农杆菌转化法基本操作与理论

合集下载

1农杆菌转化法的原理是

1农杆菌转化法的原理是农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）转化法是一种重要的基因转化技术，广泛应用于植物基因工程研究和农业生产中。

其原理基于农杆菌与植物细胞间的相互作用，利用农杆菌外源DNA（T-DNA）的引导作用将目标基因嵌入到植物细胞的染色体中。

农杆菌转化法的主要步骤包括农杆菌培养、感染、共培养和筛选。

具体来说，其原理可分为农杆菌感染、T-DNA引导、T-DNA拼接和植物细胞接受等几个阶段。

首先，农杆菌感染是农杆菌与植物细胞发生接触的过程。

农杆菌通过外源的感染素（vir蛋白）介导，诱导植物细胞在感染部位生长出肿瘤组织，为转化提供了良好的环境。

感染素能够识别并结合到植物细胞的切伤部位，进而形成感染结构。

接着，T-DNA引导是农杆菌T-DNA（转座子DNA）与植物细胞染色体DNA 之间的互作过程。

农杆菌T-DNA原先位于质粒中，通过T-DNA上的边缘重复序列（LB和RB）以及其中的转移基因（transgenes）引导将T-DNA插入到植物细胞染色体中。

T-DNA在感染素作用下从质粒中剪切出来，再与植物细胞的染色体DNA发生重组，将T-DNA嵌入到染色体的随机位置。

随后，T-DNA拼接是指T-DNA与植物细胞染色体DNA发生重组并嵌入到染色体的过程。

T-DNA的LB和RB序列能够诱导农杆菌酶系统切割起始位点（nick sites），将T-DNA与染色体DNA连接起来。

然后，T-DNA和染色体DNA之间发生DNA重组，形成补充植物基因组的新构建（chimeric construct）。

这一过程具有较高的随机性，T-DNA可能嵌入到不同的染色体位点，并且还有可能发生多个T-DNA拼接。

最后，植物细胞接受是指植物细胞在T-DNA拼接完成后仍能够正常生长和分化。

当T-DNA成功嵌入植物细胞染色体后，植物细胞会通过自身的修复机制进行DNA修复，恢复正常的遗传信息。

如果T-DNA中存在目标基因，那么该基因就被整合到了植物细胞的染色体中，并能够在细胞分裂和再生的过程中被遗传和表达。

农杆菌转化法详细过程

农杆菌转化法详细过程
一、质粒的构建
1、结合胞外表达载体DNA片段：根据需要，挑选合适的质粒载体，通常是常用的pUC18或pUC19，然后从受体DNA片段中提取事先选择好的促进脱附酶及其他酶结合位；
2、PCR扩增：使用上述质粒模板进行PCR扩增，以获得清洁的受体片段；
3、克隆：把扩增片段和质粒模板克隆到同一质粒中，然后克隆到载体存储库中，以创建定向载体用于后续研究。

二、原核转化
1、准备转化粒菌：在装满氯化物的快速离心管中，将转化菌株(一般为质粒转录系) 用冰凉的悬浮液制成2X数量的悬淋液；
2、增加plasmid 质粒：在用有抗生素控制的细菌方法中，增加转换用材料，如plasmid质粒，磷酸二钙和CaC1₂，以及可能的其他试剂；
3、原核转化：将上述的悬浮液（AP出水液）添加到悬淋液中，然后加入CaC1₂和磷酸二钙，用低频超声处理混合液使其充分作用10分钟；
4、选择转化的细胞：将处理过的转化液投入加有抗生素的培养基中，然后将这些细胞培养到辅助抗生素中，以选择转化的细胞，在抗生素抑制剂中，该细胞会死亡；
5、筛选和鉴定：原核基因转换后，体外状态选择一般会获得若干转换抗性的菌株，最终进行PCR、测序或其他方法以鉴定突变体，以确定该菌株具有最终突变基因。

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理农杆菌转化法是一种常用的植物基因转化技术，其原理是利用农杆菌在植物体内引起植物细胞的转化，使外源基因被导入植物细胞内，从而实现对植物基因的改造。

这项技术在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用，为改良作物品种、提高农作物产量、抗病虫害等方面提供了有力的技术支持。

