p21基因对NIH3T3细胞生长的抑制作用
槲皮素在慢性肾脏病防治中的研究进展
槲皮素在慢性肾脏病防治中的研究进展为明确槲皮素在防治慢性肾脏病方面的作用，从其药理作用及药物代谢动力学，对肾脏纤维化的影响以及在糖尿病发病机制中的相关研究进行综述，认为槲皮素在多种慢性肾病的防治中有着广泛的应用前景。
标签：槲皮素；慢性肾脏病；肾脏纤维化；糖尿病肾病；研究进展槲皮素（quercetin，QU）是一种化学命称为3，3ˊ，4ˊ，5，7-五羟基黄酮的黄酮类化合物，在植物界分布广泛，多种食物及中草药均含此成分，因其具有多种生物活性和较高药用价值而成为近年来研究的热点。
1 QU的药理作用及药物代谢动力学研究相关研究表明[1]，当QU在大于40μg/ml时有致突变或致癌的可能性，而另有研究证实[2-3]，QU没有致癌性，人对QU具有良好的耐受性。
QU具有抗纤维化、抗氧化、抗过敏、抗血栓、抗炎、抗菌、镇痛、清除自由基、抗病毒、抗肿瘤及止泻等多方面的药理作用。
QU多以苷类形式存在，由于所连接的糖的类型和位置不同形成多种黄酮苷，苷类因其苷键不稳定而易水解脱糖。
QU苷类口服后大多在肠道内细菌作用下分解为QU和糖类，此外在结肠含量最丰富的β-葡萄糖酶也可分解槲皮素苷类。
QU可经易化扩散被肠上皮细胞吸收[4]，吸收后主要分布于肠道，其次是肺和血浆，其血浆蛋白结合率较高，代谢后多以原形或结合成葡萄糖醛糖酸苷的形式排出体外[5]。
2 QU对肾脏纤维化影响的研究肾脏组织中细胞外基质（ECM）的过度沉积是肾脏纤维化的主要表现，是原发性肾病引起的肾功能缺失，糖尿病肾病，梗阻性肾病和慢性肾小球肾炎等发展到终末肾衰的共同进程。
肾脏纤维化根据解剖部位划分常包括：肾小管间质纤维化、肾小球硬化和肾脉管系统改变（肾小球和小管周毛细血管缺失），其中肾小管间质纤维化被认为是肾功能不可逆缺失和终末肾衰竭进程中最稳定的指示因子[6]。
2.1 QU对肾小球系膜细胞影响的研究系膜细胞（MC）是肾小球中主要固有细胞之一。
在生理情况下，MC的数量、形态和位置均保持相对稳定，其合成基质的能力也较小。
p21基因作用
p21基因作用P21基因是一种抑制细胞周期进程的关键基因，也被称为细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子1A（Cip1）或骨架蛋白P21（Waf1/Cip1）。
这个基因编码的蛋白质P21是一种蛋白酶抑制剂，可以通过和细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）结合以抑制其激酶活性。
在细胞内，CDK与其配体细胞周期蛋白（Cyclin）相结合后形成复合物，促进细胞周期的推进。
P21的出现可以抑制CDK的活性，从而阻断细胞周期的推进，使细胞停留在G1/S和G2/M转换期，保证了DNA修复和细胞凋亡的进行。
P21基因在人体细胞中广泛表达，它的表达受到多种信号的调控。
在细胞受到DNA损伤、细胞失去正常的生长因子刺激、细胞内出现异常增殖等情况下，P21基因会被激活并开始进行转录。
这样一来，P21蛋白就会在细胞核内大量积累，抑制CDK的活性，使细胞周期停滞，为细胞提供更多时间来进行DNA修复。
这是细胞对于DNA损伤的一种保护机制，可以避免受损的DNA进入有问题的细胞周期，从而避免细胞突变和癌变。
除了在DNA损伤修复过程中的重要作用外，P21基因还参与了多种细胞生理过程的调控。
例如，在细胞老化过程中，P21的表达上调可以抑制细胞的增殖，并促进细胞进入细胞凋亡程序。
这对于细胞的寿命和代谢稳定具有重要意义。
此外，研究表明P21还参与了多个信号通路的调节，如细胞凋亡通路、转录调节通路等，与细胞周期密切相关的转录因子和调节因子也有可能与P21相互作用，共同调控细胞的分化和发育。
P21基因作为一个细胞周期调控剂，具有广泛的生物学功能，对于维持细胞的正常功能和机体的健康至关重要。
近年来，关于P21基因的研究越来越受到关注，人们已经发现了许多与其相关的生理和病理学过程，并对其作用机制进行了深入研究。
首先，P21基因在细胞周期的控制中起着至关重要的作用。
正常细胞周期的进行需要严格的调控，细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）是细胞周期进行的重要调控分子。
抗肿瘤药物的作用机制【精选文档】
抗肿瘤药物的作用机制1．细胞生物学机制几乎所有的肿瘤细胞都具有一个共同的特点,即与细胞增殖有关的基因被开启或激活，而与细胞分化有关的基因被关闭或抑制，从而使肿瘤细胞表现为不受机体约束的无限增殖状态。
