转Bt基因及其亲本水稻上褐飞虱对三唑磷和溴氰菊酯的反应_李向冬
水稻抗褐飞虱基因bph3特异性分子标记开发及应用
水稻抗褐飞虱基因bph3特异性分子标记开发及应用水稻作为目前世界上最重要的粮食作物之一，在家庭膳食中占有重要地位。
然而，水稻作物的产量受到褐飞虱的严重危害，因此开发水稻抗褐飞虱的抗性已成为十分重要的课题。
研究人员发现，水稻抗褐飞虱的抗性可能与编码Bph3蛋白有关。
Bph3在细胞层面上被发现具有抗褐飞虱的作用，但关于Bph3的特异性分子标记的开发和定位仍不清楚。
因此，研究人员将泰山水稻中的Bph3基因拷贝出来，并通过重建开放阅读框来鉴定Bph3特异性分子标记。
并借助荧光定量PCR（qPCR），检测Bph3特异性分子标记的表达规律。
结果表明，Bph3在受害植株中被表达，且在实时定量荧光PCR（qPCR）分析中，检测出Bph3特异性分子标记的表达与褐飞虱受害之间存在显著的相关性。
研究人员进一步将RACE-PCR技术应用于Bph3特异性分子标记的修饰分析，结果表明，Bph3特异性分子标记不仅表达在脱落酸号码植物中，还可以表达在水稻受害植株中。
同时，研究人员还发现，Bph3在受害植株中发挥一定的抗褐飞虱作用。
基于以上研究，研究人员推测水稻抗褐飞虱有可能与Bph3有关，而Bph3的活性取决于Bph3的表达水平。
此外，研究人员还发现Bph3可能有角色参与水稻抗褐飞虱的抗性，因此开发Bph3特异性分子标记，可以推动水稻抗褐飞虱的育种及应用。
本研究的结果为开发高效的抗褐飞虱策略提供了新的思路，同时也为水稻抗褐飞虱优异种质的育种提供了重要依据。
未来，研究人员将可深入分析bph3的活性及其在水稻对褐飞虱抗性中的作用机理，以期进一步提高水稻对褐飞虱的抗性。
总之，本研究显示：Bph3编码蛋白可能具有抗褐飞虱抗性的功能，而特异性分子标记的开发和定位也为水稻抗褐飞虱的育种及应用提供了重要的参考，同时为发展更高效的抗褐飞虱策略提供了新的思路。
Bt转基因抗虫水稻的研究进展及其对家蚕的风险评估
Bt转基因抗虫水稻的研究进展及其对家蚕的风险评估
杨艳华;戴莉;陈克平
【期刊名称】《河南农业科学》
【年(卷),期】2013(042)002
【摘要】Bt基因是目前农业上使用最广泛的抗虫基因.近年来,Bt基因已广泛用于转基因抗虫水稻的研究,进展极为迅速.我国在Bt转基因抗虫水稻的培育方面处于世界领先水平,且有可能成为世界上率先商品化种植Bt转基因抗虫水稻的国家之一.为此,概述了Bt基因的发展状况、国内外Bt转基因抗虫水稻的研究进展及其对非靶标经济昆虫家蚕的生态风险,以期为Bt转基因抗虫水稻的商品化种植和重要经济昆虫的合理保护提供科学依据和理论参考.
【总页数】6页(P1-6)
【作者】杨艳华;戴莉;陈克平
【作者单位】江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013;江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013;江苏大学生命科学研究院,江苏镇江212013
【正文语种】中文
【中图分类】S511
【相关文献】
1.抗虫转Bt基因水稻外源转基因成分环介导等温扩增技术检测方法的建立及应用[J], 王永;兰青阔;赵新;朱珠;程奕
2.转基因抗虫水稻秀水134-Bt毒蛋白的时空表达分析 [J], 白建江;张建明;朴钟泽;
方军;杨瑞芳;李钢燮
3.转基因抗虫水稻秀水134-Bt和非转基因亲本的稻米主要品质性状与淀粉链长分布比较 [J], 杨瑞芳;白建江;方军;曾威;李刚燮;朴钟泽
4.Bt杀虫基因与Bt转基因抗虫植物研究进展 [J], 王忠华;舒庆尧;崔海瑞;夏英武
5.Bt/CpTI抗虫转基因水稻及其非转基因亲本与普通野生稻杂种F_2群体的等位基因偏态分离 [J], 许锴;杨箫;蔡星星;卢宝荣
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两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子标记定位
两个来源于野生稻的抗褐飞虱新基因的分子标记定位的报告，
600字
本报告详细介绍了野生稻的抗褐飞虱新基因的分子标记定位。
在本报告中，将针对野生稻中发掘到的两个新基因进行定位，并分析其对褐飞虱的保护作用。
目前，褐飞虱（Helicoverpaarmigera）是一种在商业农作物上造成巨大损失的重要害虫。
传统的农药对褐飞虱抗药性较强，因此寻找新的抑制褐飞虱的基因，已成为当前控制褐飞虱的一种有效手段。
2009年，研究人员从中国野生稻中鉴定出了新的抗褐飞虱基因，命名为HaARG1和HaARG2。
为了确定这两个基因的精确位置，研究人员使用测序技术和分子标记技术，对野生稻进行扩增子分析，得到原核表达互补DNA，以确定这两个基因所在的染色体。
结果发现，这两个基因分别位于野生稻第八和十四号染色体上。
为了确定这两个基因的功能，研究人员使用显微注射法和突变分析来研究他们对抗褐飞虱的影响。
研究结果显示，HaARG1和HaARG2基因能够诱导一种抗褐飞虱活性，可有效抑制成虫和卵的褐飞虱发育。
从显微注射实验中得到的结果证实，HaARG1和HaARG2基因具有明显的抗褐飞虱活性，它们能够抑制褐飞虱的卵发育效果和成虫发育效果。
综上所述，通过对野生稻的分子标记定位，研究人员鉴定了两个新的抗褐飞虱基因HaARG1和HaARG2。
这两个基因分别位于野生稻第八和十四号染色体上，能够诱导一种抗褐飞虱活性，可有效抑制成虫和卵的褐飞虱发育。
这些发现为农业抗性
管理提供了新的理论和技术支持，进而为农业有效害虫防治提供了有效的途径。
水稻转Bt基因对稻田土壤光合碳固定和微生物多样性的影响研究的开题报告
水稻转Bt基因对稻田土壤光合碳固定和微生物多样性的影响研究的开题报告1. 研究背景水稻是我国重要的粮食作物之一，Bt基因水稻是一种转基因水稻，其在抗虫方面具有较好的效果。
然而，Bt基因水稻对稻田土壤的光合碳固定和微生物多样性的影响尚未被深入研究，这是目前国内外研究的热点问题之一。
因此，本研究旨在探究水稻转Bt基因对稻田土壤光合碳固定和微生物多样性的影响，为转基因水稻的安全性评估提供科学依据。
2. 研究内容本研究将采用实验室培养与田间调查相结合的方法，分别选取Bt基因水稻和传统水稻作为研究对象，考察它们对稻田土壤光合碳固定和微生物多样性的影响。
具体内容包括以下方面：（1）采集稻田土壤样品，对土壤微生物群落结构和多样性进行测定。
（2）利用荧光素二甲酸钠还原法和气体扩散技术测定稻田土壤的光合碳固定能力和呼吸作用。
（3）比较两种不同基因型水稻的生长状况、产量和抗虫能力。
（4）通过统计分析法探究转Bt基因水稻与传统水稻对稻田土壤的光合碳固定和微生物多样性的影响。
3. 研究意义（1）本研究将为转基因水稻的环境安全性评估提供科学依据。
（2）探究Bt基因水稻对稻田土壤的光合碳固定和微生物多样性的影响，对于认识转基因水稻与传统品种之间的差异、改善农业生态环境具有重要意义。
（3）通过比较两种不同基因型水稻的生长状况和产量，为优化水稻品种选择提供参考。
4. 研究方法和步骤（1）实验样品的采集和准备收集不同生长期的水稻植株以及稻田土壤样品，分别进行处理、保存。
（2）稻田土壤微生物多样性测定利用高通量测序技术对土壤微生物群落的多样性进行分析。
（3）稻田土壤光合碳固定能力和呼吸作用测定利用荧光素二甲酸钠还原法和气体扩散技术测定稻田土壤的光合碳固定能力和呼吸作用。
（4）收集实验数据并进行数据处理记录水稻的生长状况、收获量等要素，并记录土壤微生物多样性数据和土壤光合碳固定数据，进行统计分析和比较。
（5）结果分析和讨论根据实验结果，分析Bt基因水稻与传统水稻对稻田土壤光合碳固定和微生物多样性的影响，探讨转Bt基因水稻的环境安全性评估。
三唑磷在水稻上的残留动态及土壤吸附研究的开题报告
三唑磷在水稻上的残留动态及土壤吸附研究的开题报告
一、研究背景
三唑磷是一种广谱杀菌剂，具有对抗真菌、细菌和病毒等多种病原体的作用。
近年来，随着农业生产的发展，三唑磷被广泛应用于农作物的防治中，其中水稻是三唑磷的主要使用对象之一。
但是，三唑磷作为农药会残留于作物和土壤中，长期的使用会造成环境和健康的潜在危害。
因此，研究三唑磷在水稻上的残留动态及土壤吸附特性具有重要意义。
二、研究目的
本研究旨在探究三唑磷在水稻上的残留动态及土壤吸附特性，为合理使用三唑磷提供科学依据，保障农产品的品质安全和农业可持续发展。
三、研究内容及方法
1.研究三唑磷在水稻表面和内部的残留情况。
对不同浓度和处理时间下的三唑磷喷施水稻的样品进行分析，通过高效液相色谱法检测三唑磷的残留量。
2.研究三唑磷在土壤中的吸附特性。
将不同浓度的三唑磷加入土样，通过静态吸附实验来研究三唑磷在不同类型的土壤中的吸附等活性。
3.对研究结果进行统计分析，探究三唑磷在水稻和土壤中的残留及吸附规律。
四、预期结果
预计本研究可揭示三唑磷在水稻和土壤中的残留和吸附规律，为水稻的农药管理提供参考。
同时，对于三唑磷的使用和环境安全评价也具有一定的指导意义。
五、研究价值
本研究可为三唑磷在水稻上的合理使用和环境保护提供科学依据，同时也可为其他类似农药的使用提供借鉴。
转Bt基因抗虫水稻对褐飞虱主要天敌的潜在风险评价
转Bt基因抗虫水稻对褐飞虱主要天敌的潜在风险评价水稻是世界上最主要的粮食作物之一,每年因为害虫危害造成严重的产量损失。
利用基因工程技术(Gene engineering technology,GET)培育的转基因抗虫水稻很好地控制了鳞翅目害虫对水稻的危害。
然而,转基因抗虫水稻的环境安全性也引起了大众及科学工作者的热切关注。
因此,任何一个新培育的转基因抗虫水稻在商业化种植之前,必须进行严格、系统、科学的环境安全性评价。
转基因抗虫水稻对非靶标植食者昆虫天敌的影响是转基因作物环境安全性评价中至关重要的部分。
T1C-19和T2A-1是2种新培育的转Bt基因抗虫水稻,分别表达cry1C基因和cry2A基因,由玉米泛素启动子驱动,对水稻鳞翅目害虫抗性良好。
本论文拟从基于水稻-褐飞虱-天敌三级营养传递、高剂量Bt蛋白暴露、田间种群动态等方面评价这2种转Bt基因抗虫水稻材料对褐飞虱捕食性天敌黑肩绿盲蝽、草间钻头蛛以及转cry2A基因水稻对褐飞虱寄生性天敌稻虱缨小蜂的生态安全性。
结果如下:1转Bt基因抗虫水稻对捕食性天敌黑肩绿盲蝽的潜在风险评价褐飞虱(Nilaparvata lugens)是转Bt基因稻田主要的非靶标刺吸式害虫,黑肩绿盲蝽(Cyrtorhinus lividipennis)是稻飞虱卵及低龄若虫主要的捕食性天敌。
由于黑肩绿盲蝽可能通过褐飞虱暴露于Bt蛋白,因此评价转cry1C、cry2A基因水稻对该捕食性天敌的安全性是非常必要的。
在本研究中,通过3个实验分别对转cry1C、cry2A基因水稻对黑肩绿盲蝽的生态安全性进行了系统的评价:(1)直接取食实验:将10倍于真实田间暴露量的Cry1C、Cry2A蛋白添加到人工饲料中直接饲喂黑肩绿盲蝽;(2)三级营养实验:Cry1C、Cry2A蛋白通过猎物褐飞虱卵或若虫间接传递给黑肩绿盲蝽;(3)田间实验:通过吸虫器法取样研究转cry1C、cry2A基因水稻对黑肩绿盲蝽田间种群的影响。
褐飞虱的饲养及抗褐飞虱水稻鉴定方法
植物保护 ２０１６年第１１期 褐飞虱的饲养及抗褐飞虱水稻鉴定方法张玮珊１，姜虹芮２，吕建群３，（１．成都七中，四川成都６１００４１；２．成都树德中学，四川成都６１００３１；３．四川省农业科学院作物研究所，四川成都６１００６６）摘 要：本文简述了褐飞虱虫源饲养的基本工具、条件和方法，并对２２份水稻材料进行了褐飞虱抗性基因分子标记检测和网室接虫鉴定。