农杆菌转化法的原理主要包括以下几个关键步骤：1. 农杆菌感染植物细胞。

首先，将含有外源基因的质粒DNA导入到农杆菌的Ti质粒中，然后将农杆菌与植物组织接触，使其感染植物细胞。

农杆菌通过其特殊的毛状附着器将Ti质粒转移到植物细胞内。

2. 植物细胞内基因导入。

农杆菌感染植物细胞后，Ti质粒中的外源基因会被转移到植物细胞内。

这些外源基因可以是对抗病虫害、提高产量或改良品质的基因，通过农杆菌的介导，成功导入到植物细胞内。

3. 外源基因整合到植物基因组。

一旦外源基因进入植物细胞内，它们会与植物细胞的染色体发生重组，将外源基因整合到植物基因组中。

这样，外源基因就成为植物细胞的一部分，可以被遗传到后代植物中。

4. 外源基因表达。

一旦外源基因整合到植物基因组中，它们就会开始在植物细胞内进行表达。

外源基因的表达可以使植物获得新的性状，比如抗病虫害、耐逆境等，从而实现对植物性状的改良。

农杆菌转化法的原理简单清晰，通过这种方法可以实现对植物基因的改造，为农业生产提供了重要的技术手段。

在实际应用中，农杆菌转化法已经成功应用于多种作物，如水稻、小麦、玉米、大豆等，为作物的抗病虫害、耐逆境等性状的改良提供了有效途径。

总的来说，农杆菌转化法作为一种重要的植物基因转化技术，其原理清晰，操作简单，成功率高，因此在农业生产和基因工程领域有着广泛的应用前景。

随着技术的不断进步和完善，相信农杆菌转化法将会为农业生产和作物改良带来更多的机遇和挑战。

农杆菌转化实验步骤

农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化实验步骤
农杆菌转化是一种常用的基因转移技术，可以将外源DNA导入植物细胞。

下面是农杆菌转化实验的基本步骤：
1. 制备农杆菌：首先，选择适合的农杆菌株，常用的是农杆菌株Agrobacterium tumefaciens。

接种农杆菌于适宜的培养基中，培养至合适的生长期。

2. 构建质粒：在进行转化实验前，需要构建包含目标基因的质粒。

质粒可以通过常规的分子生物学技术，如PCR扩增、限制性酶切和连接等方法来获得。

3. 准备细菌：将构建好的质粒转化到农杆菌中。

通常采用电穿孔或热激方法，使质粒能够进入农杆菌内。

4. 感染植物：选择适当的植物愈伤组织或幼苗作为接受体，将其暴露在含有农杆菌的培养基中。

农杆菌会侵入植物细胞，并将质粒转移
到植物基因组中。

5. 抗生素筛选：转化后的细菌通常在培养基中含有特定抗生素。

将被转化的植物细胞接种于含有抗生素的选择培养基中，该抗生素能够选择出已转化的细胞。

只有具备目标基因的细胞能够生长并形成抗性。

6. 再生植物：选定抗生素抗性的植物细胞，进一步培养和处理以促进其发育和增殖。

通过激素处理和适当的培养条件，可以使其分化成完整的植株。

7. 验证转化：最后，通过分子生物学技术，如PCR和Southern blot 分析，来确认转化的植物是否成功地获得了外源基因，以及其在植物细胞中的表达。

农杆菌转化实验是一种常用且有效的方法，可用于植物基因工程及改良研究。

通过以上步骤，可以成功将目标基因导入植物细胞中，以获得具有所需性状的转基因植物。

农杆菌转化法介绍

农杆菌感受态制备与转化普通农杆菌感受态制备与转化：方案一1. 挑单菌落于2ml YEP培养基（含Rif20mg/ml）中28℃过夜活化。

2. 取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右（4hr）。

3. 5k rpm离心5分钟。

4. 在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞。

5. 5 krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2。

如不是马上使用，可以将之按200ul分裝储存于-80℃待用。

6. 加1ug DNA于200ul感受态细胞中，冰上放置30分钟。

7. 液氮中冷冻1分钟。

8. 37℃水浴溶化细胞。

9. 加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr（低速）。

10.离心1分钟，悬浮细胞在100ul YEP培养基中。

11.涂板，28℃培养2-3天。

电转农杆菌感受态细胞制备与转化方案二1. 挑取单克隆接种于2mlYEP（含50mg/l链霉素）液体培养基，28℃，250rpm，振荡培养过夜。

（如用5mlYEP，需培养36h）2. 将菌液按1:100转移至200mlYEP（含50mg/l链霉素）培养液中，28℃，250rpm，振荡培养至OD=0.3(约4~5h)。

