研究选用玉米自交系178，昌72，郑58，H736760A，MQ704，2193为材料，对影响玉米成熟胚愈伤组织诱导、继代培养及分化的因素进行了研究。

结果表明：高浓度的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）（4.0mg/L）是诱导愈伤组织必须的；在继代培养基中添加适量的2,4-D（2.0mg/L）、6-苄基嘌呤（6-BA）(0.2mg/L)和硝酸银（AgNO3）（10mg/L）能显著增加胚性愈伤组织的形成；在分化培养基中添加0.5mg/L 6-BA有利于提高愈伤组织的分化频率。

这个体系的建立，为以成熟胚为受体系统的遗传转化体系奠定了基础。

关键词:玉米；成熟胚；愈伤组织；转化；植株再生Establishment of transformation system and regeneration system of maize mediated by Agrobacterium tumefaciens Abstract: In order to establish the system of high-frequency regeneration and high-efficiency genetic transformation in maize, the inbred line 178, Chang72, Zheng58, H736760A, MQ704, 2193 have been chosen to study on initiation, maintenance and differentiation of calli in this paper. The results showed that inclusion higher concentration of 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(2,4-D, 4.0 mg/L) into induction medium was a critical factor for producing primary calli. Supplement with optimal level of 2,4-D(2.0 mg/L), 6-Benzylaminopurine(6-BA, 0.2 mg/L)and silver nitrate(10 mg/L)in the subculture medium significantly promoted the formation of embryogenic calli. And the addition 0.5 mg/L of 6-BA into regeneration medium has significantly increased the frequency of plant regeneration. This efficient regeneration system provides a solid basis for genetic transformation of maize.Key words: Maize; Mature embryo; Calli; Transformation; Plant regeneration摘要ABSTRACT目录1序言 (4)2玉米再生及基因转化体系的研究 (4)2.1玉米再生体系的发展历程 (4)2.2玉米再生及基因转化体系的材料选择 (4)2.3玉米再生体系的影响因素 (4)2.4玉米遗传转化的发展过程 (5)2.5玉米遗传转化方法 (6)2.5.1 电激法 (6)2.5.2 花粉管通道法 (7)2.5.3 PEG法 (7)2.5.4 基因枪法 (7)2.5.5农杆菌介导法 (8)2.6玉米再生及遗传转化的常用受体 (9)2.6.1愈伤组织再生系统 (9)2.6.2原生质体再生系统 (9)2.6.3种质系统 (9)2.6.4直接分化再生系统 (9)2.7本实验研究内容 (10)3玉米成熟胚再生体系的建立 (11)3.1材料与方法 (11)3.1.1 材料 (11)3.1.2实验方法 (11)3.1.2.1 外植体的选择与预培养 (11)3.1.2.2愈伤组织的诱导 (11)3.1.2.2 胚性愈伤组织的形成及愈伤组织的继代 (12)3.2结果与分析 (12)3.2.1玉米种子的预培养 (12)3.2.2愈伤组织的诱导 (13)3.2.3 胚性愈伤组织的形成 (15)3.2.4 AgNO3对胚性愈伤组织形成的影响 (15)3.2.5愈伤组织的分化 (15)3.3 结论与讨论 (16)4 农杆菌介导的玉米转化体系的建立 (18)4.1材料与方法 (18)4.1.1 材料 (18)4.1.2 培养基配制 (18)4.1.3转化方法 (19)4.1.3.1 侵染液的准备 (19)4.1.3.2 侵染 (19)4.1.3.3 抗性愈伤的筛选 (19)4.2 结果与分析 (19)5 参考文献 (22)6致谢 (24)附录 (25)1序言玉米是早熟禾科(Poaceae)玉蜀黍族(Maydeae)一年生谷类植物，学名Zea mays，起源于北、中、南美洲。

农杆菌介导的玉米转基因研究进展

（．１山东农业大学农学院，泰安２１１；．山东７０８２山东省枣庄市农业科学院，ｅ枣庄２７０）ｔ，ｈ７３０
摘要从转基因技术、菌介导的受体以及影响农杆菌转化的因素和玉米转基因的现状等方面，农杆综述了在玉米中农杆菌介导转基因
ｅｉｉｎｙ．ｆｃｅｃ
ＫｙｗｏｄＭａ（ｅａｓＬ；ｅｅｔｎｆｒｉ；ＡｒｂｃｒｍｔｆｉｓｅｒｓｉＺａｍｙ）Ｇｎｒｓｎｏｅｚａｏ￣ｔｎｇｏａｔｉｕａｅｅｕｍｅｎｃ
转基因作物指将一种或几种植物、物乃至人类的基因动导入某种作物，其基因重新组合，强其抗逆性、病虫使增抗
维普资讯
安徽农业科学。ｏｒａｆｎｌｇ．Ｓｉ２０。４１）４４５８Ｊｕｎｌｈｉｉｃ．０６３（８：５６—４４ｏＡｌＡ
责任编辑
刘月娟
责任校对
刘月娟
农杆菌介导的玉米转基因研究进展
王秀芹，希桂２曲２高王洪刚刘，建平，建强，
质体中，开创了玉米遗传转化研究的先河。Ｒｏｅ等用电激ｈｄｓ
法把Ｎｔ基因转入玉米原生质体中，ｐＩＩ经过抗性筛选、分化再生得到抗Ｋｍ的转基因植株。Ｆｏｍ、ｏｏ．ｍｒｍＧｒｎａｍ等利用基ｄｋ
根癌农杆菌转化系统具有许多优点：成功率高，效果好，外源基因整合位点较稳定，且大多数是单位点整合；显性表达率较高，共抑制现象相对较少；遗传稳定性好，大多符合孟