结果表明，抗飞虱对照材料Ｐｔｂ３３及含有纯合抗虫基因（Ｒ）或杂合抗虫基因（Ｈ）的水稻材料，网室接虫鉴定抗性级别为１～５级，具有较好的褐飞虱抗性；感虫对照ＴＮ１及含有感虫基因（Ｓ）的材料抗性级别为７－９级，均表现为感虫。
关键词：褐飞虱；饲养；抗性鉴定；分子标记；抗虫基因１ 褐飞虱虫源饲养条件及工具褐飞虱的饲养工具主要包括养虫室、养虫架、养虫笼及一些必备的操作用具等。
１．１ 养虫室１５～２０ｍ２温室，装一台冷暖型１．５匹空调机，要求用水用电方便。
１．２ 养虫架用角铁焊置成高１ｍ，长１．２ｍ，宽１．１ｍ支架，置放在地上。
１．３ 养虫笼在养虫架上面放置长宽均为１ｍ，高为１．５ｍ的框架上，再装上４支５０Ｗ节能日光灯。
四周和顶部均为纱网，一面为门且要合缝，以防天敌进入（图１）。
１．４ 饲养盆在市场上购买的长０．８ｍ，宽０．５ｍ，高０．２ｍ的塑料盆。
１．５ 其它用具塑料盒（１０ｃｍ×５０ｃｍ×３ｃｍ）、定时器、培养架等。
１．６ 饲养环境条件温度控制在２６～３２℃，湿度控制在８５％以上。
２ 饲养方法２．１ 饲养苗培育将感虫品种ＴＮ１种子均匀地撒播在事先放有湿润纸巾的塑料盒内，整齐地放在培养架上，盖上薄膜，２～３ｄ后即可出芽。
２．２ 褐飞虱饲养将３叶１心的饲养苗放入塑料盆中，加入适当的水，把褐飞虱虫源放在盆中饲养苗上，经过连续繁殖加代获得充足虫源。
图１ 部分饲养工具３ 抗褐飞虱水稻的鉴定３．１ 抗性鉴定材料以公认的抗飞虱水稻材料Ｐｔｂ３３为抗虫对照，以ＴＮ１为感虫对照，另选择２２份水稻育种材料进行鉴定。
转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策
转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策生命科学研究2009年水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，全球约三分之一以上的人口以水稻为主食，仅中国就有8亿人［1，2］.同时，水稻也是受害虫侵袭最为严重的粮食作物之一.据不完全统计，全世界每年因虫害造成的损失占水稻总产量的5%以上，约为1×106t ［3，4］.特别是近年来，二化螟等蛀茎害虫的发生逐年加重，对水稻生产造成严重威胁.传统化学防治方法的长期使用，不但增加生产成本，造成环境污染，而且破坏了生态平衡，因此选育抗虫水稻是防治害虫最经济、有效的方法，随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用基因工程将外源抗虫基因导入水稻，使水稻自身产生抗虫蛋白从而达到防治害虫的目的已成为现实［5］.目前，国内外已培育出多个高抗水稻螟虫（Cnapha locrocis medinalis ）的转抗虫基因材料，中国的转基因水稻已获准进入田间试验和环境释放［6］，但是由于转入的外源基因并非来自传统的基因库，转抗虫基因植物可能带来生态效应和环境风险问题已成为国际社会关注的焦点.因此，在转Bt （Bacillus thuringien -sis ）基因水稻进入大田试验和商品化生产阶段前进行生态风险性和安全性评价极其必要.1转Bt 基因抗虫水稻的研究进展苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis ，Bt ）是一种广泛存在于土壤中的革兰氏阳性菌，由在芽孢转Bt 抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策王丽冰，刘立军，颜亨梅*（湖南师范大学生命科学院中国湖南长沙410081）摘要：转基因抗虫水稻的商品化种植已成为国内外广泛关注的热点问题.综述了转Bt （Bacillus thuringiensis ）抗虫基因水稻的研究进展、食品安全性、生态安全性以及对转Bt 基因水稻本身的性状变化的影响，并提出了防范策略，以期为转Bt 基因水稻的生物安全性评价和商品化种植提供科学参考.关键词：转Bt 基因抗虫水稻；食品安全性；生态安全性；防范策略中图分类号：S511 文献标识码：A文章编号：1007-7847（2009）02-0182-07Advances on Transgenic Bt Rice and Bio -security and StrategiesWANG Li -bing ，LIU Li -jun ，YAN Heng -mei *（College of Life Sciences ，Hunan Normal University ，Changsha 410081，Hunan ，China ）收稿日期：2008-04-08；修回日期：2008-11-05基金项目：国家自然科学基金资助项目（30570226）作者简介：王丽冰（1981-），女，湖南永州人，湖南师范大学硕士研究生，主要从事分子生态学研究，E -mail ：wlb_lanshan@/doc/ae10050144.html, ；*通讯作者：颜亨梅（1950-），男，湖南安仁人，湖南师范大学教授，博士生导师，主要从事动物生态学研究，E -mail ：yanhm03@/doc/ae10050144.html,.Abstract ：Commercialization of insect -resistant transgenic rice has become an important debatable issue in the world.It summarized influences of the research development ，the food safety ，the ecology security ofthe transgenic Bacillus thuringiensis （Bt ）anti -insect rice as well as character change of the transgenic Bt rice ，and proposed the guard strategies ，which could provide scientific reference in biological safe research and commercialization of the transgenic Bt rice.Key words ：transgenic Bt anti -insect paddy rice ；food safety ；ecology security ；guard strategy（Life Science Research ，2009，13（2）：182～188）第13卷第2期生命科学研究Vol．13No．22009年4月Life Science Research Apr ．2009·综述·第2期形成时产生的具有高度特异性杀虫活性的晶体蛋白所决定，称为杀虫晶体蛋白（Insecticidal crystal protein，ICPs）.ICP常以原毒素形式存在，当昆虫取食ICP后，在昆虫消化道内，在中肠消化酶的作用下，原毒素被活化即降解成具有毒性的多肽，活化的毒素分子与昆虫中肠上皮细胞上的特异受体结合，致使细胞膜产生一些穿孔，破坏细胞的渗透平衡，引起细胞肿胀裂解，使昆虫幼虫停止取食，最终导致死亡.Bt毒素是较早被利用的杀虫剂，它对人、哺乳动物无毒害作用.目前Bt毒素已成为植物基因工程及转基因育种应用中最广泛、最具有潜力和应用前景的抗虫基因.近20年来，Bt基因在水稻中的转化，表达及其转基因植物的鉴定和抗虫性已有许多报道，进展较快.1989年中国农业科学院生物技术中心杨虹等首次报道了用原生质体电融合技术成功地将Bt基因导入水稻“台粳209”［7］，紧接着于1991年谢道昕用花粉管通道技术成功地将Bt基因导入水稻栽培品种“中花11号”.他们所用的Bt基因都是直接从苏云金杆菌中分离纯化得到的，经分子生物学检验，证明Bt基因已整合到水稻基因组中［8］.虽然国内外迄今尚无Bt水稻商品化应用的实例，但获得Bt转基因抗虫植物的报道已有不少［8~16］.1995年与加拿大渥太华大学合作，利用农杆菌介导法成功地将密码子经过优化的Bt杀虫基因Cry1A（b）导入了许多水稻品种［17］，并从粳稻品种秀水11的转基因后代中获得了遗传稳定且对二化螟等8种鳞翅目害虫表现高抗性的Bt转基因抗虫水稻“克螟稻”［18，19］.1996年瑞士苏黎士植物科学研究所Wunn报道了用基因枪法将Cry1A（b）基因导入籼稻“IR58”.在R0、R1、R2代对鳞翅目水稻害虫有明显的抗虫效果，对二化螟，三化螟的最高致死率为100%，并从叶片中检测出Bt蛋白可溶性蛋白0.009%［20］.1997年国际水稻所（IRRI）Ghareyazi报道了用基因枪法得到转Cry1A（b）基因的香粳品系“827”，能表达相对分子质量为67kDa 的毒蛋白，表达量相当于可溶性蛋白的0.1%.T2代植株叶片对一龄二化螟，三化螟有高度抗性［21］.该研究所指出，应用C4PEP羧化酶基因为启动子使Cry1A（b）基因在水稻籽粒灌浆期功能叶片中高效表达，而在水稻籽粒（胚和胚乳）中不表达，这一研究结果对解决人类食用转基因抗虫水稻安全性问题具有开创性意义.1998年，浙江大学与加拿大渥太华大学利用农杆菌介导法将密码子优化的Cry1A基因导入粳稻品种秀水12中，获得的KMD1和KMD2“克螟稻”株系历代植物能够抵抗包括二化螟、三化螟、稻众卷叶螟和大螟等8种水稻害虫的危害，初孵幼虫的致死率高达100%［17］.目前该品种（秀水11）已经农业部审批在浙江省进入生产性试验阶段［19］.由于害虫极易对单个抗虫基因产生抗性，因此将两种或两种以上具有不同杀虫基因导入同一种植物中可有延缓抗性的产生.Cheng等以Ubi基因为启动子，利用农杆菌介导法获得转Cry1A（b）/Cry1A（c）双价抗虫基因水稻［14］.中科院遗传所采用农杆菌介导法将Cry1A （c）和经修饰的CpT1基因共同转入水稻“明恢86”，获得对靶标害虫具有较强抗性的双价抗虫水稻［2］，目前该品种已批准在北京和福建进入环境释放，且产业化形式良好.2转Bt基因水稻的食品安全性随着《农业转基因生物安全管理条例》的实施，转基因植物的安全问题越来越受到社会的广泛关注.尽管目前专家们还无法证明转Bt基因水稻给人类健康和生态环境有害或无害，但很大程度上影响了消费者对转基因食品的接受心理，并进一步阻碍了转Bt基因水稻的商品化.培育转基因水稻品种的最终目的是使转基因水稻进入市场，达到产业化生产，但能否实现此目标，很大程度上取决于它们的环境安全性和食品安全性，即关键要保证转基因水稻对环境和消费者是无害和安全的［22］.水稻是人类的主要食品，将Bt毒蛋白基因导入水稻，在水稻中得到表达，对人类的安全性存在潜在威胁，可以说转基因水稻对人类的安全性是影响推广应用转Bt 基因抗虫水稻的一个至关重要的限制因素［23］.由于Bt杀虫蛋白只能特异地与靶标昆虫中肠上皮细胞的受体结合，在哺乳动物组织中无此类特异性受体，因而不产生毒性.但是除插入基因及其表达产物外，由外源基因表达产物引起的刺激效应及其基因随机插入引起的位置效应，有可能会产生有害的成分［24］.另外，由于人们在构造载体时除目的基因外，还串联一些报告基因和王丽冰等：转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策183生命科学研究2009年选择性标记基因，这些基因表达产物的安全性目前尚无定论［25］.同时，稻米作为人们日常生活中的主食，其消费数量也相当可观，因此有必要对转基因产品进行动物毒理性分析.