3. 转入50ml的无菌离心管，4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

4. 用20ml冰浴的HEPES(1mM，PH-7.0)重悬。

5. 4℃，4000rpm离心10min，弃上清。

6. 重复4、5步骤2~3次。

7. 用2ml冰浴的10％甘油重悬。

8. 每管100ul1.5ml无菌的Eppendorf管中，-70℃保存。

1mM HEPES的配制：称取0.119gHEPES（MW 238.3）粉末，加水溶解，定容至500ml，用NaOH调pH至7.0，灭菌后待用。

注：HEPES需现用现配。

电击法转化农杆菌感受态细胞1. 取出农杆菌感受态细胞于冰上冻融。

2. 加2μl质粒DNA于100μl感受态细胞中，用枪头轻轻搅拌混匀。

农杆菌转化法的过程

农杆菌转化法的过程农杆菌转化法（Agrobacterium-mediated transformation）是一种广泛应用于农业科学和生物技术研究的基因转化方法。

该方法利用一种土壤细菌，农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）将外源基因转移到植物细胞中。

农杆菌转化法具有转化效率高、适用广泛、转基因稳定等优点，已被广泛应用于农作物和果树的遗传改良、抗病抗虫育种等领域。

1.细胞培养首先，需要从植物中获得要进行基因转化的组织细胞（通常是幼苗的果荚或子叶）。

这些组织细胞被培养在含有植物生长激素的富营养培养基中，使其加速分裂和生长。

2.农杆菌培养将农杆菌菌株（通常是含有外源基因的农杆菌株）培养在液体培养基中。

培养基中含有特定的营养物质和抗生素，以促进菌株的生长和维持菌株稳定。

3.动态系统将培养好的植物细胞和农杆菌菌液混合，形成动态系统。

混合液中的植物组织和农杆菌菌株会发生暂时性的融合并进入植物细胞。

4.感染阶段通过共培养或注射等方式，使动态系统中的农杆菌菌株进入植物细胞。

农杆菌会通过特定的受体识别和感染植物细胞。

5.DNA传递一旦农杆菌菌株感染了植物细胞，它会将其含有外源基因的DNA片段传递给植物细胞。

这个DNA片段通常是携带目标基因和选择标记基因的载体。

选择标记基因可以使得转化后的植物细胞在包含选择抗生素的培养基上存活。

6.培养和筛选转化后的植物细胞被转移到含有选择抗生素的培养基中，使得只有携带外源基因的细胞可以生长和分裂。

这样就可以筛选出带有目标基因的转化植物细胞。

7.植株再生将筛选出的转化细胞培养到适当的大小和形态后，再将其转移到含有特定激素的培养基中，以促使其分化为整个植株。

经过适当的培养和生长，就可以获得转基因植物。

总结来说，农杆菌转化法通过将植物细胞和农杆菌菌株进行共培养，使农杆菌将外源基因传递到植物细胞中，然后通过筛选和培养，最终获得转基因植物。

这种方法在农业科学和生物技术研究中具有广泛的应用前景。

农杆菌转化法原理及过程

农杆菌转化法原理及过程
农杆菌转化法是一种常用的基因转化方法，广泛应用于植物基因工程中。

其原理是利用农杆菌中的 Ti 质粒将目的基因导入植物细胞中。

农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物。

在感染过程中，农杆菌会将其 Ti 质粒上的 T-DNA（转移 DNA）片段整合到植物基因组中。

T-DNA 上含有多个基因，其中包括生长素和细胞分裂素合成基因，这些基因能够促使植物细胞分裂和生长，从而形成肿瘤。

在基因转化过程中，首先需要将目的基因插入到 Ti 质粒上的 T-DNA 区域中，构建成重组质粒。

然后，将重组质粒导入农杆菌中，使其能够携带目的基因。

接下来，将携带目的基因的农杆菌感染植物细胞，可以通过注射、浸泡或共培养等方式进行。