农杆菌介导玉米愈伤遗传转化研究

ＷＡＮＧｏｇ．ｅ，ＬＩＨｎｗｉＡＮＧ－ｏｎ，ＳＩＺｈｅｓｅ，ＺＨＡＮＧＹｅｈｇＨｎ．ｈｎｇＳｈｉｈｕａｇ，ＧｅＹｕｎ－ｉ－ｎｘａ
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研究报告
・
王宏伟等：农杆菌介导玉米愈伤遗传转化研究
研究报告・
农杆菌介导玉米愈伤遗传转化研究
王宏伟梁业红史振声张世煌葛云侠，，，，
（．阳农业大学特种玉米研究所，沈阳１０６；２中国农业科学院作物科学研究所，北京１０８）１沈１８６．００１
本试验以国内高再生频率的优良玉米自交系Ｒ１－９和齐３９的胚性愈伤组织为受体，农杆菌８５９１对介导玉米胚性愈伤组织遗传转化的部分影响因素进行
受体，立不受基因型限制快速、建高效的遗传转化体系
材料为自交系Ｒ１ —９８５９和齐３９由本实验室提１，

农杆菌介导的玉米遗传转化研究进展

ｉｍｍａｒｍｂｒｏｓａｉｓｅｔｒｅｓｈａｅｏｏｔｎ，ｆｔｒｏｅｎｅｓｌｃｉｅｓａｄｍｅｈｄｓｏｂａｎｕｔｅｅｙｓｔｓｕａｇｔｓｂｃｍｅｒｕｉｅｕｒｈｅｍｒ，ｗｅｅｔｏｎｇｎｅｎｔｏｆｏｔｉ —
ｏｍａｚ．ｗ，ｈｉａｉｎｏｔｅＡｇｏａｔｒｍ— ｄａｅａｓｏａｉｎｓｓｅｆｒｆｉｅＮｏｔｅｓｔｔｆｈｒｂｃｅｉｍｅｉｔｄｔｎｆｒｔｙｔｍｏｄｉｅｇｎｔｐｓｔｕｏｕｒｍｏｍｏｅｍａｚｅｏｙｅｈｗｉ
ｌｍｓｈｖｅｂｅｎａｙｅｏｄｆｅｅａｔｒｎＡｇｏａｔｒｕｔｓｕｅｔｒｅｓａｄｃｌｒｏｄｉｏｓａｈｉｅａｅｎａｌｚｄｆｍｉｒｎｔｆｃｏｓｉｒｂｃｅｉｍ，ｉｓａｇｔｎｕｔｅｃｎｔｎ，ｎｄｔｅｆ－ｒｕｉ
ＰｏｒｓｆｇｏｕｍｅｉｔｄＧｅｅｉａｓｏｍａｉｎｉａｚｒｇｅｓＡｒｂｃｅｉｍ— ｄａｅｎｔｃＴｒｎｆｒｔｏＭｉｅｏａｔｒｎ
ＤｅｇＸｉｎｇｎｎａｙａｇ
Ｉｔｕｔｆｕｔｏｃｌｒｕｔｒ，ｈｉｅｅＡｃｄｍｙｏＳｉｎｅ，ａｓａ４１２ｎｓｉｅｏＳｂｒｐｉａｉｌｅｔｅＣｈｎｓａｅｆｃｅｃｓＣｈｎｇｈ，０１５ｔＡｇｃｕ
ｓｅｎｄｃｍｂｉｉｔｗｉｆｃｅｔＡｇｏａｔｒｕｍｅａｅｒｎｆｒｔｏｓｓｅｉｒｅｏｏｔｉｔａｇｎｃｕ，ａｏｎｎｇｉｔｅｈｉｉｎｒｂｃｅｉｍ— ｄｉｔｄｔａｓｏｍａｉｎｙｔｍｎｏｄｒｔｂａｎｒｎｓｅｉ