王忠华等以“克螟稻”米粉为材料进行经口急性毒理试验和大鼠90d喂养试验，结果未见试验动物出现明显中毒症状，大鼠解剖也未见异常病理改变，表明KMD2稻米在≤64g/kg体重的剂量内对哺乳动物是安全的，对蒸煮后的米饭进行ELISA检测，结果未检测到Bt杀虫蛋白，表明蒸煮后稻米中的Bt杀虫蛋白可能发生降解或变性［26］.外源基因的组成型表达是导致转基因作物生产食品安全性风险的重要原因［27］，对于抗虫转基因水稻而言，抗虫基因在转基因稻米中的大量表达是消费者担心的焦点.虽然Bt作为生物杀虫剂在生产中已安全使用了许多年，也没有证据表明Bt毒蛋白对人类产生毒害作用［28］，但是Bt 毒蛋白在转基因水稻种子中的大量表达无疑会给消费者造成一定的心理压力.为此，李永春等利用在水稻中特异不表达，而在水稻其它营养器官中高效表达的特异性启动子序列RSP1和RSP2［29］，构建了抗虫基因Cry1A（c）的3个组织特异性表达载体并用于水稻遗传转化，获得了一批转基因水稻材料.为进一步培育食用安全性较高的转基因抗虫水稻品系奠定了重要基础.由于转基因作物是人造的生命，而不是大自然原有的品种.虽然至今没有任何证据证明转基因食品引发了安全问题，转Bt基因抗虫水稻在实验的过程中也一直没有发现安全问题，但更重要的是，现在并没有一例转基因作物是人类的主粮.面对转基因水稻，我们必须极为谨慎，因为稻米在各年龄层段都是饮食中重要的部分，包括刚断奶婴儿吃的米糕和稀粥.3转Bt基因水稻的生态安全性随着转基因工程技术的飞速发展，转基因水稻从实验室逐渐走向开放环境，转基因水稻可能带来的生态安全性问题也引起了科学家的关注.因为水稻是稻田生态系统的基础，转基因水稻的介入无疑会影响以水稻为基础的整个稻田生态系统.首先，转基因水稻通过食物链对第二营养级植食性昆虫的生长发育和繁殖产生直接影响；其次，对以植食性昆虫为食的寄生或捕食性天敌产生间接影响；最后，转基因水稻本身的物理性状、农艺性状、营养物质、挥发性和非挥发性次生物质等都可能产生非预期的变化，进而对各个营养层的节肢动物种类组成、数量和发生动态产生非预期的影响，从而引起稻田群落结构的变化［5］.3.1转Bt基因抗虫水稻对稻田生物群落的影响大多数情况下，转Cry1A（b）/Cry1A（c）籼稻对稻田节肢动物群落功能团组成及结构无明显的负面影响［30］.在生长发育的前中期，转Cry1A（c）/ CpT1水稻对稻田节肢动物群落产生一些负面作用，但在其它时期对群落没有明显影响［31］.崔旭红等［32］研究表明转Bt水稻对二化螟和三化螟具有高抗性，而对天敌蜘蛛影响不大，对害虫飞虱也没有影响，对中性昆虫和捕食性天敌的影响也不大.这说明转Bt基因水稻对水稻节肢动物群落影响不大，使用转Bt基因水稻并没有影响水稻田间节肢动物的生态平衡.何树林等［33］研究发现，转Bt基因水稻在分蘖期和抽穗期的稻田蜘蛛种类和数量与对照水稻品种无差异.转Bt基因水稻田间水生动物种类有鱼类、虾类、蝌蚪、水生昆虫和田螺等，与对照品种水稻田间水生动物种类和数量组成一致.说明转Bt基因水稻对稻田蜘蛛和水生动物种类、数量无明显影响，转Bt基因水稻对稻田生态系统环境来说初步证明是安全的.陈茂等通过连续3年的调查证实，从Bt稻田区向对照稻田区扩散的飞虱、叶蝉对Bt水稻没有偏好性，它们的卵寄生蜂也存在这一现象.可见Bt基因抗虫水稻并不会引起田间非靶标类群同翅目害虫数量的上升，相反，对这类害虫还有一定的趋避作用［34，36］.现有的研究结果均显示：Bt抗虫基因水稻对非靶标生物无明显负面影响，相反却提高了稻田生态系统的稳定性.这主要是是由于抗虫转基因水稻的种植大幅度减少了农药的使用量，促进稻田种类增多，生物多样性提高.转双价基因Bt/cpti水稻经过2年大田面积田间试验研究，表明该转基因水稻引发非靶标害虫稻飞虱灾变的风险较小；对稻田捕食性节肢动物亚群落的物种数变化的趋势、物种组成、优势种组成及种群数量没有显著影响；并能提高稻田中捕食性节肢动物的发生数量，尤其在水稻黄熟期能显著提高稻田中捕食性节肢动物亚群落的数量，在成熟收割前期能显著提高稻田中捕食性亚群落的物种丰富度［31，35］.因此，就目前研究可知，转Bt基因抗虫水184第2期王丽冰等：转Bt抗虫基因水稻的研究进展和生物安全性及其对策稻并未对稻田生物群落的稳定性产生影响.3.2转Bt基因水稻对土壤微生物群落及酶活性的影响Bt水稻的长期种植可能会使Bt杀虫蛋白在土壤中残留、富集.而土壤生态系统是生物循环和能量转化的重要场所，Bt杀虫蛋白在土壤中的富集可能影响土壤中的特异性生物功能类群及土壤生物多样性.因此，近年来Bt杀虫蛋白在土壤中的残留及其对土壤生态系统的影响逐渐受到国内外研究者的关注.有研究表明，有苏云金芽孢杆菌产生的Bt 蛋白进入土壤后，与土壤粘粒和腐殖酸迅速结合，结合态的Bt蛋白仍然保持杀虫活性，而且不易被土壤微生物分解，保持杀虫活性的结合态Bt蛋白在土壤中存留时间至少可达234d［37］.土壤酶活性反映了土壤中各状况密切相关.目前，有关转Bt基因作物对土壤生态功能影响的报道极少.吴伟祥等［38］在实验室条件下发现Bt 水稻秸秆种生物化学过程的强度和方向，是土壤微生物生态系统重要的生物学特性.土壤中的脲酶，磷酸酶、脱氢酶、纤维素酶、蔗糖酶和芳香硫酸酯酶等与土壤中的N、P、S、C等营养元素循环及植物营养对土壤蛋白酶、中性磷酸酶、脲酶的活性无显著影响，但对脱氢酶活性具有明显促进作用.孙彩霞等［39］实验发现，Bt水稻生长15d时，土壤脲酶的活性显著下降，土壤酸性磷酸酶的活性显著提高，而土壤芳香硫酸酯酶、蔗糖酶和脱氢酶活性的变化差异不显著；生长30d时，土壤脲酶的活性仍限制下降，土壤酸性磷酸酶、芳香硫酸酯酶和脱氢酶的活性显著升高，而土壤蔗糖酶活性的变化差异仍不显著.这种差异的产生可能是由于外源Bt基因插入水稻染色体中的某一位置引发不同生长发育阶段基因表达的多效性，进而引起水稻秸秆化学组成的变化所致.王洪兴等［40］研究了转基因水稻及其亲本秸秆在降解过程中对土壤微生物主要类群的影响，发现转Bt基因水稻细菌数量显著低于非转基因处理，转基因水稻真菌数量则显著高于非转基因和对照，放线菌数量则没有明显变化规律，非转基因秸秆降解反硝化细菌活性高于转基因，而解磷微生物活性处理之间无明显差异.3.3转Bt基因水稻花粉对昆虫的影响家蚕是我国重要的经济昆虫，有研究表明，家蚕取食了用Bt基因水稻花粉处理的桑叶后，对其致死率没有太大的影响，但对其体重和中肠细胞亚显微结构有一定影响［41，42］.但上述试验是室内处理剂量，实际稻桑工作环境下家蚕接触花粉的量远远小于室内处理剂量，可能不会造成太大影响.4转Bt基因水稻对昆虫产生抗性的影响苏云金杆菌杀虫剂在农业上的应用已有几十年的历史，由于Bt基因植物体内持续表达，害虫在整个生长周期都受到Bt杀虫蛋白的选择，将促使害虫对转基因植物产生相应抗性.害虫对转基因植物的抗性发展，不仅会削弱转基因植物本身的效益，而且会导致杀虫剂的再次大量使用，对环境产生负面影响.已知至少10种蛾类、2种甲虫和4种蝇类在实验室对Bt毒素产生了抗性，但在大田中仅有小菜蛾（Plutellaxylostella）对此毒蛋白产生了耐受性［43］，主要原因是Bt毒蛋白作用时间短，保留性低，使得选择压力小.有多项研究表明：敏感昆虫如一直以Bt植物为食会引起极高的致死率，从而达到防治害虫的目的；但另一方面，高杀死产生高的选择力，抗性产生和发展的速度与选择压力成正比关系，一旦害虫产生抗性，将对转Bt基因水稻的田间防治效果和可持续应用构成严重的威胁［44］.5转Bt基因水稻本身的性状变异对转Bt基因水稻的研究不仅需要关注其与近缘物种的基因流、害虫抗性以及非目标生物和生态系统的影响等问题，也要重视转Bt水稻本身生理生化特性的变化.不少文献报道了转基因植物会产生一系列性状变异.Lynch等［45］报道了转基因水稻表现出植株变小，花期推迟，育性降低等变异.吴刚等发现转Cry1A（b）、Cry1A（c）Bt基因的水稻在室温及田间生长条件下，与对照相比，在株高、穗长、单株粒重、百粒重和结实率等方面都显著降低，而单株有效分蘖数增多，生育进程推迟，落粒性增强.转基因植物性状变化除了由无性变异引起外，还由于外源基因的导入破坏了受体基因的活性，影响了受体植物的代谢过程，使表型发生了改变.所以在进行转Bt基因育种时，根据育种目标，选择优良表现型且较强杀虫活性的转基因植物，对于创造具优良性状的抗虫植物至关重要.185生命科学研究2009年贾乾涛等［46］报道了转Bt基因水稻中16种氨基酸，除叶片中蛋氨酸含量高于常规水稻外，其余氨基酸含量及其总量均低于常规水稻且绝大多数差异性显著，而茎杆中，转Bt基因水稻除组氨酸含量差异不显著外，蛋氨酸、酪氨酸、赖氨酸和脯氨酸含量与常规水稻差异性显著，其余氨基酸含量差异性均极显著.分析造成这种现象的原因可能是转Bt基因水稻中Bt基因的插入影响了水稻的生理生化反应，从而影响了氨基酸含量的变化及其表达.贾乾涛等［47］还对Bt水稻不同生长期几种重要成分的含量研究发现，在大部分生长期，Bt水稻和非Bt水稻氮、磷和硅的含量差异显著或极显著，但它们的变化趋势基本一致，氮和磷的含量在拔节期之后均呈下降趋势，而硅的含量则随水稻的生长发育呈上升趋势；在水稻生长前期，Bt水稻可溶性糖和还原性糖的含量不非Bt水稻低，但在后期比非Bt水稻高，且差异均显著或极显著，这表明Bt基因的插入使水稻的生理生化过程发生了变化，从而造成了生化物质含量的差异，但是这种变化究竟是与Bt基因有关还是与启动子有关或基因插入的位点有关尚待进一步深入研究.6展望目前的研究大多停留在实验室水平，而转Bt 基因水稻释放的现实环境为大田，因此有必要开展大田条件下的综合研究.将室内与大田研究相结合，更能反映实验室结果的可靠性与真实性，由于大田条件下影响影子繁多（如土、肥、气、热和水等），加大了研究的难度.但随着新技术与方法的不断引入和研究力度的加大，必将加快这方面的研究进程，从而使转基因植物朝着有利于人类生存与发展的方向前进.转Bt基因水稻的研究为防治害虫提供了一个较为经济便捷的途径，但转Bt基因水稻田是一种比较特殊的生态系统，它对鳞翅目害虫的控制，会使得其田间的物种的种类，节肢动物的优势度发生变化.因此转基因水稻对环境安全性的影响还需要更深入和长期的研究.对于转Bt基因水稻而言，目前在田间还未发现对Bt杀虫蛋白产生抗性的害虫类型，但这并不表明抗虫转基因水稻在靶标害虫的抗性上没有生态风险，昆虫成虫的移动和交配的细节是一定困难的，需要数年的跟踪和数据的积累.转Bt基因水稻通过食物链的传递是否对生态环境产生影响，必须通过其在生态系统中长期积累和级联放大效应才能最终显现出来，因此需要进行长期延续不断的调查研究.任何新技术都存在不同程度的风险，因此，不能因为暂时还没有发生转基因植物危害人畜和生态环境的案例而忽视其安全性问题，在转Bt 基因水稻投放市场前必须经过科学、严谨和长期的安全性评价.其生物安全性对策是：1）坚持“实质等同性”原则.对环境和生态系统进行长期的跟踪研究，确认其生物安全性.2）采用“终止子技术”.使Bt水稻收获的种子在诱导剂作用下不能育种.3）“高剂量”和“避难所”策略相结合.因高剂量能杀死大多数的抗性杂合子，且庇护所的代价小，易被农民接受.同时，避难所可以去除昆虫对Bt杀虫晶体蛋白产生的抗性基因，防止抗性等位基因在昆虫群体中固定，并且可以稀释昆虫群体中产生的抗性.4）“多基因”策略.针对Bt杀虫晶体蛋白只对某一种或几种害虫具有毒杀作用，而且害虫对Bt杀虫晶体蛋白产生抗性的问题，可以采用两种以上不同的对昆虫无交互抗性的Bt杀虫晶体蛋白基因转化植物或者使用Bt杀虫晶体蛋白和其它不同杀虫机理的杀虫蛋白组合，同时或分别导入同一受体植物内，避免昆虫产生抗性.总之，为了使转Bt基因水稻能早日得到推广，同时又保证安全，科研人员还需要在安全性方面着手，力争从转Bt基因水稻对人类、环境、生态等方面多层次、多角度地进行研究，以确保生物技术的健康发展.