水稻农杆菌转化方法

方法1

NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L)

KNO3 2830 mg/L

(NH4)2SO4 463 mg/L

KH2PO4 400 mg/L

MgSO4.7H2O 185 mg/L

CaCl2.2H2O166 mg/L

FeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6

Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5

MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8

H3BO3 3 mg/L 1.6

ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5

Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25

CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025

CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025

KI 0.75 mg/L 0.8

盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1

盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5

烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5

肌醇myo-inositol 100 mg/L 100

水解酪蛋白300 mg/L

谷氨酰胺500 mg/L

脯氨酸500 mg/L

蔗糖30,000 mg/L

PHytagel 2.6 mg/L

pH 5.8

Basic培养基

B N6（大量）50ml （20倍）

A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/L

S B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/L

C proline 0.5g/L glutamine 0.5g/L

N6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L

养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L

基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L

制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.

2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅, 不能有沉淀.

3 CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O

4 配好后放于棕色瓶4℃保存

MS(大量籼稻种子)终浓度母液(20倍) 终浓度

母液(20倍)

培KNO31900 mg/L38g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L

7.4 g/L

养NH4NO3 1650 mg/L33 g/L CaCl2.2H2O 440 mg/L

8.8 g/L

基KH2PO4170 mg/L 3.4 g/L

制备1 KNO3, NH4NO3, Mg SO4.7H2O同时倒入烧杯,加水搅拌

2 KH2PO4先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,

3 CaCl2.2H2O同KH2PO4

4 配好后放于棕色瓶4℃保存

Ms(大量花药用)终浓度母液(20倍) 终浓度

母液

元素KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O 370 mg/L7.4 g/L

培养(NH4)2SO4 231 mg/L 4.62 g/L CaCl2.2H2O 160 mg/L

3.2 g/L

基KH2PO4641 mg/L12.82 g/L

制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌

2 Mg SO4.7H2O 先溶于加了100ML水的烧杯中溶解后再缓慢倒入1中,边倒边搅,

不能有沉淀.CaCl2.2H2O的配制同Mg SO4.7H2O

3 配好后放于棕色瓶4℃保存

YM脓杆菌培养基

KH2PO4 0.5g/L Mannitol 10g/L L-Glutamine

2g/L

NaCl 0.2g/L M g SO40.2g/L Yeast extract

0.3g/L

Agar 15g/L PH=7.0

诱导愈伤、继代培养基basic+2,4-D(2mg/L) PH=5.8

共培养培养基

液体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同)

+ 肌醇2g/L+ CH500mg/L+phytogel+0.1%AS

固体:N6(大)+Fe+B5(micro)+B5(vita)+ sucrose(前四项与basic相同) + 肌醇2g/L+ CH500mg/L+2,4-D (2mg/L)+ phytogel +0.1%AS

PH=5.5 加2,4-D前后都要调PH值.灭完菌,温度降下来后加AS

筛选培养基诱导愈伤+cef(300mg/L)+hyg(50mg/ml) PH=5.5

一筛,二筛的cef,hyg的浓度依次逐渐下降

分化1: basic+KT(4mg/L)+NAA(0.25mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)

培养2: basic+KT(0.5mg/L)+

NAA(0.25mg/L)+6-BA(2mg/L)+cef(300mg/L)+hyg(50mg/L)

基PH=5.8

分化培养基NB培养基：6-BA,2.5mg,NAA,0.25mg,KT,0.5mg

壮苗培养基(生根)

sucrose 30g/L N6 25ml/L MS-Fe盐10ml/L

B5vita 10ml/L agar 7g/L

MS-Fe盐(必须单独配制,否则会沉淀,用鳌合铁)

终浓度母液(100倍)

FeSO4.7H2O 27.8mg/L 2.78g/L

Na-EDTA 37.5mg/L 3.75g/L

制备1 FeSO4.7H2O溶解于水, Na-EDTA溶解于热水,将两者混合定容,于微波炉中加热,煮沸,

颜色变深,冷却到室温,补水, 棕色瓶4℃保存

2,4-D母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解2,4-D后缓慢加入到H2O中,搅拌,如产生沉淀,则重配.

配好后4℃保存

NAA母液(1g/ml) 用1N KOH 溶解NAA,用水稀释定容, 4℃保存

PAA母液(1g/ml) 用无水乙醇溶解加H2O搅拌,定容,4℃保存

6-BA母液(1g/ml) 用HCl溶解, 加少量HCl后,用玻棒研磨成糊状,再加HCl使之完全溶解

AS（乙酰丁香酮）用DMSO直接溶解定容19.62mg/ml,分装到无菌小管

KT 母液(5mg/ml)用1NKOH溶解，用水稀释定容到10ml，过滤灭菌后分装到EP管中，冰冻保存

B5 vitamin终浓度母液(100倍) 终浓度

母液(100倍)

肌醇100mg/L 10g/l Nico-acid 1mg/l

0.1g/l

pyrido(B6) 1 mg/L 0.1 g/l thiamin(B1) 10 mg/L

1 g/l

棕色瓶4℃保存(每次配100ml为好), 肌醇在配培养基时,加入到培养基中

B5(micro)

KI 0.75mg/L H3BO3 3.0mg/L MnSO4 10mg/L ZnSO4 2.0mg/L

Na2MnO4.2H2O 0.25mg/L

CuSO40.025mg/L CoCl20.025mg/L

程序

1.种子去皮，挑成熟完整健康的种子

2.用70%乙醇清洗浸泡2-3分钟，洗3-4次，用0.1%升汞浸泡20-40分钟

3.无菌水洗3至4次

4.置于虑纸上吹干,吹3小时以上

5.摆放到诱导愈伤培养基上，黑暗中培养15-20天，直到长出黄色较大的愈伤

6.剥下愈伤，转至继代培养基上，黑暗培养2周