农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展

已步入了商品化生产的领域。
枪微弹穿透的组织都可以作为转化的受体，玉米是
目前遗传转化的主要方法。受体组织的类型对基因枪的转化也有一定的影响，具有潜在分化能力的细
１玉米的转基因育种技术
１１根癌农杆菌介导法．
因导入玉米中，且，山梨糖醇和甘露醇处理过的而经
农杆菌介导法是转基因技术中经常采用的一种手段。农杆菌在双子叶植物上的遗传转化方法已经十分完善，由于单子叶植物不是农杆菌的天然宿主，在单子叶植物上的遗传转化研究落后于双子叶植物。ＧＲＭＳＹ等首次以玉米为材料，农杆菌将ＩＬ用玉米条纹病毒（Ｖ）ｃＮＡ导入玉米植株中，ＭＳ的Ｄ使
现代化农业
２１年第７期（第３４期）０１总８
１５
农杆菌介导玉米遗传转化的研究进展
关红颖
（河市农业技术推广中心，讷黑龙江讷河１１０）６３０
植物遗传转化是指以植物器官、织、组细胞或原生质体作为受体，过某种技术或途径转入外源基通因，获得使外源基因稳定表达的可育植株。玉米作为最重要的粮食作物之一，也是现代食品工业、医药
农杆菌介导法具有简单易行，不需昂贵的设备，

农杆菌介导法在玉米遗传转化中的应用

６９．６４８．６
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２５．５
２６．３
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２５．６
６３．２４７．２
１９３４５
抗除草剂的转基因玉米已率先应用于玉米的商品化生产。农杆菌介导的遗传转化由于具有独特的优点，一直受到
育种家、分子生物学家和微生物学家的重视。介绍了农杆菌介导的玉米遗传转化的技术要点及影响转化的主要因
收稿日期：２０１３－０７ — １５
ｌ＿ ● ００● ０ ● Ｊ０● ０● ） ●Ｏｑ５ ● 一） ● ● ００● ０ ● ｌ．０Ｏ●，）０ ● Ｉ０◆ ０● ＯＯ● ００ ● Ｏ、 ● ｌｌ０● ＯＯ◆ ０ ● ∞ｆ● ００ ●０ｒ ● ＯＯ◆ ，）（ ● Ⅲ ００● （ｍ ●㈡００ ●ｆ１） ● 、 ¨ ００● Ｊ ● ●０ ● ）０ ● ● （、 ● ，０● 、 ●
素，并对玉米遗传转化技术发展现状和未来趋势做了讨论。关键词：玉米；农杆菌；遗传转化
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玉米作为最重要的粮食作物之一，也是现代食品工业、医药工业和化学工业的重要原料，它的遗传转化研究一直受到各国科学家的重视。到目前为止，己建立了多种外源基因导入玉米受体细胞的遗传转化方法。由于农杆菌作为自然界中存在的天然基因工程载体，具有操作简便、费用低廉、可插入外源基因片段大、一次转化能产生较大可能的单拷贝基因等优点，所以农杆菌介导转化单子叶植物尤其是重要粮食作物的研究一贯受到世界各国科研工作者的重视。玉米作为世界第三大粮食作物和重要的饲料作物，农杆菌介导的遗传

农杆菌介导的作物遗传转化研究进展

ｖｌｐｍｅｔｏｆｃｏｐｔａｆｒｔｏｎｈｅｐｒｓｃｆｔａｇｅｃａｌｃｔｏｒｅｉｗｅ．ｅｏｎｒｒｎｓｏｍａｉｎａｄｔｏｐｅｔｏｒｎｓｎｉｐｐｉａｉｎｗｅｅｒｖｅｄ
展对改善作物的逆境胁迫耐受性和增加作物产量具有非常重要的意义。农杆菌介导的遗传转化在植物
转基因研究中具有重要的应用价值，为此，对其相关
研究进展进行综述。
忍受的范围，就构成了作物生长的“ 境 ” 逆。逆境包
Ａｇｏａｔｒｕｍｅｉｔｄｍｏｅｕａｅｈｎｓ，ｈｐｌａｉｎｏｒｎｇｎｃｍａｋｒｇｎｓｔｅｄ — ｒｂｃｅｉｍ— ｄａｅｌｃｌｒｍｃａｉｍｔｅａｐｉｔｏｆｔａｓｅｉｃｒｅｅｅ，ｈｅ
括病虫害等生物胁迫和低温、干旱、高盐等非生物胁
迫，使植物受到伤害甚至死亡，致严重影响了作物的产量和品质。随着人们生活水平的提高，靠传统仅育种已难以在作物产量和品质方面满足人们的需求，提高作物的产量和品质，物和非生物胁迫信为生号传导中相关基因的研究以及品质基因和转基因研
的分子机制、记基因的应用、物转化研究进展和转基因应用前景。标作
关键词：作物；农杆菌；传转化；标记基因；转基因遗中图分类号：８Ｑ７文献标识码：Ａ文章编号：１０３６（０１１ —００一Ｏ０４— ２８２１）００６４