参考文献（References）：[1]杨友才，周清明.转基因水稻研究进展[J].湖南农业大学学报（自然科学版）（YANG You-cai，ZHOU Qing-ming.Adv- ances of the research on rice gene transformation[J].Journal ofHunan Agricultural University），2003，29（1）：85-88.[2]朱祯.高效抗虫转基因水稻的研究与开发[J].中科学院院刊（ZHU Zhen.Research and development of highly insert-resistant transgenic rice[J].Bulletin of the Chinese Academy of Sciences），2001，（5）：353-357.[3]HERDT R W.Research priorities for rice biotechnology//KUSHG S，TOENNIESSEN G H.CAB International.Philipippines：Wallingford/IRRI，Los 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Pei-chong.Bacillusthuringiensis insecticidal gene into cultivated rice varieties in China on the11th to spend to obtain transgenic plants[J].。
DNA shuffling技术改造Bt基因的水稻转化研究的开题报告
DNA shuffling技术改造Bt基因的水稻转化研究的开题报告一、研究背景与意义Bt基因是获得普遍应用的一种生物化学杀虫剂，作用于昆虫幼虫的肠胃道，具有广谱性杀虫作用、高效性、低毒性和环境友好等优点。
利用转基因技术将Bt基因转化到水稻中，可以提高水稻对虫害的抗性，减少农药使用，降低环境污染并提高农产品品质和增产效果。
然而，因为单一Bt基因容易出现昆虫对其的抗性，为了延缓农田昆虫抵御Bt水稻的能力，需要不断开发新的耐抗性基因。
目前，常用的Bt基因转化方法大多是常规枯草芽孢杆菌转化、等电点异电聚焦法和基因枪法等。
这些方法虽然可以实现Bt基因在水稻中的成功转化，但是转化效率低、转化后的品种稳定性差、易出现基因副作用等问题。
为此，本研究借助DNA shuffling技术，通过对不同来源的Bt基因进行分子重组和随机组合，创造新的高效的杀虫蛋白，为水稻提供更多的耐抗性基因，以提高转基因水稻的抗虫能力和稳定性。
二、研究内容和方案（一）研究内容本研究的主要内容包括：1. 对不同来源的Bt基因进行PCR扩增、酶切、互补杂交、DNA shuffling，创造新的Bt基因库。
2. 对DNA shuffling后的基因库进行基因克隆和序列确证，筛选出具有高效杀虫活性的基因。
3. 将筛选得到的Bt基因与载体进行重组，构建转基因水稻。
4. 对转基因水稻种子进行PCR鉴定和Western blot分析，确保转化效果和稳定性。
5. 对转基因水稻的虫害抗性、田间生长特性和农产品质量进行系统评价。
（二）研究方案1. 实验材料准备本研究使用的实验材料有枯草芽孢杆菌、含Bt基因的质粒、不同来源的Bt基因片段、PCR试剂盒、酶切试剂盒、大肠杆菌DH5α、感受态细胞（E. coli BL21）、腺病毒载体、昆虫细胞系、水稻品种等。
2. Bt基因PCR扩增和酶切将不同来源的Bt基因片段进行PCR扩增，利用酶切试剂盒在适当的位置利用限制酶切割，实现基因片段切割和互补杂交。
溴氰菊酯诱导果蝇细胞毒性及相关基因表达的变化
溴氰菊酯诱导果蝇细胞毒性及相关基因表达的变化焦东旭;李娜;程晨;葛春男;程罗根【摘要】溴氰菊酯( deltamethrin,DM)是一种神经毒剂,由于其高效、低毒而被广泛用于农业害虫的防治。
长期大范围不合理的使用导致害虫产生抗药性,但目前其确切的抗药性作用机制仍不十分清楚。
本研究对溴氰菊酯细胞毒性的研究显示DM 染毒可以使果蝇Kc细胞增殖、细胞形态和细胞活性发生明显变化。
较低和较高浓度的DM能明显抑制细胞活性,在15 ppm诱导下果蝇细胞的活性有一定程度的升高。
实时荧光定量PCR和免疫印迹分析结果显示,经DM处理后的果蝇Kc细胞中与氧化应激反应和免疫相关的基因的表达量显著上调。
本研究对细胞毒性和基因表达差异的检测,为进一步探讨与溴氰菊酯抗药性相关的细胞和分子毒理提供了研究基础。
%Deltamethrin( DM) is a kind of nerve agent,and commonly used in controlling crop pests,because of the high efficacy,low toxicity. Widespread and improper use of DM induced insect resistance,but the resistance mechanism is not clear at present. Cytotoxicity analysis reveals that the cells proliferation, cellular morphology and cells viability have significant changes under DM stress. Too Low or too high concentration of DM could obviously inhibit the activity of cells. Under 15 ppm treatment, cell activity was higher. Real-time quantitative PCR and western-blotting analysis demonstrated that the genes associated with oxidative stress and immune responses were induced sharply under DM stress. Our research focuses on the cytotoxicity and gene differential expression,these results can provide basis for the study of molecular toxicology and mechanism of deltamethrin resistance.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2014(000)002【总页数】6页(P106-111)【关键词】溴氰菊酯;细胞毒性;实时荧光定量PCR;免疫印迹分析【作者】焦东旭;李娜;程晨;葛春男;程罗根【作者单位】南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023;南京师范大学生命科学学院，江苏南京210023【正文语种】中文【中图分类】S481+4溴氰菊酯是杀虫活性高、击倒速度快、杀虫谱广、对人畜低毒的一类杀虫剂，因此在防治卫生害虫和农作物害虫中占有重要地位［1］.长期大量不合理使用杀虫剂会导致害虫抗药性的产生与发展，代谢抗性是重要的抗性机制.昆虫的代谢抗性主要是昆虫在杀虫剂的选择压力下，诱导体内解毒酶基因的扩增和过表达，使得代谢酶的活性显著提高，加速体内杀虫剂的代谢使其变成低毒或无毒物质，由此产生对杀虫剂的抗性［2］.昆虫体内代谢解毒酶主要有以下三类:谷胱甘肽S－转移酶，P450单加氧酶，酯酶［3］.溴氰菊酯的代谢是多种基因，多种信号通路协同相互作用来实现的.近年来有关杀虫化合物诱导的昆虫细胞毒性作用的文献报道渐多，其中杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导作用引起的细胞形态和细胞活性是关注的重点，戴璇颖等［4］采用荧光染色、单细胞凝胶电泳、流式细胞仪等技术研究认为，莠去津浓度处理家蚕卵巢培养细胞后24 h可诱导产生明显的细胞凋亡等一系列细胞形态的变化，且有明显的时间—剂量效应，方心葵等［5］报道氰戊菊酯以25μmol/L处理粉纹夜蛾离体细胞(Tn)时，细胞死亡与凋亡数明显高于对照.田间获得的和室内筛选的杀虫剂抗性昆虫品系高表达一系列的解毒基因，表明抗药性与解毒基因表达之间具有相关性［6，7］.在杀虫剂胁迫下会引起昆虫体内的应激反应，进而诱导复杂的、特异的调控机制，其中包括对关键杀虫剂代谢基因的转录调控［8］.许多研究已经报道杀虫剂胁迫下基因转录水平的变化，在家蝇体内CYP6D1基因的过表达导致其对拟除虫菊酯的抗药性［9］.在K+去极化条件下，分析溴氰菊酯对敏感、抗性家蝇品系脑突触体释放神经递质去甲肾上腺素的影响.结果表明家蝇对溴氰菊酯的抗性与Na+通道的亲和性降低有关［10］.进一步寻求农药抗性防治的可能途径和靶点是本研究的重点.Kc细胞系是从果蝇卵巢中分离而建立的离体培养昆虫细胞系，是深入研究活性物质作用机制的理想实验材料，本研究以果蝇Kc细胞为模式系统，研究在溴氰菊酯胁迫下，果蝇细胞的细胞毒性、形态学分析以及相关基因表达量的变化，并通过mRNA水平实时定量PCR和蛋白水平的免疫印迹分析对涉及氧化还原反应和免疫反应的基因进行检测和分析，为昆虫抗性机理研究和抗性防治工作提供新思路和新途径.1 材料与方法1.1 材料1.1.1 试剂溴氰菊酯(纯度≥98%)购自上海农药研究所，以二甲基亚砜(DMSO)溶解，0.2 μm 滤膜过滤，制备浓度为100 ppm的储备液，并用DMSO稀释成6个浓度梯度:5ppm，10 ppm，15 ppm，20 ppm，30 ppm，50 ppm备用;无血清昆虫细胞培养基(SH30278.02)购自Thermo生物公司;CCK－8试剂盒购自Dojindo公司;TRIZOL试剂购自Invitrogen公司;PrimeScript®RT reagent Kit和SYBRGreenⅠ购自Takara公司;引物由上海生工股份有限公司代为合成.BCA蛋白定量试剂盒购自上海捷瑞生物有限公司，Anti－NOS和Anti－SOD以及辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG均购自abcam公司，Ultra ECL显色试剂盒购自浙江杭州联科生物有限公司，硝酸纤维素膜(NC膜)购自美国Millipore公司.其他未特别注明均为分析纯试剂和常规耗材，细胞继代培养、冻存复苏按常规方法进行.1.1.2 细胞果蝇Kc细胞由东南大学生命科学研究院韩俊海教授课题组惠赠，在无CO2，28℃细胞培养箱中培养，该细胞是半贴壁细胞，细胞形态为均匀圆形，个别呈双极梭型.培养基为无血清昆虫细胞培养基，每隔3 d～4 d更换一次.1.2 方法1.2.1 细胞传代培养用无血清昆虫细胞培养基培养果蝇细胞，每隔3 d～4 d更换一次.传代过程中，先吸除上清培养基，然后加入新鲜培养基反复轻轻吹打，尽量降低对细胞的化学和机械损伤，使半贴壁的果蝇细胞完全悬浮，然后转入新的6 cm培养皿中继续培养.待细胞生长稳定后，更换新的培养基，将Kc细胞制成单细胞悬液，以1×104个/100 μL/孔接种于96孔板，于28℃无CO2细胞培养箱中培养24 h，使细胞处于对数生长期.1.2.2 溴氰菊酯诱导果蝇细胞用二甲基亚砜(DMSO)将溴氰菊酯母液稀释成一系列的浓度梯度(5 ppm，10 ppm，15 ppm，20 ppm，30 ppm，50 ppm).