在感染过程中，农杆菌会将 T-DNA 片段导入植物细胞中，并整合到植物基因组中。

最后，通过筛选和鉴定，获得含有目的基因的转化植株。

农杆菌转化法具有操作简单、转化效率高、适用范围广等优点，是植物基因工程中最常用的方法之一。

但是，该方法也存在一些局限性，如对于某些植物种类转化效率较低、可能引起植物基因组的突变等。

因此，在实际应用中需要根据具体情况选择合适的转化方法。

农杆菌感受态制作和转化

农杆菌感受态制作
1.取保存的菌种，在含相应抗生素的YEB固体培养基上划线，28℃、培养24~36h至长出
单菌落。

2.挑取农杆菌单菌落，接种于5ml含有相应抗生素的液体YEB培养基内。

28℃、250rpm
培养24~36h，至菌液OD600约0.5~0.6
3.按2%体积，将菌液加入含相应抗生素的液体YEB培养基中，28℃、250rpm培养至OD600
为0.5~0.6。

4.4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。

5.加入和扩大培养时培养液相同体积的70mmol/L CaCl溶液，重悬。

6.4℃、5000rpm离心10min，收集菌体。

7.加入体积为扩大培养时培养液1/10的70mmol/CaCl溶液，重悬。

8.分装为100μL的小分，至于冰上备用。

9.若要冻存，需加入终浓度为15%~20%的甘油。

-80℃冻存。

注：4~9步请注意无菌操作！。

农杆菌转化法作用

农杆菌转化法作用
农杆菌转化法作为一种常见的基因转移技术，被广泛应用于生物学和农业领域。

本文将从农杆菌转化法的基本原理、应用领域、优缺点等方面进行介绍。

一、基本原理
农杆菌转化法基于农杆菌与植物细胞间的互作关系，将外源DNA 转移至植物细胞中，实现基因转移。

其基本原理是将外源DNA与农杆菌质粒（Ti质粒）连接，然后将这些质粒转移至农杆菌细胞中，接着再将农杆菌与植物细胞接触，使质粒中的DNA转移到植物细胞中。

转移过程中，农杆菌的生物学特性是关键因素，包括其菌株的选择、营养物质的添加等。

二、应用领域
1.植物基因工程：农杆菌转化法是植物基因工程中最常见的技术之一。

利用农杆菌转化法可以将外源基因导入植物细胞中，实现多种基因功能的表达或靶向编辑。

2.农业生产：农杆菌转化法可以被用于改良农作物的品质和产量。

例如，通过导入耐盐碱性基因或高产基因，可以提高作物的适应性和产量。

3.医学研究：农杆菌转化法在医学研究中也有应用。

例如，将荧光
蛋白基因转移到哺乳动物细胞中，可以用于细胞追踪和药物筛选。

三、优缺点
1.优点：农杆菌转化法具有高效、简便、可重复性好等特点。

同时，该技术也可应用于多种植物物种中。

2.缺点：农杆菌转化法也存在一些缺点，如转化效率和稳定性会受到多种因素的影响，如农杆菌菌株的选择、植物细胞的生长状态等。

四、总结
农杆菌转化法作为一种常见的基因转移技术，具有广泛的应用前景。

虽然该技术存在缺点，但是其高效、简便的特点仍然使其成为一种重要的基因转移技术。

我们相信，在今后的生物学和农业领域中，农杆菌转化法会继续发挥重要的作用。

农杆菌介导的转化作用原理

农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化是一种生物技术方法，用于将外源DNA引入植物细胞中。

其原理是利用农杆菌生长势旺盛、易于培养的特点，将目标外源DNA导入到农杆菌的质粒中，形成重组质粒。

然后通过将转化质粒与植物细胞接触，使其外源DNA传递到植物细胞内部。

具体步骤如下：
1. 构建重组质粒：在质粒中插入目标外源DNA，通常使用限制性内切酶将目标基因插入到质粒的多克隆位点（多克隆位点是一段DNA序列，能够容纳外源DNA）。