农杆菌介导bar基因转化玉米幼胚的研究

摘
要：通过农杆菌介导法，采用抗除草荆基因（ａ）ｂｒ转化３个玉米自交系的幼胚，并对遗传转化影响因素进
行优化。结果表明，２４Ｄ浓度为２ｍ・时，胚性愈伤组织诱导率较高；农杆菌最佳的侵染时间为２ｆ，－ｇＬ０ｍｉ；乙ｉ酶丁香酮（ｓ明显提高了幼胚的ＧＳ瞬时表达频率，适宜浓度为２０Ａ）Ｕ０ｍｏ・ｌＬ；温和选择方法适于幼胚转化，不定芽诱导培养基、芽伸长培养基和生根培养基中潮霉素的浓度分别为８、２ｍｇＬ、６・－；获得７株ＰＲ检测以及除Ｃ
以草丁膦（效成分为ＰＴ）为筛选剂，以自有Ｐ作
交系Ｍｏ７的未转化胚性愈伤组织为试验材料。在１胚性愈伤上添加０、４、２、８０２ｍ・不同、１、１ｇＬ
ｃｌｓｆｒｔｇｒｔａｌｏｍａｉａｏｕｎｉ
１２方法．１．胚性愈伤组织的诱导．１２
西哥甜玉米等模式自交系及其衍生系的幼胚作外植体诱导产生转基因受体系统的技术已较成熟。但是，这些技术用于生产中大面积应用的优良玉米自交系时，诱导产生受体系统的效率较低，往往难以为转基因操作提供足够的受体材料。因此优化各种影响转化因素，提高骨干玉米自交系的转化效率是该技术的迫切要求。本研究以黑龙江省部分玉米自交系为材料，通过对培养基、培养条件的改进，旨在建立高效农杆菌介导的玉米幼胚转ｂｒ因体系，并获得具ａ基有除草剂抗性的植株，为玉米遗传转化研究和培育玉米新品种打下基础。

农杆菌介导主要农作物遗传转化的研究进展

籼稻品种分别以５０ｍｇ／ＬＨｙｇ、３０ｍｇ／ＬＢａｓｔａ和还可能会使原有物种的正常繁衍生息受到一定程
关键词：主要农作物；农杆菌；遗传转化；应用
中图分类号：
文献标识码：
禾本科是种子植物中最有经济价值的植物，其中的水稻、玉米、小麦等是粮食和饲料的主要来源。随着人口和经济过度增长带来的耕地面积减少以及资源匾乏等问题，使得人们对粮食产量和品质提出了更高要求。近年来，利用转基因技术，将外源有用的基因转化到禾本科植物的基因工程研究不仅为农业生产提供了更快、更直接的改善方法，也为引进有用的农艺性状提供了机会。
第４期
李浩戈等：农杆菌介导主要农作物遗传转化的研究进展
化有影响。周艳玲等比较了潮霉素（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ，的主要粮食来源，因此关于转基因水稻的食品安
Ｈｙｇ）和草丁膦（Ｂａｓｔａ）的筛选效果，发现在粳稻和全问题不容忽视；转基因水稻释放到生态系统中，
农杆菌介导法是以农杆菌为媒介，实现外源基因向植物基因组的转移与整合的转基因技术。植物受伤后产生的酚类化合物作为一种信号分子激活农杆菌的ＤＮＡ转移系统，农杆菌聚集接近植物伤口部位细胞，Ｔ—ＤＮＡ转移至植物细胞并整合到植物基因组中后，其编码的基因在细胞中表达。由于单子叶植物并不是农杆菌的天然寄主，该方法起初只用于双子叶植物中，近十几年来在单子叶植物中也得到了广泛应用，目前在水稻、玉米、小麦这３大重要粮食作物上取得了长足的发展 … 。本文主要介绍了农杆菌介导水稻、玉米、小麦遗传转化的影响因素、应用及发展趋势。

农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究

农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究植物遗传转化技术是一项广泛应用于作物改良和生物制药领域的重要技术手段。

其中农杆菌介导的植物遗传转化技术是目前最为常用和成熟的一种转化方法。

本文将对农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进行介绍和探讨。

一、农杆菌介导的植物遗传转化技术原理农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）是一种土壤杆菌，是一种天然的植物病原菌。

它通过菌体上存在的Ti质粒（tumor-inducing plasmid）和T-DNA（transfer DNA）片段，将外源DNA片段导入植物细胞并整合到植物基因组中，导致细胞核内出现转化的植物细胞。