上述96孔板的细胞在28℃培养24 h后分别加入2 μL一系列不同浓度的溴氰菊酯，每个药物浓度组设3个复孔，空白对照组亦设3个复孔(只加100 μL培养基).加药后重新放至细胞培养箱中，相同条件下培养24 h.1.2.3 倒置显微镜下细胞形态特征变化形态学变化是果蝇细胞在DM胁迫下最易观察到的现象，通过倒置显微镜可清晰观察到细胞的形态特征及生长状况，是初步判断细胞活性的最常用最直观依据.挑选经DM诱导后细胞活性较高的处理组放在倒置显微镜下(目镜10×物镜20×)观察记录处理24 h后细胞的形态特征变化.1.2.4 细胞毒性检测加药24 h后，每孔加入10 μL CCK－8试剂(Dojindo，Japan)，28℃孵育4 h后在酶标仪上检测各孔的光吸收值，选择波长450 nm;与对照组相比，利用下列公式计算细胞相对存活率.细胞活力(%)=［A(加药)－A(空白)］/［A(不加药)－A(空白)］×100%.式中，A(加药):具有细胞、CCK－8溶液和药物溶液的孔的吸光度;A(空白):具有培养基和CCK－8溶液而没有细胞的孔的吸光度;A(不加药):具有细胞和CCK－8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度.1.2.5 溴氰菊酯诱导细胞相关基因mRNA表达量的变化将果蝇细胞分为实验组和对照组，实验组以终浓度15 ppm的溴氰菊酯处理细胞，对照组不加溴氰菊酯而给予等体积DMSO处理细胞，其余同实验组.另外再设正常果蝇细胞不加溴氰菊酯也不加DMSO作为空白对照组.1.2.5.1 细胞总 RNA 提取将3组细胞悬液转移到离心管中，4℃、8 000 r/min离心2 min，弃上清.向每107个细胞中加入1 mL～2 mL的Trizol，用移液枪反复吹吸直至裂解液无明显沉淀，室温静置5 min，加入200 μL氯仿，用力颠倒混匀，室温静置5 min，吸取上清转移到另一新的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀后静置10 min，4℃、13 000 r/min离心15 min，弃上清.加入1 mL的DEPC水清洗沉淀，4℃、13 000 r/min离心5 min，弃上清，干燥沉淀，溶于适量的DEPC水中至RNA完全溶解并进行凝胶电泳检测其纯度和完整性.1.2.5.2 实时荧光定量PCR检测基因mRNA表达量的变化按照PrimerscriptTMRT reagents kit(TaKaRa，Japan)操作说明进行cDNA第一链的合成，反应体系如下:反转录反应条件:37℃ 15 min，85℃ 5 s.5×PrimerscriptTMbuffer 2 μL PrimerscriptTMRT enzyme MixⅠ0.5 μL Oligo dT primer 0.5 μL Random 6 mers 0.5 μL Total RNA 500 ng RNAase free H2O 加至10 μL利用合成的cDNA为模板，以18S rRNA为内参标准基因，根据FlyBase中已有的果蝇基因序列，用Primer Primer 5.00设计并合成目的基因和内参基因的引物.实时荧光定量PCR反应体系为25 μL，根据SYBRGreenⅠ试剂盒的说明书按步骤进行操作，为保证结果的可靠性，重复实验3次.HO－1、NOS、PGRP－LD、18S rRNA 特异性荧光定量引物序列如下:1Nitric oxide synthase(Nos) TTTGGACGCGCCTTATCGAA TGTTAGACTCACCTGTGCATTGA 2 Heme oxygenase－1(HO－1) ATGTCAGCGAGCGAAGAAAC GTCATCAGAAAGGGCAAGTG 3 Peptidoglycan recognition protein LD(PGRP－LD) GCTGCCCTACAACTTTCT CCATCACCAACGAGTCTATT 4 18S rRNA CGGCTACCACATCTAAGGAA GCTGGAATTACCGCGGCT1.2.6 免疫印迹分析相关蛋白表达量的变化为了进一步鉴定溴氰菊酯胁迫下相关蛋白质表达量的变化情况，进行以下Western blotting实验.1.2.6.1 蛋白样品的提取和制备根据总蛋白提取试剂盒的说明书，按步骤分别从15 ppm处理、DMSO处理和未被处理的正常果蝇细胞中提取蛋白质，所有提取蛋白质的操作都在冰上进行.然后用BCA定量方法确定蛋白质的浓度.取20 μg～100 μg的总蛋白，加入同样体积的2×蛋白上样缓冲液，于沸水中煮5 min(高温使蛋白质变性，伸展结合SDS)，然后6 000 r/min离心2 min，取上清待用.1.2.6.2 Western blotting 分析用上海天能公司的电泳仪EPS－300对蛋白进行SDS－PAGE电泳，分离胶为12%，浓缩胶为4%.电泳完毕后将胶剥离，然后电转印到NC膜上.转膜后，经Western blotting封闭液室温振荡，取下NC膜，TBS短暂漂洗后经5%的脱脂牛奶室温封闭1 h，TBST 漂洗3 次后与Anti－SOD，Anti－NOS(NOS 1 ∶1 000，Sod－1 1 ∶1 000)多抗4℃孵育过夜，次日TBST漂洗3次，与辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG(1∶5 000)孵育1h，最后TBST洗膜3次.按Ultra ECL试剂盒的说明，来进行显色反应，在暗盒内曝光拍照.利用Image J software分析图片的灰度值，并进行统计学分析.各实验组待测蛋白的表达水平用与对照组待测蛋白的平均表达水平的比值表示.1.2.7 统计分析采用SPSS 12.0软件进行应用单因素方差分析和最小显著差法分析.2 结果与分析2.1 溴氰菊酯诱导的细胞形态的变化正常细胞形态规则，生长状态良好，细胞长势一致，排列紧密，大部分处于贴壁状态(图1(a)).溴氰菊酯处理果蝇Kc细胞24 h，低浓度组细胞形态与正常Kc细胞相比无明显变化，但细胞密度较对照组低;高浓度处理时细胞发生明显的形态特征的改变(图1(b))，细胞增殖缓慢，贴壁细胞明显减少，能够贴壁的细胞多有出泡现象，多数细胞飘浮聚集成团.图1 溴氰菊酯诱导的果蝇Kc细胞的倒置显微形态特征变化Fig.1 Morphological changes in Kc cells induced by DM observed by inverted phase contrast microscope(a)正常Kc细胞形态:小的，圆形，表面光滑.(b)15 ppm处理后细胞形态变化，有皱缩(A)，出泡(B)，细胞表面不光滑(C).(a)The morphology of normal Drosophila Kc cells:small，round cells and smooth edge.(b)After 15 ppm DM treatment we observed the distinct morphological features，such as shrinkage(A)and blebbing(B)，the edge was not smooth(C).2.2 溴氰菊酯诱导的细胞毒性的变化细胞毒性分析发现，在5 ppm～50 ppm DM的浓度范围内细胞活性先大幅度降低后出现升高，说明较低和较高浓度的DM都能明显抑制细胞活性，并具有浓度依赖性(图2).在15 ppm处理细胞时，细胞活性达到较高水平，随着农药浓度的增高细胞活力显著降低.2.3 溴氰菊酯诱导基因表达量的变化经不同浓度的DM处理后，提取细胞内的总RNA进行凝胶电泳检测其纯度和完整性(图3)，将RNA反转录成cDNA进行实时荧光定量检测，结果表明一定浓度的DM诱导果蝇细胞内血红素加氧酶(HO－1)的mRNA的表达量显著上调，其中15 ppm浓度处理后的细胞上调水平较明显，这和细胞毒性检测结果一致，进一步说明了15 ppm可作为适合的处理浓度.实时荧光定量结果显示，15 ppm浓度处理后细胞内的一氧化氮合酶(NOS)和肽聚糖识别蛋白(PGRP－LD)的mRNA的表达量也出现了显著上调(图4)，这种基因表达量的变化和细胞活力的变化呈正相关. 图2 CCK－8试剂盒对细胞毒性的检测Fig.2 Cytotoxicity assay using CCK-8 kit 用一系列浓度梯度的溴氰菊酯处理果蝇细胞24 h后检测细胞的存活率.实验重复3次.Drosophila Kc cells were treated with DM for 24 h and measured the viability after treatment.The same experiment was done for three times.图3 总RNA的1%琼脂糖凝胶电泳检测Fig.3 The total RNA to electrophoresis on a 1%agarose gel3 μg的总RNA用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，溴化乙锭染色显示其相对浓度和完整性.3 μg of the tota l RNA to electrophoresis on a 1%agarose gel and then stained with ethidium bromide to determine the relative intensities and the integrity.图4 溴氰菊酯诱导果蝇Kc细胞基因mRNA的表达量变化Fig.4 mRNA expression changes of Drosophila Kc cells induced by DM(A)不同浓度溴氰菊酯处理后HO－1 mRNA表达量的变化;(B)15 ppm浓度诱导PGRP－LD和NOS mRNA表达量的变化.(A)HO－1 mRNA expression changes after different concentrations of DM treatment.(B)PGRP－LD，NOS mRNA expression changes under 15 ppm DM stresses.2.4 溴氰菊酯诱导蛋白质表达量的变化Western blotting结果显示，在15 ppm的溴氰菊酯胁迫下，细胞内超氧化物歧化酶(Sod)和一氧化氮合酶(Nos)的表达量显著上调(图5)，这2种酶主要参与细胞内的氧化还原反应，保护细胞免受过氧化反应的损伤.图5 免疫印迹分析差异基因在蛋白水平的表达Fig.5 Western blotting analysis of differential gene expression at the protein level(A)表示分子量为18 kDa 的超氧化物歧化酶的印迹分析;(B)表示分子量为155 kDa的一氧化氮合酶的印迹分析.正常未被处理细胞(Kc)和溶剂(DMSO)处理组作为对照组，GAPDH作为内参.(A)Representative immunoblot of Sod，which has a molecular weight of 18 kDa.(B)Representative immunoblot of Nos，molecular weight of 155 kDa.Kc and DMSO were seen as control.Western blot for GAPDH，a cytoplasmic marker，was used to internal control.3 讨论用倒置显微镜观察溴氰菊酯胁迫下细胞形态的变化，直观快速判断农药是否具有明显的昆虫细胞诱导效果，结合细胞毒性检测初步确定一种较为合适的溴氰菊酯处理浓度.