2. 转化农杆菌：将质粒导入到农杆菌中，使其质粒与细菌细胞融合，形成重组菌株。

3. 培养菌株：培养重组菌株，使其扩增到大量细胞。

4. 处理植物组织：将希望转化的植物组织（例如幼嫩的叶片或胚）与农杆菌接触，使农杆菌与植物细胞发生互作用。

5. 重组质粒转入植物细胞：通过机械方法（例如悬浮培养）或生理方法（例如创伤诱导），使农杆菌穿过植物细胞的细胞壁，使重组质粒进入植物细胞。

6. 重组质粒在植物细胞中复制和表达：重组质粒在植物细胞中复制，并将插入的目标基因转录和翻译为蛋白质。

通过农杆菌介导的转化方法，可以有效地将外源基因导入到植物细胞中，实现基
因转移和基因表达的目的。

这种方法在植物基因工程和转基因技术中得到广泛应用。

农杆菌的转化流程

农杆菌的转化流程方案一1.农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中，250 r/min，26-28℃悬浮培养12-16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；④弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃，8000 r/min, 离心8 min；⑥弃上清，加入原始菌液1/50体积（800μ l/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μ l）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化（冻融法）将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀，冰上放置30 min；②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中，待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板）；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素。

在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。

以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。

3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养：①70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25-30 min，无菌水清洗四次；②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1.0 mg/L 维生素、2.0 mg/L 苷氨酸、3% 蔗糖、0.6-0.7% 琼脂（KOH 调至pH 5.7-5.8），于25-26℃，14 h光照/10 h黑暗条件下萌发；③14天后，将萌发出的烟草幼苗转移至含有相同1/2 MS培养基的组织培养盒中，同样条件下继续培养4-6周，小苗长出后可用于叶盘转化。