因此，农杆菌介导的植物遗传转化技术也被称为农杆菌转化。

农杆菌介导的植物遗传转化技术包括以下几个步骤：农杆菌感染植物细胞、T-DNA整合进入植物细胞、T-DNA片段内的外源DNA导入植物细胞基因组、以及转化细胞的筛选和检测等。

其中，农杆菌感染植物细胞是整个转化过程的关键步骤，需要通过构建合适的载体和适当的农杆菌菌株，使其能够有效地感染到目标植物细胞。

二、农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究进展农杆菌介导的植物遗传转化技术已经被广泛应用于许多作物品种的改良和基因功能研究中。

例如，利用农杆菌转化技术可将外源基因导入烟草、玉米、水稻、小麦、大豆等许多重要的作物中，实现对它们特性的改良。

在农杆菌介导的植物遗传转化技术的研究和应用中，也出现了许多问题。

其中，影响转化效率的因素包括转化载体、农杆菌菌株、植物品种、转化条件等。

此外，还存在着难以破解的难题，例如植物细胞壁难以透过、转化后细胞的不稳定性、外源基因的稳定性等。

为了提高转化效率和成功率，许多研究者着眼于改进农杆菌转化系统，包括构建新的载体、筛选适合的农杆菌菌株、研究植物细胞壁和农杆菌感染机制等。

一些新型转化技术，例如粒子轰击法、激光微加工技术和等离子膜处理技术等，也被尝试用于植物遗传转化中，但它们还需要进一步的研究和优化。

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化研究

农杆菌介导玉米幼胚遗传转化研究农杆菌介导玉米幼胚遗传转化研究引言：玉米（Zea mays L.）是世界上最重要的粮食作物之一，其重要性在于其广泛的应用领域，包括食品、饲料、能源以及生物基材料等。

基因转化技术成为改良玉米品种的重要手段。

农杆菌介导的遗传转化技术由于其高效、简单、可靠的特点，被广泛应用于各种作物的基因转化研究。

本文旨在描述农杆菌介导玉米幼胚遗传转化的研究现状及其潜在应用。

一、农杆菌介导玉米幼胚遗传转化的基本原理农杆菌介导玉米幼胚遗传转化是指利用农杆菌将外源基因导入玉米幼胚细胞中，使其发生遗传转化。

这一过程主要包括以下几个步骤：构建适用的农杆菌体系、准备合适的损伤玉米幼胚组织、诱导与培养愈伤组织、耐受农杆菌受体细胞的培养和再生分化。

农杆菌体系通过构建载体，将目标基因插入农杆菌哨兵携带的遗传元件中，形成有效的农杆菌介导系统。

损伤玉米幼胚组织可通过早孕胚、花药、愈伤组织等方式进行，以提高外源基因导入率。

通过合适的培养条件和培养基，诱导愈伤组织形成并使其生长和分化，最终获得幼胚细胞。

利用耐受农杆菌的受体细胞进行培养和再生分化，使外源基因导入成功。

二、农杆菌介导玉米幼胚遗传转化的优势与其他遗传转化技术相比，农杆菌介导的遗传转化技术在玉米幼胚中具有较高的转化效率和稳定性。

农杆菌具有广泛的宿主范围和高效的遗传转移能力，可以在短时间内实现外源基因的整合。

此外，农杆菌也能帮助玉米幼胚细胞在无菌条件下生长和分化，从而提高转化率。

因此，农杆菌介导玉米幼胚遗传转化技术成为玉米遗传改良的重要工具。

三、玉米基因转化的应用前景农杆菌介导玉米幼胚遗传转化技术为玉米品种的改良和功能基因的研究提供了有效手段。

通过此技术，可以实现对玉米产量、抗病虫性、耐逆性等性状的改良，从而提高玉米的农业生产力。

此外，农杆菌介导玉米幼胚遗传转化技术还可用于功能基因的研究，例如对玉米加工性状的研究、抗逆性基因的分析等。

这些研究将为玉米种植和利用提供基础支持，推动玉米产业的发展。

农杆菌介导玉米转基因的研究

农杆菌介导玉米转基因的研究摘要：转基因技术在玉米育种中运用很广泛，本文主要通过查阅文献，结合专业所学知识，从转基因技术、农杆菌介导的受体以及影响农杆菌转化的因素和玉米转基因的现状等方面，综述了在玉米中农杆菌介导转基因的研究进展。

关键词：玉米，转基因，农杆菌介导法，育种转基因作物指将一种或几种植物、动物乃至人类的基因导人某种作物，使其基因重新组合，增强其抗逆性、抗病虫害、抗杂草等优良性状。