从细胞生物学角度,诱导肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞增殖或者导致肿瘤细胞死亡的药物均可发挥抗肿瘤作用.2．生化作用机制(1）影响核酸生物合成:①阻止叶酸辅酶形成；②阻止嘌呤类核苷酸形成；③阻止嘧啶类核苷酸形成；④阻止核苷酸聚合;(2）破坏DNA结构和功能；（3）抑制转录过程阻止RNA 合成；(4）影响蛋白质合成与功能:影响纺锤丝形成;干扰核蛋白体功能；干扰氨基酸供应；（5）影响体内激素平衡。
烷化剂烷化剂可以进一步分为：氮芥类:均有活跃的双氯乙基集团，比较重要的有氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺(CTX)、异环磷酰胺（IFO）等。
其中环磷酰胺为潜伏化药物需要活化才能起作用。
目前临床广泛用于治疗淋巴瘤、白血病、多发性骨髓瘤，对乳腺癌、肺癌等也有一定的疗效。
该药除具有骨髓抑制、脱发、消化道反应，还可以引起充血性膀胱炎，病人出现血尿，临床在使用此药时应鼓励病人多饮水,达到水化利尿，减少充血性膀胱炎的发生。
还可以配合应用尿路保护剂美斯纳.亚硝脲类：最早的结构是N—甲基亚硝脲（MNU)。
以后,合成了加入氯乙集团的系列化合物，其中临床有效的有ACNU、BCNU、CCNU、甲基CCNU等，链氮霉素均曾进入临床，但目前已不用。
其中ACNU、BCNU、CCNU、能通过血脑屏障，临床用于脑瘤及颅内转移瘤的治疗。
主要不良反应是消化道反应及迟发性的骨髓抑制，应注意对血象`的观测,及时发现给予处理。
乙烯亚胺类:在研究氮芥作用的过程中，发现氮芥是以乙烯亚胺形式发挥烷化作用的，因此，合成了2，4，6-三乙烯亚胺三嗪化合物（TEM）,并证明在临床具有抗肿瘤效应，但目前在临床应用的只有塞替派。
此药用于治疗卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌，不良反应主要为骨髓抑制，注意对血象定期监测。
P21基因过表达对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制
P21基因过表达对甲状腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制翟健;胡万宁;李军;石福民【摘要】目的探讨过表达细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(P21)基因对甲状腺癌细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制.方法将人甲状腺癌细胞SW579分为对照组(未转染)、PCLneo-HK组(转染空载体)和PCLneo-P21组(转染真核过表达载体).采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活力;采用流式细胞仪分析细胞的凋亡情况;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测细胞中P21、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(BAX)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的表达水平.结果PCLneo-P21组SW579细胞中P21蛋白的相对表达量明显高于对照组(P﹤0.01);PCLneo-P21组SW579细胞的增殖率明显低于对照组,凋亡率明显高于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.01);PCLneo-P21组SW579细胞中Bcl-2、cyclin D1蛋白的相对表达量均明显低于对照组,BAX蛋白的相对表达量明显高于对照组,差异均有统计学意义(P﹤0.01).结论过表达P21基因可以通过影响细胞凋亡相关基因的表达抑制甲状腺癌细胞的增殖,并诱导其凋亡.【期刊名称】《癌症进展》【年(卷),期】2019(017)003【总页数】4页(P280-283)【关键词】P21;甲状腺癌;增殖;凋亡;细胞周期蛋白D1【作者】翟健;胡万宁;李军;石福民【作者单位】唐山市人民医院头颈外科,河北唐山 0630010;唐山市人民医院头颈外科,河北唐山 0630010;唐山市人民医院头颈外科,河北唐山 0630010;唐山市人民医院头颈外科,河北唐山 0630010【正文语种】中文【中图分类】R736.1甲状腺癌是内分泌系统较为常见的一种恶性肿瘤，其发病率逐年增加，约占全身恶性肿瘤的3%，约占头颈部恶性肿瘤的5%[1]。
MAPK信号通路
MAPK信号通路2008-06-04 21:50MAPK,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。
研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有至关重要的作用。