农杆菌转化法的原理

农杆菌转化法的原理农杆菌转化法是一种常用的基因转化技术，它利用土壤中的一种土壤细菌——农杆菌，将外源基因导入到植物细胞中，从而实现对植物基因的改造。

这项技术在植物遗传改良、抗病虫害、抗逆境等方面具有重要的应用价值。

下面我们将详细介绍农杆菌转化法的原理。

首先，农杆菌转化法的原理基于土壤细菌——农杆菌的自然生物学特性。

农杆菌具有一种称为T-DNA（转移-DNA）的质粒，它是一种环状DNA分子，携带有一系列的基因片段。

当农杆菌感知到植物体内的信号物质后，它将利用一种称为生物胶的结构与植物细胞结合，然后将T-DNA转移至植物细胞内。

其次，农杆菌转化法的原理包括三个主要步骤，感知、结合和转移。

首先，农杆菌感知到植物体内的信号物质，这些信号物质可以是植物受到外界压力或伤害时释放的化合物。

其次，农杆菌利用生物胶结构与植物细胞结合，形成一个稳定的结合体。

最后，农杆菌将T-DNA转移到植物细胞内，并将其整合到植物细胞的染色体中。

最后，农杆菌转化法的原理是基于T-DNA的导入和整合，实现外源基因的表达。

一旦T-DNA整合到植物细胞的染色体中，它就会与植物细胞的遗传物质融合在一起，成为植物细胞的一部分。

这样，外源基因就能够在植物细胞内得到表达，从而实现对植物性状的改良。

总的来说，农杆菌转化法的原理是基于农杆菌与植物细胞的相互作用，利用T-DNA的导入和整合，实现外源基因的表达，从而实现对植物基因的改造。

这项技术在植物遗传改良、抗病虫害、抗逆境等方面具有广阔的应用前景，对农业生产和生物技术领域具有重要意义。

希望通过本文的介绍，能够使读者对农杆菌转化法的原理有一个清晰的认识。

农杆菌直接转化法：冻融法

Ⅲ、农杆菌直接转化法：冻融法一旦预期的分子在大肠杆菌中被构建，该分子可通过冻融法直接转化入土壤农杆菌中。

尽管与三亲杂交法相比，冻融法转化的效率仅为103个转化子/mgDNA，但该法是可靠快速的。

该法也可以去除三亲杂交法造成的质粒重排现象。

1、含有辅助Ti质粒的农杆菌单菌落（2-3mm）接种于5mlYEP培养基中，28℃过夜培养；2、取1ml过夜培养物于含有100mlYEP的250ml三角瓶中，并在28℃下，剧烈振荡（250rpm）培养至OD值为0.5-0.6；3、取50ml培养物置于冰上冷却5min，4℃，5000rpm，离心5min；4、A、弃去上清液，用1ml冰冷的0.1M CaCl2溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内（0.1ml/管），用于后续试验；B、弃去上清液，用1ml冰冷的0.1MCaCl2溶液重悬沉淀菌体，分装重悬物于Eppendorf小试管内（0.1ml/管），并添加15%的甘油，液氮速冻后，-80℃保存；5、A、直接取分装后的感受态农杆菌（0.1ml/管），加入1-2μg的质粒，轻轻混匀；B、取-80℃保存含感受态菌株的Eppendorf小试管一支，在冰上融解后，加入1-2μg的质粒，轻轻混匀；6、冰上放置30min，再用液氮速冻5min；7、将小管放于37℃水浴中5min，融解细胞；8、加入1mlYEP培养基于试管内，28℃，200rpm，振荡培养2-4h。

该过程使得菌体表达抗生素抗性基因；9、4℃，5000rpm，离心30s，弃去上清液，再用0.1mlYEP培养基重悬沉淀细胞；10、涂布重悬物于含有20μg/mlRif和50μg/mlKanamycin的YEP平板上，28℃共育。

2-3d后转化克隆出现。

农杆菌转化步骤

1.micro-tom 种子的处理：
①75%乙醇侵泡种子：30s，这一步时间不宜过长。

②10% Naclo 消毒20min，无菌水清洗4-5次，最后一次浸泡半小时。

③处理完的种子放到萌发培养基上（MS固体培养基），24±1℃黑暗培养6天，转入光照
条件下4-7天，等待长出子叶。

2.农杆菌转染
①三种培养基的配制：
无抗性的生芽培养基：1/2MS + 2mg/l 6-BA + 0.5mg/l IBA
抗性生芽培养基：1/2MS + 2mg/l 6-BA + 0.5mg/l IBA + 10mg/L Hyg + 250mg/L羧苄
抗性生根培养基：1/2MS + 0.2mg/l IBA + 10mg/L Hyg + 250mg/L羧苄
②农杆菌的处理
A：转基因的农杆菌，200ul加入20mlLB液体培养基中，并加入10ul （25ug/ml）kana 和20ul（12.5ug/ml）Ref，28℃过夜培养24小时
B：取过夜培养的农杆菌200ul于20mlLB培养基中，不加入任何抗生素，加入10ul AS （100umol/L），28℃摇菌8小时，直到OD600=0.3左右
C：取无菌苗子叶，横切，放入菌液侵染15min，无菌纸吸干残留菌液，近轴面朝下，放在无抗性的生芽培养基，暗培养2天
D：2天后取出，放入抗性培养基中，筛选培养。