转基因玉米的研究与开发已取得了显著进展。

许多外源基因已经被导入玉米，以改良玉米的某些性状，并取得了很好的成效。

２０世纪８０年代后期，一些研究者尝试用根癌农杆菌接种玉米幼苗。

采用病毒感染以及外源DNA与花粉混合授粉等方法，试图将外源DNA导入到玉米中，虽得到一些转化表现，但均未得到分子生物学证据。

Fromm 等用电激法把抗除草剂基因Pat转入玉米原生质体中，开创了玉米遗传转化研究的先河。

Rhodes等用电激法把NptII基因转入玉米原生质体中，经过抗性筛选、分化再生得到抗Km的转基因植株。

Fromm、Gordon－Kamm等利用基因枪轰击原生质体获得可育的玉米转基因植株。

农杆菌介导法是转基因技术中经常采用的一种手段。

根癌农杆菌是许多双子叶植物肿瘤病的病原菌，它含有Ti质粒，其中的T-DNA能够转移到植物基因组上。

农杆菌在双子叶植物中的转化已经十分完善，但是由于玉米等单子叶植物不是其天然的寄主，所以转化工程比较困难。

但最近几年的研究表明农杆菌可以介导玉米上的基因转化。

1.常用玉米转基因的方法在现代育种技术中，常用的转基因方法往往结合使用，以提高转基因的效果。

明小天等通过基因枪提高了根癌农杆菌转化水稻的转化效率蚓。

花粉管通道法既可以用普通的质粒，也可用农杆菌Ti质粒。

另外，还有PEG介导法、超声波法、子房注射法、阳离子转化法和电击法等。

1.1 基因枪法1989年Klein第1次使用基因枪介导法转化玉米。

Philippe等用山梨糖醇和甘露醇处理A188XB73的胚性悬浮细胞，用基因枪把GUS基因导入玉米，结果表明经山梨糖醇和甘露醇处理过的细胞转化频率提高2.7-6.8倍。

抗真菌双T-DNA植物表达载体构建及农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化

抗真菌双T-DNA植物表达载体构建及农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化抗真菌双T-DNA植物表达载体构建及农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化植物真菌病害严重影响了农作物的产量和质量，因此开发抗真菌基因对于解决这一问题至关重要。

近年来，基因工程技术被广泛应用于植物抗病育种中，其中包括通过遗传转化方式将外源抗病基因导入农作物。

本研究旨在构建抗真菌双T-DNA植物表达载体，并利用农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法将该载体导入玉米植株中，从而使玉米表达外源抗真菌基因，提高对真菌病害的抗性。

首先，我们选择了已经广泛应用于植物基因工程的pCAMBIA1301作为基础载体。

该载体具有高效的农杆菌介导遗传转化能力以及丰富的选择标记和表达元件。

然后，通过PCR扩增得到两个外源抗真菌基因，分别为黄芥子氨酰载氧酶基因（AtAOX1a）和真菌抗菌肽基因（AMP2）。

接着，利用限制性内切酶将这两个基因定向克隆到pCAMBIA1301载体的相应位点上。

通过测序验证了两个基因的正确克隆。

为了实现双T-DNA的表达，我们在构建载体中引入了辅助基因BAR（除草剂抗性基因）。

将BAR基因克隆到pCAMBIA1301载体中，以生成双T-DNA载体。

利用PCR和限制性内切酶切割测序验证了双T-DNA载体的构建成功。

接下来，我们进行了农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化试验。

首先，收集新鲜的玉米茎尖作为转化材料。

将双T-DNA载体通过电击法导入农杆菌，并在适当培养条件下，使其发生同源重组，形成整体的农杆菌。

然后，将这一农杆菌注射到玉米茎尖内，并利用植物生理培养基优化培养条件。

经过一段时间的培养，成功地获得了经过遗传转化的玉米茎尖。

为了进一步确认玉米茎尖是否成功遗传转化，我们进行了PCR检测。

通过PCR分析，我们发现在经过遗传转化的玉米茎尖中检测到了目标抗真菌基因和辅助基因BAR的特异片段。

这一结果进一步证明了我们成功地将抗真菌基因导入了玉米植株中。

本研究构建了抗真菌双T-DNA植物表达载体，并通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化方法成功导入玉米植株中。

玉米（Zeamays）遗传转化实验技术原理

玉米（Zeamays）遗传转化实验技术原理玉米（Zea mays）不仅是研究植物遗传学、基因组学和分子生物
学的重要模式植物，还是具有较高经济价值的主要谷类作物。

随着转基因技术在现代农业中的发展和应用，人们已经培育出了具有抗除草剂和/或抗虫、耐旱或高碳水化合物含量的转基因玉米产品。

农杆菌介导的遗传转化是玉米转基因常用的方法。

该方法的简要步骤如下：首先，分离未成熟的玉米胚将其与携带有目的基因载体的农杆菌共培养；其次，诱导转化后的未成熟胚产生愈伤组织；然后，愈伤组织再生并进行阳性苗筛选（图1）。