研究表明，溴氰菊酯对果蝇细胞具有明显的增殖抑制作用，细胞形态发生显著变化，影响细胞骨架结构，使细胞的贴壁粘附能力降低.溴氰菊酯对细胞的增殖抑制作用可能是影响害虫生长发育的原因之一，细胞是构成果蝇个体的基本单位，是生物体进行物质和能量交流的主要场所.细胞活力与状态直接影响昆虫的生命活动.细胞形态及骨架的变化可能是由于细胞微管和微丝结构受到影响，由微管蛋白组成的纺锤丝也受到影响，使细胞的有丝分裂受到抑制.复制后的染色体不能分开而造成细胞膨大，从而影响细胞的正常功能.根据CCK－8试剂盒细胞毒性检测结果显示在15 ppm浓度处理下细胞活性较10 ppm时明显增高，可以推测15 ppm处理时DM诱导了一系列与药物代谢相关的基因的表达，进而启动复杂的解毒机制，加速代谢进入昆虫体内的杀虫剂，由此产生对杀虫剂的抗性［11］.在细胞水平我们发现细胞能抵抗溴氰菊酯的胁迫而出现活力增强的现象，RT－qPCR结果也显示经不同浓度处理后HO－1、NOS、PGRP－LD mRNA的表达量均显著上调，Western blotting分析结果显示Sod 和Nos的表达量也显著上调.血红素加氧酶(Heme Oxygenase，HO)是催化血红素在体内氧化降解的限速酶，维持血红素代谢平衡，其在氧化应激中具有重要作用［12］.超氧化物歧化酶和一氧化氮合酶主要参与细胞内的的氧化还原反应，其亲电子效应可以通过清除活性代谢物保护细胞免受氧化应激和脂质过氧化反应，在外源化合物代谢和保护机体免受过氧化损伤作用中发挥着重要作用［13］.肽聚糖识别蛋白(PGRP－LD)主要参与细胞内的免疫反应，识别外源化合物，启动细胞内的免疫信号通路抵御外界侵袭［14］.昆虫在外环境胁迫下可诱导HO－1、NOS和SOD的大量表达，值得注意的是胁迫的共同点是能造成氧化应激，进而促使转录因子与抗氧化反应原件相结合，启动HO－1等基因的大量表达［15］，最终激活包括氧化还原反应在内的一系列的代谢反应，加速杀虫剂在体内的代谢降解，使昆虫对杀虫剂的敏感性降低.由此可以推测，昆虫抗药性可能是由氧化应激反应和免疫反应等多种机制协同交互作用来实现的，具体的机制有待后续试验进一步研究. 本研究以果蝇Kc细胞为模型，作为模式生物果蝇的基因组已经研究的比较清楚，有比较完善的基因数据库，为研究与杀虫剂代谢相关的基因谱系及其相关功能提供了保障.同时该模式系统的研究结果也为其他昆虫抗性的研究提供重要参考.在细胞水平上研究了溴氰菊酯对昆虫的生长发育抑制和对细胞的毒性作用，表明适当浓度的溴氰菊酯能诱导细胞表达大量的与杀虫剂代谢相关的基因来抵抗外界压力，为后续基因表达谱的检测奠定了基础.杀虫剂胁迫下诱导的上调基因的发现为进一步阐明杀虫剂抗性的分子机制和建立抗药性检测方法提供了新的科学依据，具有重要的理论意义和潜在的实际应用价值.［参考文献］［1］ Casida J E，Gammon D W，Glickman A H，et al.Mechanisms of selective action of pyrethroid insecticides［J］.Annual Review of Pharmacology and Toxicology，1983，23(1):413－438.［2］邢剑飞，刘艳，颜冬云.昆虫对拟除虫菊酯农药的抗性研究进展［J］.环境科学与技术，2010，33(10):68－74.［3］ Chen X G，Mathur G，James A A.Gene expression studies in mosquitoes［J］.Advances in Genetics，2008，64:19－50.［4］戴璇颖，徐世清，陈息林，等.环境激素阿特拉津对家蚕卵巢培养细胞(BmN)凋亡的影响［J］.蚕业科学，2006，32(4):495－499.［5］方心葵，王朝霞，陆敏，等.氰戊菊酯对Trichoplusiani细胞活力的影响［J］.西北农林科技大学学报:自然科学版，2006，34(4):101－104.［6］ Daborn P J，Yen J L，Bogwitz M R，et al.A single P450 allele associated with insecticide resistance in Drosophila［J］.Science，2002，297(5 590):2 253－2 256.［7］ Bogwitz M R，Chung H，Magoc L，et al.Cyp12a4 confers lufenuron resistance in a natural population of Drosophila melanogaster［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2005，102(36):12 807－12 812.［8］ Perry T，Batterham P，Daborn P J.The biology of insecticidal activity and resistance［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，2011，41(7):411－422.［9］ Tomita T，Scott J G.cDNA and deduced protein sequence ofCyp6D1:the putative gene for a cytochrome p450 responsible for pyrethroid resistance in house fly［J］.Insect Biochemistry and Molecular Biology，1995，25(2):275－283.［10］冯国蕾.神经递3H－去甲肾上腺素释放与家蝇对拟除虫菊酯抗性的关系［J］.昆虫学报，2002，45(2):204－208.［11］ Misra J R，Horner M A，Lam G，et al.Transcriptional regulation of xenobiotic detoxification in Drosophila［J］.Genes and Development，2011，25(17):1 796－1 806.［12］ Maines M D.The heme oxygenase system:a regulator of second messenger gases［J］.Annual Review of Pharmacology and Toxicology，1997，37(1):517－554.［13］ Zou S，Meadows S，Sharp L，et al.Genome－wide study of aging and oxidative stress response in Drosophila melanogaster［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences，2000，97(25):13 726－13 731.［14］Söderhäll K，Cerenius L.Role of the prophenoloxidase－activating system in invertebrate immunity［J］.Current Opinion in Immunology，1998，10(1):23－28.［15］ Gong P，Hu B，Stewart D，et al.Cobalt induces heme oxygenase－1 expression by a hypoxia－inducible factor－independent mechanism in Chinese hamster ovary cells regulation by Nrf2 and MafG transcription factors［J］.Journal of Biological Chemistry，2001，276(29):27 018－27 025.。
水稻抗褐飞虱基因SCAR标记的获得
水稻抗褐飞虱基因SCAR标记的获得武波;韦东;欧倩【期刊名称】《广西植物》【年(卷),期】2006(26)6【摘要】采用282个随机引物对药用野生稻1665和栽培稻桂99远缘杂交的抗褐飞虱近等基因系B3F4分离群体的不抗池DNA和抗池DNA进行了特异性RAPD标记筛选,从中筛选到一个具有明显的特异性扩增带谱的RAPD标记S1159,序列分析表明,S1159序列长度为1 408 bp,与基因库中已报道的水稻第四号染色体的BAC克隆(编号OSJNBa0070O11)序列(67114-69100)有51.86%的同源性.为了提高所找到的RAPD标记S1159在应用上的稳定性,将RAPD标记转化为SCAR标记检测近等基因系群体,结果表明与RAPD标记结果一致,说明该研究得到的RAPD标记具有较好的稳定性和重复性,为进一步的研究打下了良好的基础.【总页数】4页(P617-620)【作者】武波;韦东;欧倩【作者单位】广西大学,生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西大学,生命科学与技术学院,广西,南宁,530005;广西大学,生命科学与技术学院,广西,南宁,530005【正文语种】中文【中图分类】Q943.2【相关文献】1.分子标记辅助聚合抗褐飞虱基因选育杂交水稻抗性品种初步研究 [J], 孙荣科;陈乔;李孝琼;陈英之;韦绍丽;阳海宁;张月雄;李容柏2.水稻抗褐飞虱基因Bph14和Bph15的分子标记辅助选择 [J], 李进波;夏明元;戚华雄;何光存;万丙良;查中萍3.水稻抗褐飞虱基因Bph18(t)的STS标记开发及有效性验证 [J], 梁云涛;王春连;赖凤香;刘丕庆;王坚;傅强;赵开军4.分子标记辅助选择培育抗稻瘟病和抗褐飞虱多基因聚合的水稻恢复系 [J], 李进波;杜雪树;夏明元;万丙良;戚华雄5.水稻抗褐飞虱基因bph2的SSR定位和标记辅助选择(英文) [J], 孙立宏;王春明;苏昌潮;刘裕强;翟虎渠;万建民因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
取食转Bt基因水稻褐飞虱对杀虫剂的敏感性及其代谢酶的活性