研究表明，MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。
1并行MAPKs信号通路的组成及其活化特点在哺乳类细胞目前已发现存在着下述三条并行的MAPKs信号通路［1］。
1．1ERK（extracellular signal-regulated kinase）信号通路1986年由Sturgill等人首先报告的MAPK。
最初其名称十分混乱，曾根据底物蛋白称之为MAP2K、ERK、MBPK、RSKK、ERTK等。
此后，由于发现其具有共同的结构和生化特征，而被命名为MAPK。
近年来，随着不同MAPK家族成员的发现，又重新改称为ERK。
在哺乳类动物细胞中，与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径，目前对其激活过程及生物学意义已有了较深入的认识。
研究证实，受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联的受体和部分细胞因子受体均可激活ERK信号转导途径。
如：生长因子与细胞膜上的特异受体结合，可使受体形成二聚体，二聚化的受体使其自身酪氨酸激酶被激活；受体上磷酸化的酪氨酸又与位于胞膜上的生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的SH2结构域相结合，而Grb2的SH3结构域则同时与鸟苷酸交换因子SOS（Son of Sevenless）结合，后者使小分子鸟苷酸结合蛋白Ras的GDP解离而结合GTP，从而激活Ras；激活的Ras进一步与丝／苏氨酸蛋白激酶Raf-1的氨基端结合，通过未知机制激活Raf-1；Raf-1可磷酸化MEK1／MEK2（MAP kinase／ERK kinase）上的二个调节性丝氨酸，从而激活MEKs；MEKs为双特异性激酶，可以使丝／苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化，最终高度选择性地激活ERK1和ERK2（即p44MAPK和p42MAPK）。
基因与癌症关系
基因与肿瘤的关系可能提供癌治疗的新途径。
持保留态度的人则认为癌变是一个多阶段的过程，把它看作只需要一个癌基因的激活的结果似乎是过于简单化了。
尤其是在正常细胞中癌基因也并不是完全不表达的。
这一现象的发现使问题更为复杂化。
迄今为止，已分离的癌基因多与致癌的RNA病毒有关，而且都是依据它们对小鼠成纤维细胞转化受体系统的致癌活性来判定的当前细胞生物学研究的热点课题中，我最感兴趣的是基因与肿瘤的关系，因为在当今社会，肿瘤的发病率越来越高，且其死亡率也居高不下。
那么到底是什么导致其愈演愈烈的趋势呢？我认为这个话题与人类的生活有着密不可分的关系。
所以进行以下学习和探讨。
细胞微环境的变化，包括基因甲基化的变异以及各种特定基因表达的异常都和疾病发生有关。
越来越多的证据显示基因表达的异常将导致各种疾病的发生，尤其是肿瘤形成。
基因是DNA分子上的一个个片段，经过转录和翻译能合成一条完整的多肽链。
肿瘤的形成涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。
（一）癌基因的激活与肿瘤的发生癌基因是细胞内控制细胞生长和分化的基因，它的结构异常或表达异常，可以引起细胞癌变；病毒癌基因存在于病毒基因组中的癌基因，它不编码病毒的结构成分，对病毒复制也没有作用，但可以使细胞持续增殖；细胞癌基因存在于生物正常细胞基因组中的癌基因，或称原癌基因。
癌基因可以分成两大类：一类是病毒癌基因，指反转录病毒的基因组里带有可使受病毒感染的宿主细胞发生癌变的基因，简写成V-OnC；另一类是细胞癌基因，简写成c—onc，又称原癌基因（proto-oncogene），这是指正常细胞基因组中，一旦发生突变或被异常激活后可使细胞发生恶性转化的基因。
换言之，在每一个正常细胞基因组里都带有原癌基因，但它不出现致癌活性，只是在发生突变或被异常激活后才变成具有致癌能力的癌基因。
癌基因有时又被称为转化基因（transforming gene），因为已活化的癌基因或是从肿瘤细胞里分离出来的癌基因，可将已建株的NIH3T3小鼠成纤维细胞或其他体外培养的哺乳类细胞，转化成为具有癌变特征的肿瘤细胞。
抗肿瘤肽露那辛研究进展
测定Ｌｕｎａｓｉｎ浓度。超滤，离子交换色谱完后的活性峰进行
万方数据
中国生化药物杂志Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ｂｉ１０年第３ｌ卷第４期
２８３
下一步凝胶过滤色谱（介质Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５），柱子平衡使用含