农杆菌介导的转化方法可以产生含有单个或相对较低转基因拷贝数的转基因玉米个体。

农杆菌介导的转化方法除了用于未成熟的胚外，还可以应用于其他组织，如新切割的茎尖或枝条。

多种外植体的选择可以使农杆菌介导的转化方法适用于多种玉米基因型。

图1. 农杆菌介导的玉米遗传转化（Zhou et al., 2011）。

参考文献：
•Zhou, R.; et al. (2011). Transformation of, GBSS I, gene driven with barley endosperm-specific promoter into maize inbred line mediated by Agrobacterium. Maize Genomics & Genetics, 3(1), 1-5.。

农杆菌转化

农杆菌介导的高效玉米遗传转化体系的建立摘要: 为了建立玉米高频再生及高效遗传转化体系, 对影响玉米胚性愈伤组织诱导的11 个因素及影响胚性愈伤分化的9 个因素用正交实验方法进行研究Southern blotting 分析表明, 25 mg/L 潮霉素选择压下抗性愈伤率作为转化体系优化指标是可靠的。

在影响转化效率的因素中, acetosyringone (AS)使用浓度因基因型不同而表现出敏感度差异, 共培养温度24~25℃、农杆菌浓度和浸泡时间0.7 OD×15 min, 以及pH 值5.5~6.2 是最高转化率的优选组合。

关键词: 玉米; 正交实验; 胚性愈伤诱导率; 抗性愈伤率; 农杆菌介导;玉米是重要的粮食和饲料作物, 其产量直接关系到我国粮食安全问题。

然而, 玉米产量与品质长久以来徘徊不前。

尽管农杆菌转化法具备能导入大片段外源基因且低拷贝整合、不易引起分子间或分子内重排等优势, 但玉米等单子叶植物非农杆菌天然宿主, 遗传转化率低[2], 即使获得少量转基因植株也因遗传稳定性差、基因表达水平低及嵌合体等问题而限制了对后代的选择和利用。

目前玉米遗传转化体系研究大多集中在单因素对遗传转化率的影响分析上。

这包括自交系筛选[12~14]、受体材料选择[15~17]、培养基调适[18]、载体系统优化[19]、辅助转化[20]、筛选标记[21~23]及标记剔出[24]等, 也获得了一些有关玉米产量[25]、品质[26~28]及抗性(抗虫、抗病、抗寒和抗旱)[29~33]等性状改良的研究结果。

进一步关于农杆菌介导的玉米遗传转化系统研究进展可参阅Shrawat 和Lörz [34]、魏开发等[35]的综述。

本研究拟先建立基于优良自交系的高频再生系统, 然后对影响遗传转化效率的主要因素进行分步优化, 试图为玉米遗传转化体系研究提供资料。

1.胚性愈伤组织诱导因素正交实验取人工授粉后9~12 d 的雌穗, 4℃冰箱存贮3~4 d, 室内去苞叶, 用70%酒精擦拭表面, 再用0.1%HgCl2 浸泡5 min, 无菌水冲洗4~5 次, 用刀片切去3/5 籽粒, 取同一部位长度在 1~2 mm 范围内幼胚, 盾片朝上分别接种于计划表50 个处理。

农杆菌介导的玉米自交系Z21遗传转化体系的研究

山西农业科学2018，46（4）：517-521，547农杆菌介导的玉米自交系Z21遗传转化体系的研究李韩帅1,2,3,周秒依3,杨凤玲3,李婷3,白琪林2,刘亚3（1.山西大学生物工程学院，山西太原030006；2.山西省农业科学院作物科学研究所，山西太原030031；3.北京市农林科学院玉米研究中心，北京100097）摘要:农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化效率一直是影响玉米转基因研究的重要因素。