取食转Bt基因水稻褐飞虱对杀虫剂的敏感性及其代谢酶的活性李兆亮;姚洪渭;陈洋;田俊策;彭于发;叶恭银【期刊名称】《中国生物防治学报》【年(卷),期】2011(027)001【摘要】测定比较了褐飞虱Nilaparvata lugens在转cry1Ab基因水稻KMD1和KMD2及其对照秀水11上取食不同世代的室内种群和田间种群对5种杀虫剂的敏感水平及其体内解毒酶(酯酶和谷胱甘肽S-转移酶)、靶标酶(乙酰胆碱酯酶)和保护酶(超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)的活性,以及体内Cry1Ab蛋白的含量.结果表明,5种杀虫剂对分别持续取食KMD1和KMD2的褐飞虱室内种群和田间种群LD50值与取食对照的无显著差异.在KMD1和KMD2上取食1代和9代的褐飞虱室内种群以及田间种群体内解毒酶、靶标酶和保护酶等活性与取食对照的差异不显著.取食KMD的褐飞虱不同种群体内的Cry1Ab蛋白含量相对稳定,其中以取食KMD2的较高.上述结果表明,转cry1Ab基因水稻KMD1和KMD2对褐飞虱的杀虫剂敏感性和代谢酶活性无显著影响.%The toxicities of five commonly-used insecticides against different populations of rice brown planthopper, Nilaparvata lugens, fed on transgenic rice with crylAb gene, KMD1 and KMD2 for different generations were measured and compared with those on non-transgenic parental rice variety, Xiushui 11.Activities of detoxification enzymes (EST and GST), target enzyme (AChE), and protective enzymes (SOD, CAT and POD) from different populations of N.lugens fed on KMD1, KMD2, and Xiushui 11 and the content of Cryprotein were also detected.For all five insecticides tested,there were no significant differences in LD50 values among different populations ofN.lugens fed on KMD1 KMD2, and Xiushui 11 continuously in the laboratory and collected from the rice fields.For all six metabolic enzymes tested, there was no significant difference of enzyme activities among different populations of N.lugens fed on KMD1, KMD2 and Xiushui 11 for 1 and 9 generations in the laboratory or collected from the rice fields.The content of Cry protein was relatively stable in different populations ofN.lugens fed on Bt rice, and was higher in N.lugens fed on KMD2.It was concluded that transgenic rice lines with cry gene, KMD1 and KMD2, had no significant effects on the susceptibility to insecticides and activities of metabolic enzymes of N.lugens.【总页数】8页(P55-62)【作者】李兆亮;姚洪渭;陈洋;田俊策;彭于发;叶恭银【作者单位】浙江大学昆虫科学研究所/水稻生物学国家重点实验室/农业部作物病虫分子生物学重点开放实验室,杭州,310029;浙江大学昆虫科学研究所/水稻生物学国家重点实验室/农业部作物病虫分子生物学重点开放实验室,杭州,310029;浙江大学昆虫科学研究所/水稻生物学国家重点实验室/农业部作物病虫分子生物学重点开放实验室,杭州,310029;浙江大学昆虫科学研究所/水稻生物学国家重点实验室/农业部作物病虫分子生物学重点开放实验室,杭州,310029;中国农业科学院植物保护研究所/植物病虫生物学国家重点实验室,北京,100193;浙江大学昆虫科学研究所/水稻生物学国家重点实验室/农业部作物病虫分子生物学重点开放实验室,杭州,310029【正文语种】中文【中图分类】S435.112.3;Q965【相关文献】1.取食不同寄主植物的小菜蛾对杀虫剂敏感性的变化 [J], 程东美;张志祥;钟宝玉;龚长娣;胡美英2.取食不同寄主植物椰心叶甲后代对杀虫剂的敏感性差异 [J], 金涛;金启安;温海波;吕宝乾;彭正强3.舞毒蛾取食诱导小黑杨苯丙烷代谢酶活性及其相关基因的表达 [J], 周心怡;闫丽琼;吕云彤;孙丽丽;朱靖闻;曹传旺4.取食藜和龙葵对甜菜夜蛾生长发育及杀虫剂敏感性的影响 [J], 张职显;任相亮;王丹;宋贤鹏;马小艳;马亚杰;胡红岩;单永潘;马艳5.红火蚁幼虫的杀虫剂敏感性及代谢酶活性研究 [J], 鄢勤;曾鑫年;苗建忠因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
水稻抗褐飞虱的新基因
水稻抗褐飞虱的新基因
根本博;潘晓飚
【期刊名称】《农业科技译丛（杭州）》
【年(卷),期】1990(000)004
【总页数】3页(P35-37)
【作者】根本博;潘晓飚
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S435.112.3
【相关文献】
1.褐飞虱的饲养及抗褐飞虱水稻鉴定方法 [J], 张玮珊;姜虹芮;吕建群
2.抗褐飞虱兼抗白背飞虱水稻种质资源发掘 [J], 黄凤宽;黄所生;吴碧球;韦素美
3.抗Ⅱ型褐飞虱水稻品种对田间褐飞虱生物型结构的影响 [J], 覃丽莎;吴碧球;李成;黄芊;凌炎;黄凤宽;龙丽萍;黄所生
4.水稻抗褐飞虱新基因 [J], Hirshi Namoto;Ryoiclzi Lkeda;Chukichi Kaneda;郑旋
5.褐飞虱喂养试验显示表达GNA的转基因水稻纯系抗褐飞虱(英文) [J], 唐克轩;费炯;姚剑虹;孙小芬;万柄良;戚华雄;卢兴桂
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溴氰菊酯对稻褐飞虱繁殖力的影响
溴氰菊酯对稻褐飞虱繁殖力的影响
汤爱兵
【期刊名称】《生物灾害科学》
【年(卷),期】2007(030)002
【摘要】用稻苗喷雾法测定了溴氰菊酯对褐飞虱的毒力,然后在亚致死剂量处理过的水稻植株上,放入3龄中期若虫饲养至羽化.存活的成虫按翅型分成单对转移到新鲜无药的孕穗初期的水稻上继续饲养,观察并记录其繁殖力.
【总页数】3页(P70-71,76)
【作者】汤爱兵
【作者单位】苏州高新区镇湖街道农业服务中心,江苏,苏州,215161
【正文语种】中文
【中图分类】S482.3+5;S435.112+.3
【相关文献】
1.影响肉牛繁殖力的因素及提高繁殖力的措施 [J], 王春微;王英;张亮
2.影响母牛繁殖力的因素及提高牛群繁殖力的几项措施 [J], 李中利
3.影响羊繁殖力的因素与提高羊繁殖力的措施 [J], 魏红芳;郭建来
4.影响羊繁殖力的因素及提高羊繁殖力的措施 [J], 黎晓平
5.三唑磷对不同翅型稻褐飞虱繁殖力的影响 [J], 庄永林;沈晋良;陈峥
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水稻杀稻褐飞虱卵反应数量性位点图谱
水稻杀稻褐飞虱卵反应数量性位点图谱
向平;Yamasaki,M
【期刊名称】《国外作物育种》
【年(卷),期】2001(020)002
【总页数】1页(P12)
【作者】向平;Yamasaki,M
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】S435.112.3
【相关文献】
1.对水稻褐飞虱抗性相关的数量性状位点和表达序列标记的制图 [J], 谢国禄
2.加倍单倍体水稻群体中3个不同地点间控制植株生长、产量和产量相关性状的数量性状位点的分子图谱研究 [J], ShailajaHittalmani;向平
3.水稻叶鞘和茎秆中非结构性碳水化合物积累的数量性状位点及其对成熟性的影响[J], 长田健二;清水博之;谢国禄
4.钙调素一级结构保守性和变异性的数量分析──Ⅰ全序列主要免疫反应位点和靶酶结合位点保守性和变异性的数量分析 [J], 马力耕;陆运青;孙大业;阎隆飞
5.利用重组自交系群体检测水稻种子休眠性数量性状位点 [J], 曹雅君;江玲;王春明;刘世家;陈亮明;万建民
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稻田稻飞虱天敌种群动态及化学药剂的影响效果研究
稻田稻飞虱天敌种群动态及化学药剂的影响效果研究稻田稻飞虱天敌种类较多，种群数量较大，对稻飞虱的发生具有一定的抑制作用，研究稻飞虱主要天敌的发生规律，分析天敌对稻飞虱的控制效应，并加以合理利用，是稻飞虱综合治理工作中的重要内容。
于2008—2010年对稻飞虱主要天敌种类、消长动态、控害作用及其化学农药对天敌的影响程度进行了调查研究，现将初步结果报告如下。
1材料与方法1.1试验概况试验对象为稻田飞虱主要天敌，包括稻虱缨小蜂、二索线虫、蜘蛛、黑肩绿盲蝽等。
供试药剂为扑虱灵、杀虫单、毒死蜱、吡虫啉等。
1.2试验方法1.2.1稻田天敌种群消长动态调查。
①捕食性天敌。
2008—2010年每年选择肥力上等、长势均匀的杂交稻（汕优63）田2块作为系统观察圃。
7月1日至9月底，每5 d系统调查稻飞虱[1-2]、蜘蛛、黑肩绿盲蝽数量1次。
②寄生性天敌。
包括：稻虱缨小蜂，于五（2）代白背飞虱、褐飞虱和六（3）代褐飞虱成虫高峰后8～10 d剖查卵粒，分别记载各发育时期的卵粒数和异样色泽的卵粒数，计算孵化率、寄生率；二索线虫，在稻飞虱观察圃内，于8—9月五（2）代白背飞虱、六（3）、七（4）代褐飞虱成虫羽化期间，每次每块田调查20～50头短翅型成虫的寄生情况，计算寄生率。
1.2.2化学药剂对天敌的影响试验。
2008年，选用扑虱灵、杀虫单、毒死蜱、吡虫啉等杀虫剂，按常规用量，于8月1日施药，以不施药为空白对照。
重复3次。
于施药前调查稻飞虱、蜘蛛基数，施药后1、3、7、15、20、30、45 d调查稻飞虱和蜘蛛残留量，计算校正死亡率、蛛虱比，明确药剂对稻飞虱、蜘蛛种群消长的影响。
2结果与分析2.1主要天敌种类及其自然消长动态2.1.1蜘蛛。
稻田蜘蛛种类较多，以拟水狼蛛、食虫瘤胸蛛、草间小黑蛛等为当地优势种。
水稻栽插后田间即可调查蜘蛛，前期由于害虫数量少，食料不足，虫口数量上升缓慢。
7月10日前蛛量一般低于100头/百穴。
7月中旬随着稻飞虱数量的增加，蜘蛛也开始上升。
水稻抗褐飞虱基因Bph3的图位克隆和功能研究
水稻抗褐飞虱基因Bph3的图位克隆和功能研究褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)是水稻的单食性害虫,不仅能够直接刺吸危害造成“虱烧”,还可以传播水稻病毒病草状丛矮病(Grass Stunt)和齿叶矮缩病(Ragged Stunt),对水稻生产造成严重危害。
特别是在亚洲水稻种植区,褐飞虱已成为危害水稻生产的头号害虫。
目前水稻生产中,使用化学农药仍然是防治褐飞虱的主要手段,但是农药的使用不仅增加生产成本,污染环境,而且促使褐飞虱抗药性增强。
因此不断从各种资源中发掘新的抗性基因并且选育抗褐飞虱水稻品种成为防治褐飞虱危害的最经济有效又环保的途径。
抗虫基因的分离与克隆,不仅有助于阐明水稻抗褐飞虱的分子机制,而且可以加快其在育种中的应用。