E：待长出不定芽，再转入抗性的生根培养基，待生根
F：炼苗，移栽
农杆菌浓度在OD600值0.3-0.4最好，侵染15min效果最好。

Hyg的浓度10mg/L最好。

AS：100umol/L。

羧苄初期抑菌的浓度一般200-300mg/L。

农杆菌转化法的操作步骤

农杆菌转化法的操作步骤农杆菌转化法呀，这可是个很有意思的技术呢！咱就来说说它的那些步骤。

先得准备好你的受体材料，就像厨师要准备好食材一样。

这受体材料可以是植物的各种部位，比如叶片啦、茎段啦等等。

你得把它们弄得干干净净、健健康康的，这样农杆菌才愿意和它们亲近呀！然后呢，就是要培养出厉害的农杆菌啦。

这些小家伙们可是转化的关键呢！把它们放在合适的培养基里，让它们茁壮成长，就像养孩子一样精心照料。

等农杆菌长得壮壮的了，就该让它们和受体材料来个亲密接触啦。

把受体材料泡在农杆菌的培养液里，就好像让它们一起洗个澡。

这时候啊，农杆菌就会悄悄地把它们的遗传物质传递给受体材料啦，是不是很神奇？就好像是在偷偷地传递秘密一样。

接下来可不能大意哦！要给它们创造一个合适的环境，让转化能够顺利进行。

温度呀、湿度呀都要控制好，可不能让它们受委屈了。

经过一段时间后，就得检查检查转化的效果啦。

看看受体材料有没有成功地接受了农杆菌带来的新遗传信息。

这就像是考试看成绩一样，紧张又期待呢！要是转化成功了，那可真是太棒啦，就好像中了大奖一样开心。

要是没成功呢？别灰心呀，咱再来一次！就像走路摔倒了，爬起来继续走一样。

多试几次，总会成功的嘛！你说这农杆菌转化法像不像一场奇妙的冒险？每一步都充满了未知和惊喜。

它能让我们把一些好的基因导入到植物里，让植物变得更优秀、更强大。

这多有意思呀！就好像我们是植物的魔法师，能赋予它们神奇的力量。

而且哦，通过农杆菌转化法，我们可以培育出各种各样有特殊功能的植物呢！比如抗病虫害的呀，或者能生产特殊物质的呀。

这对农业、对我们的生活都有着很大的意义呢！所以呀，大家可别小看了农杆菌转化法，它可是个很厉害的技术呢！好好掌握它，就能为我们的生活带来很多的好处和惊喜哟！。

农杆菌转化的原理

农杆菌转化的原理
农杆菌转化是一种常见的基因转移技术，通过这种技术可以将外源基因导入到目标细胞中并实现有效表达。

农杆菌转化的原理主要包括以下几个方面：
1. 农杆菌的识别和结合。

农杆菌具有一种特殊的异丙基酰胺酶（VirD2），其可以通过特定的DNA序列（T-DNA）与植物细胞的DNA 结合，并导入到细胞内部。

2. T-DNA的切割和导入。

在T-DNA与农杆菌结合后，VirD1和VirD2会共同作用，使T-DNA在某些特定位点上被切割。

接着，VirD2会导入T-DNA到目标细胞的细胞质内。

3. T-DNA的插入和整合。

T-DNA一旦导入到目标细胞的细胞质内，就会通过非同源重组的方式插入到宿主细胞染色体中。

随后，T-DNA 会被宿主细胞的DNA修复系统修复，形成稳定的整合体。

4. 外源基因的表达。

一旦T-DNA被整合到宿主细胞染色体中，外源基因就可以被宿主细胞的机制所表达。

这种表达方式通常是受到T-DNA插入位点的影响的，并且会受到其他因素的调控。

综上所述，农杆菌转化的原理是通过农杆菌的识别、切割和导入T-DNA，然后T-DNA插入到宿主细胞染色体中并实现稳定整合，最终外源基因得以表达。

- 1 -。

农杆菌转化

农杆菌转化植物表达载体转化农杆菌操作步骤第一部分：农杆菌介导转化水稻1、农杆菌选择：LBA4404、EHA105、GV31012、农杆菌活化：将保存的农杆菌在固体LB培养基上画线（或加或不加抗生素，LBA4404:Rif 或Str；EHA105：Rif或Str；GV3103：庆大霉素。

如果不加抗生素就有可能造成这些菌株的Ti质粒丢失，导致农杆菌缺乏侵染性），抗生素浓度为：50μg/ml。

28℃培养。

3、农杆菌感受态细胞的制备：1）挑取单菌落接种于3ml LB液体培养基中，220rpm 28℃振荡培养至OD600 =0.5。

2）吸取1.5ml菌液于离心管中，冰浴10min；3）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；4）沉淀用1.5 ml 0.5M NaCl悬浮,冰浴20min；5）5000（13000）rpm离心30s，弃去上清液；6）每管用100μl 20mMCaCl2悬浮，用于转化；制备好的感受态细胞可马上使用，也可按每管200ul分装于无菌离心管中，于4℃保存48小时内使用，长期贮存时必须在液氮中速冻后转一70℃保存。

使用时从一70℃取出，置冰上融化后使用。

4、DNA直接转化农杆菌：1）50μl农杆菌感受态细胞中加入质粒DNA 0.1～1μg（5－10ul），之后冰浴30 min；2）放入液氮中5min（或1min），然后立即放入37℃水浴锅中水浴5min；3）取出离心管，加入0.5mlLB，28℃、220rpm振荡培养3～5hr；4）取出菌液于含相应抗生素的LB平板上涂板，在培养箱中28℃条件下倒置培养。

2天左右菌落可见。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）5、重组农杆菌鉴定：1）挑取单菌落，接种于含相应抗生素的LB液体培养基中，28℃振荡培养过夜。

（pEmu载体：AMP+Rif/Str；pK载体：Kan＋Rif/Str；pTCK载体：Kan＋Rif/Str）2）小量提取质粒DNA，加GTE同时加5μL溶菌酶（50μg "ml -1，贮藏浓度为50mg/ml 或10mg/ml）。