针对玉米自交系Z21，在外植体大小、农杆菌浓度和共培养时间等多个方面进行了探究。

结果表明，在幼胚大小1.5～2.0mm 、农杆菌浓度OD 600为0.9～1.2、共培养3d 的条件下，Z21的外源基因表达效率最高。

通过优化影响农杆菌介导转化的各种因素，初步建立了玉米自交系Z21的高效遗传转化体系。

关键词:玉米；农杆菌介导法；GUS 染色；转化效率中图分类号:S513文献标识码:A文章编号:1002-2481（2018）04-0517-06Study onMediated Genetic TransformationSystem of Maize Inbred Line Z21LI Hanshuai 1，2，3，ZHOU Miaoyi 3，YANG Fengling 3，LI Ting 3，BAI Qilin 2，LIU Ya 3（1.College of Bioengineering ，Shanxi University ，Taiyuan 030006，China ；2.Institute of Crop Sciences ，Shanxi Academy of Agricultural Sciences ，Taiyuan 030031，China ；3.Maize Research Center ，Beijing Academy of Agriculture &Forestry Sciences ，Beijing 100097，China ）Abstract ：The efficiency of Agrobacterium mediated genetic transformation of maize immature embryos has been an important factor affecting the research of transgenic maize breeding.In this paper,the size of explants,the concentration of Agrobacterium and the co-culture time of maize inbred line Z21were investigated.The results showed that the instantaneous expression rate of GUS in Z21reached the maximum under the condition while immature embryo size was 1.5-2.0mm,the concentration of Agrobacterium was OD 600＝0.9-1.2and the duration of co-cultivation was 3days.By optimizing the factors that affected the transformation of Agrobacterium ,a highly efficient maize genetic transformation system was established.Key words ：maize;Agrobacterium mediated method;GUS staining;transformation efficiency收稿日期:2018-02-27基金项目:北京市农林科学院创新能力建设专项（KJCX20170203）；北京市农林科学院青年基金项目（QNJJ2016）；山西省科技攻关项目（201703D221001-10）；山西省农业科学院育种工程项目（17yzgc084）作者简介:李韩帅（1991-），男，河北邯郸人，在读硕士，研究方向：玉米转基因。

农杆菌介导Chi-linker-Glu融合基因和bar基因转化玉米茎尖的研究

质的下降，常规育种培育抗病玉米自交系周期长、率低，难满足生产需要。２效很０世纪７Ｏ年代兴起的植物基因
工程技术打破了物种之间基因交流的界限，以将有利的外源基因导人受体植物中，可为作物遗传改良带来了新的
摘要：菌性病害和田间杂草严重影响着玉米产量及饲用品质，丁质酶和ｐ１３葡聚糖酶催化病原真菌细胞壁的真几一，
水解反应，者协同作用能够有效地抑制病原真菌生长。为了获得兼具真菌病及除草剂抗性的玉米种质新材料，二
表达，且７的转基因植株可育，并０该实验有力地证明了农杆菌对单子叶植株与双子叶植物具有相同的转化机制，这是玉米遗传转化研究中里程碑式的工作。玉米遗传转化技术正日趋成熟，界上有大批玉米转基因新品系世得到推广种植，取得了显著的经济及社会效益。］
目前常用的玉米遗传转化方法有基因枪法］农杆菌介导法］花粉管通道法＿，杆菌介导法由于成本、，等农低、作方便而备受青睐。受体材料通常是幼胚或成熟胚的胚性愈伤组织，操由于受基因型限制较大，产上常用生的优良玉米自交系诱导愈伤困难，基因技术难以大规模推广应用，转因此选择取材方便且转化不受基因型限制的转化系统成为玉米转基因研究的新方向。幼嫩茎尖的分生组织具有很强的分生能力，玉米遗传转化的良好受是

农杆菌介导的ZmHSD1基因转化玉米自交系

农杆菌介导的ZmHSD基因转化玉米自交系糖皮质激素是一类动物激素，参与糖、脂肪和蛋白质的生物合成和代谢等过程，还具有抗炎的作用[1]。

11B -羟基类固醇脱氢酶(11 B-hydroxysteroid dehydrogenase , 11 B -HSD)是调节糖皮质激素的关键酶，它促进活性糖皮质激素与非活性激素之间的相互转换[2，3]。

虽然目前在植物中还没有鉴定出11B -HSD，但是随着拟南芥基因组测序工作的完成，发现了八个类似HSD的基因。

最先鉴定出的是一种油菜籽HSD它在利用ABA类似物抑制种子萌发的过程中过量表达[4] ；Jolivet 等[5] 证实在芝麻和油料作物中只存在微量的HSD这些HSD编码的蛋白表现出与NADP所依赖的11 B -HSD 17 B -HSD/17 B -类固醇脱氢酶相同的性能⑹。

AtHSD1基因包括6个外显子和5个内含子，它编码的蛋白由389个氨基酸组成，李凤玲等[7]将AtHSD1的cDNA连接到35S启动子后整合到拟南芥中，发现转基因植株明显比野生株粗壮，其分支和长角果的数量也明显增多，转AtHSD1基因植株的表型与过量产生BR或过量表达BR受体基因BRI1的表型一致[8〜10];同时发现转基因植株的抗盐性比野生植株高[7]。

因此，该基因在改善农作物植株生长、提高产量方面有很大的潜力。

本研究利用农杆菌介导的遗传转化方法，尝试将ZmHSD基因转入玉米自交系品种，以期获得转基因玉米植株，拓宽玉米种质的遗传背景，为高产稳产玉米品种的选育服务。

1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 植物材料玉米( Zea maysL. )自交系18-599 、齐319 和昌7-2 。

1.1.2目的基因、载体、菌株ZmHSD表达载体由山东农业大学生命科学学院基因工程实验室构建。

表达载体中，目的基因为ZmHSD,其启动子为Ubi ;筛选标记基因为NPTI，其启动子为CaMV35(图1)。