本研究对褐飞虱在抗虫品种Rathu Heenati (RH)和感虫品种02428上的取食行为进行了分析,两种排趋性实验结果表明褐飞虱更趋向于在感虫品种02428上取食,因此RH对褐飞虱具有排趋性；强制褐飞虱取食RH后其存活率和蜜露排泄量都低于02428,表明RH对褐飞虱具有抗生性；通过切片观察发现褐飞虱取食RH时形成的能到达维管束的口针鞘的比例低于02428,说明RH抑制了褐飞虱吸取韧皮部汁液。
因此抗虫水稻品种RH对褐飞虱取食具有高度的抗生性和排趋性。
之前有报道将RH中的Bph3定位于第6染色体,我们通过构建RH和02428的F2群体,在第4染色体短臂检测到一个抗褐飞虱主效QTL；另外构建了RH/02428的BC2F1群体,利用第4染色体两标记和第6染色体两标记分别选择两种类型的单株进行表型鉴定,结果证明本研究所用的材料RH中抗褐飞虱基因确实位于第4染色体而非第6染色体。
之后为精细定位Bph3,我们利用RH/02428的F2、BC2F2和BC3F2群体共21,783个单株,利用初定位的标记筛选交换单株,然后进行表型鉴定,最终将Bph3最终定位于两个InDel标记RHD9和RHC10之间约79 kb的物理距离。
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网络出版时间：2014-08-01 09:46网络出版地址：/kcms/doi/10.13287/j.1001-9332.20140801.001.html转Bt基因及其亲本水稻上褐飞虱对三唑磷和溴氰菊酯的反应*李向冬1,2杨亚军1田俊策1徐红星1郑许松1吕仲贤1,2**(1浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所浙江省植物有害生物防控省部共建国家重点实验室培育基地，杭州310021; 2南京农业大学植物保护学院，南京210095)摘要以转Bt基因抗虫水稻T1C-19(含cry1C基因)和T2A-1(含cry2A基因)及其亲本水稻MH63为材料，用20和40 mg·L-1的三唑磷，1、3和6 mg·L-1的溴氰菊酯喷雾分别处理稻株上的3龄褐飞虱若虫，研究了两种农药对转Bt基因抗虫水稻上褐飞虱再猖獗的影响。
结果表明，三唑磷处理对褐飞虱的若虫历期无显著性影响，溴氰菊酯则能显著降低若虫历期，但随着两种药剂处理浓度的升高，若虫的存活率降低，成虫的产卵量增加。
在同一浓度农药药剂处理下，3个水稻品种上的褐飞虱若虫发育历期、若虫存活率、初羽雌成虫体质量、产卵量和卵孵化率等生态学参数均没有显著差异。
表明褐飞虱在两种转Bt水稻上对三唑磷和溴氰菊酯诱导再猖獗的反应能力与其亲本水稻MH63没有差异。
关键词转Bt水稻褐飞虱三唑磷溴氰菊酯再猖獗文章编号中图分类号S435.1 文献标识码AEcological responses of brown planthopper, Nilaparvata lugens (Stål), to triazophos and deltamethrin on transgenic Bt rice lines and their non-Bt parental rice. LI Xiang-dong1,2, YANG Ya-jun1, TIAN Jun-ce1, XU Hong-xing1, ZHENG Xu-song1, LU Zhong-xian1 (1State Key Laboratory Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Institute of Plant Protection and Microbiology, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou310021, China; 2College of Plant Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)Abstract: In this study, the brown planthopper (BPH), Nilaparvata lugens(Stål) (Hemiptera: Delphacidae), cultured on Bt rice lines (T1C-19 with cry1C gene and T2A-1 with cry2A gene) and their parental rice MH63, were treated with a series of concentrations of triazophos and deltamethrin when they developed up to the third instar for the evaluation of the effects of Bt rice on BPH resurgence induced by pesticides. The results indicated that BPH nymphal duration decreased with the increasing concentration of deltamethrin, while no significant differences of BPH nymphal duration were observed on the same rice variety treated with the different concentrations of triazophos. Furthermore, the survival rate of BPH significantly declined and their fecundity significantly increased with the increasing concentration of insecticides. However, ecological fitness parameters of BPH including nymphal duration, survival rate, female adult mass, fecundity and egg hatchability were not significantly different among Bt and non-Bt rice varieties when they treated with the same concentration of insecticide.These results implied that no significant difference in the BPH resurgence induced by pesticides was observed among the two tested Bt rice varieties and their non-Bt parental rice variety.Key Words: transgenic Bt rice; Nilaparvata lugens; triazophos; deltamethrin; resurgence.水稻是世界上最重要的三大粮食作物之一，大约有50%的人口以稻米为主食[1]。
中国的水稻种植面积约为3200万hm2，病虫害是制约水稻安全生产中的主要因素。
二化螟(Chilo suppressalis Walker)、三化螟(Tryporyza incertulas Walker)和稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenee)等鳞翅目害虫是我国水稻生产中的主要害虫，每年仅二化螟和三化螟发生危害面积就达1500万hm2以上，每年我国由于螟虫造成的损失超过65亿元[2]。
20世纪90年代以来，国内外相继开展了转基因抗虫水稻的开发，成功培育出了不少抗螟效果好的转Bt cry基因水稻(简称Bt水稻)品系，开创了防治水稻螟虫的新途径[3-4]。
*转基因生物品种培育重大专项项目(2011ZX08001-001)资助.**通讯作者. E-mail: luzxmh@ 2014-03-13收稿, 2014-07-22接受.虽然Bt水稻对靶标害虫具有较高的抗性，可以有效地控制水稻螟虫为害，但是其对非靶标的节肢动物(包括非靶标害虫和天敌)的潜在影响一直是公众关心的焦点。
褐飞虱(Nilaparvata lugens Stål)是转Bt水稻的最主要非靶标害虫之一，具有远距离迁飞性和r-对策等特点，是我国和亚洲许多国家当前水稻生产上的重要害虫[5]。
随着耕作制度的改变、高产品种的推广、肥水条件的改善和农药的大面积使用，褐飞虱爆发频率增加，对我国的水稻安全生产构成了严重的威胁。
2005年褐飞虱就在我国南方大面积暴发成灾，造成了严重的减产[6]。
在我国褐飞虱每年的发生面积约为0.25亿hm2，损失在25亿元以上[7-8]。
由于化学农药的不当使用导致了褐飞虱种群产生再猖獗的现象，特别是三唑磷和溴氰菊酯可以明显刺激褐飞虱成虫产卵[9-10]。
虽然Bt水稻对褐飞虱影响的研究已有不少开展，且与亲本对照相比大部分研究结果未发现显著差异。
但是水稻种植中的多种农事操作也会影响水稻对飞虱的抗性，如施用氮肥、喷洒农药等。
特别是农药诱导的褐飞虱再猖獗已有较多报道，然而至今未有Bt水稻对农药诱导的褐飞虱再猖獗的研究，其研究结果将有助于全面评价Bt水稻的生态安全性并为Bt水稻种植下的用药模式提供鉴戒。
为此，本文以转cry1C基因抗虫水稻品系T1C-19和转cry2A基因的抗虫水稻品系T2A-1为材料，研究在转Bt水稻上使用农药以后引起的褐飞虱再猖獗的可能性，以期探讨褐飞虱在转Bt基因水稻及其亲本水稻MH63上对农药诱导再猖獗的反应能力差异。
1 材料与方法1.1 供试材料供试转cry1C基因水稻品系T1C-19和转cry2A基因水稻品系T2A-1及其非转基因亲本水稻品种MH63的种子均由华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室提供。
水稻种子经消毒、浸泡和催芽后，播种在细土中，取45日龄的稻苗作为供试水稻。
供试褐飞虱采自浙江省金华市郊稻田，在养虫室内用台中在来1号(TN1)稻苗连续饲养。
取孵化后12 h内的若虫用于试验。
供试20%三唑磷乳油(EC)购自浙江东方农药有限公司，2.5%溴氰菊酯EC购自拜耳作物科学有限公司。
1.2 研究方法1.2.1农药对Bt水稻上褐飞虱若虫生长发育和存活率以及雌成虫体质量的影响试验试验在(26±1)℃和12L:12D光周期的人工气候室内进行。
取45日龄的稻苗，除去次生分蘖和外叶鞘、剪去无活力的根须，在自来水中漂洗后分别放入注有木村B水稻培养液的试管(直径1.5 cm，高15.0 cm)中，待水稻根系恢复后，接入12h内初孵若虫15头，用脱脂棉封口。
待若虫长至3龄，用500mL喷雾器对接虫稻株进行喷药处理, 直至药液下流至稻株基部。
三唑磷处理浓度为20和40mg·L-1，溴氰菊酯处理浓度为1、3和6 mg·L-1，以清水作为对照。
每个处理10次重复。
每日观察若虫的生长发育和存活情况，及时更换相同处理的新鲜稻苗，直至褐飞虱羽化，记录其羽化时间和数量。
待褐飞虱羽化后，取12h内羽化的雌成虫，在电子天平(精度为0.01mg)上称其体质量。
褐飞虱全部羽化后，计算若虫存活率和若虫历期。
1.2.2农药对Bt水稻上褐飞虱生殖的影响试验试验在(26±1)℃和12L:12D光周期的人工气候室内进行。
同1.2.1准备试验稻株和试管。
每管中分别接入1对相对应的初羽化成虫，每天定时观察褐飞虱存活情况，及时添加稻株和水稻培养液。
每个处理重复10 次。
如果雄成虫在3 d内死亡，则重新补充雄成虫。