农杆菌的转化流程

农杆菌的转化流程方案一1. 农杆菌的培养及感受态的制备①农杆菌菌株划YM平板，26-28℃培养48 h；②挑取单菌落接种到40 ml 无抗生素的YM液体培养基中,250 r/min，26-28℃悬浮培养12—16 h；③将菌液转入灭过菌的50 ml离心管中，4℃，8000 r/min,离心8 min；④弃上清，加入用100 mM NaCl (4℃预冷)重悬收集的农杆菌；⑤4℃，8000 r/min，离心8 min；⑥弃上清,加入原始菌液1/50体积（800μl/管（此时的感受态农杆菌可以直接用于转化）并分装成100μl）的20 mM CaCl2重悬菌体；⑦置液氮中10 s，放入-20℃冰箱中保存备用。

2.农杆菌的转化（冻融法）将感受态农杆菌置于冰上，加入1μg质粒DNA（体积不宜超过10 μ l），充分混匀,冰上放置30 min;②置液氮中快速冷却约1min后迅速转入37℃水浴中,待其融化；③加1 ml 无抗生素的YM 液体培养基于28℃，230 r/min 培养2-4 h；（或直接用1 mlμl，留500 μ l于管中④ 3000 r/min 离心2 min收集菌体，将上清吸去500 培养菌直接涂布含抗生素的YM平板)；⑤重悬菌体并涂布到含有适当抗生素的YM平板上吹干, 28℃培养48 h；⑥挑取单菌落接种到筛选液体YM培养基中，28℃，250 r/min 培养48 h，将菌液用于保存或转化；注：EHA105抗利福平霉素，LBA4404抗硫酸链霉素.在转化前后的所有培养基中均可加入相应的这两种抗生素，以防止杂菌污染。

以上挑菌及抗生素加入工作均在超净台上进行。

3．转基因烟草体系的建立⑴烟草无菌苗的培养：① 70%乙醇消毒烟草种子30 s后，用无菌水清洗两次，更换NaClO处理25—30 min，无菌水清洗四次;②将灭菌后的种子移至1/2 MS固体培养基（大量元素、微量元素、CaCl2、FeSO4）、1。

农杆菌转化流程

农杆菌转化流程农杆菌转化流程一、农杆菌转化前准备1、必需用到的实验资料（1）转录质子DNA：需要准备好转录质子DNA，一般是由特定的宿主表达稳定贮存的转录质子DNA，或从基因构建中可以获得。

（2）农杆菌载体：以合成DNA或者从宿主菌株中获得的农杆菌载体，其中可以放置表达构建，并且有足够的特殊的鉴定序列（如PCR、Restriction digest），可以鉴定它在农杆菌中的位置。

（3）其它实验质子：比如抗性菌株、生物毒素、和其它的必需的分子质子，也可以从宿主中获得。

2、建立农杆菌转化流程（1）根据转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的特性，建立转化流程，确定各项步骤的操作条件。

（2）根据实验室的条件，准备好相应于上述农杆菌转化流程的实验室基础设施，如冰箱、催化器及其他必须用到的实验用品。

3、准备农杆菌显微镜试剂准备好能够激活农杆菌的显微镜试剂，比如，酶共沉淀染色液，用于检测农杆菌的运动能力； UV诱导染色液，用于分析表达的转录质子pDNA在农杆菌中的分布情况；以及抗性染色液，用于分析表达的转录质子pDNA是否具有抗性。

二、农杆菌转化操作1、消毒操作消毒操作是农杆菌转化最重要的一步，需要准备好消毒设备，以及配备灭菌盘、戴手套等安全措施，严格按照安全操作步骤，进行消毒操作。

2、培养基及农杆菌培养将农杆菌放入合适的培养基中，细菌以合适的温度培养，直到细菌数量达到目标为止。

3、农杆菌转化根据预先设计好的步骤，进行农杆菌转化操作，以及对转录质子DNA、农杆菌载体和实验质子的配比等操作，最终完成农杆菌转化操作。

4、农杆菌筛选将转化后的农杆菌通过显微镜试剂以及其他实验方法进行筛选，确定转化的成功率和转录质子DNA的表达水平。

5、农杆菌转化文库构建将转化成功的农杆菌进行分离，收集多个样本进行文库构建，用于后期实验，或者进行其它实验。