０．１５ ｍｏｌ／Ｌ
进入细胞核内。ｃ端多个Ａｓｐ起的作用是直接结合到核心 组蛋白上。基于以上的研究，推测Ｌｕｎａｓｉｎ能结合到染色体
小麦 中药
龙葵 白英 挂金灯
３６．４ ２２．３ １７．０ １０．１ ９．５～１２．１
８ｉｎ的重要材料。Ｊｅｏｎｇ等旧¨以１１种茄属中草药植物种子： 龙葵（Ｓｏｌａｎｕｍ ｎｌｇｒｕｍ￡）、白英（Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｒａｔｕｍ）、挂金灯
（Ｐｈｙｓａｌｉｓ ａｌｋｅｋｅｎｇｉ Ｉｙａｒ．ｆｒａｎｃｈｅｔｉ）、蔓陀罗（Ｄａｔｕｒａ ｓｔｒａｍｏｎｉ－
２ ２．１
到一个多肽，氨摹酸测序测定一级结构含有４３个氨基酸的 多肽，并发现其羧基端是富含Ａｓｐ的片段，但是大豆富含 Ａｓｐ肽的生物功能没有得到鉴定，研究人员推测其具有各种 生物功能，但是均没有证实。Ｊｅｏｎｇ等¨７１以成熟的大豆种子 为原材料，磨成粉状后取３０ ｇ用０．１ ｍｏｌ／Ｌ磷酸盐缓冲液
（ＰＢＳ，ｐＨ ７．４）１００ ｍＬ，４℃浸提４８ ｈ，加１％蛋白酶抑制剂，
ｍｉｎ，１２ Ｌ
脱脂大豆粉
纳豆
５．４８ ＮＤ ＮＤ ４．Ｏ～５．２ ５．５～６．１ ４．０～４．６ ７．８—８．８ ４．５—４．９ ５．０—６．２ ７．１＿７．５ ６．５～７．５
Ｈ本豆酱面
强化豆奶 有机原味最奶 有机强化豆奶
有机原味饮料
强化可奶 豆奶（无糖）
０００×ｇ离心１０ ｍｉｎ，收集上清，０．２２
p21基因作用范文
p21基因作用范文p21基因是一种调控细胞周期的关键基因，它的主要作用是通过抑制细胞周期进展来维持基因组的稳定性，并参与细胞增殖、凋亡、衰老和肿瘤发生等多种生理过程。
本文将详细介绍p21基因的作用机制以及其在细胞周期调控、DNA损伤修复和细胞去氧核糖核酸体的功能中扮演的角色。
在细胞周期调控中，p21基因主要通过抑制细胞周期进展来维持细胞的稳定性。
细胞周期是细胞从分裂到再次分裂的过程，分为G1、S、G2和M四个阶段。
p21基因在细胞周期的G1期和S期起到抑制作用。
在G1期，p21基因通过调控细胞周期调节蛋白，如细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）和细胞周期蛋白（cyclins），以抑制细胞周期进展。
在S期，p21基因则通过抑制DNA合成酶的活性，限制DNA合成的进行，从而延长DNA复制时间。
这些调控机制使得细胞可以确保在DNA损伤修复完成之前不进入下一个细胞周期阶段，保证了基因组的稳定性。
此外，p21基因还参与了细胞凋亡和衰老过程。
细胞凋亡是细胞主动死亡的一种方式，对于维持机体内细胞数量的稳定和身体发育具有重要作用。
p21基因在细胞凋亡中发挥抑制作用，通过阻断细胞周期进展和抑制抗凋亡因子，促进细胞凋亡的发生。
另外，p21基因在细胞衰老中也发挥关键作用。
细胞衰老是机体衰老的一个重要原因，p21基因在细胞衰老过程中通过抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡来延缓细胞衰老。
此外，p21基因还与肿瘤发生密切相关。
肿瘤是由于细胞的DNA损伤修复机制紊乱或基因突变引起的异常细胞增殖。
p21基因作为一个重要的肿瘤抑制基因，在肿瘤的抑制中发挥重要作用。
研究发现，p21基因的过表达可以通过抑制细胞周期进展、促进细胞凋亡和抑制肿瘤细胞的侵袭和转移，对多种肿瘤具有抑制作用。
此外，p21缺失或突变也被发现与多种肿瘤的发生和发展密切相关，表明p21基因的异常表达可能是肿瘤发生的一种重要机制。
在DNA损伤修复中，p21基因也发挥重要作用。
DNA是细胞遗传信息的载体，容易受到内源和外源损伤因素的影响。
p21研究进展综述-shx
p21在肿瘤中的研究进展摘要：p21基因是Clp家族中的一员，它是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子。
p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站，因DNA损伤后不经过修复则无法通过，减少了受损DNA的复制和积累，从而发挥抑癌作用。
研究表明，p21与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关，具有判断预后的价值。
关键词：p21基因；肿瘤；细胞周期；基因多态性；细胞凋亡p21基因是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中的重要成员。
它既与肿瘤抑制作用密切相关，又能抑制周期素。
周期素依赖激酶复合物活性，协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连。
p21基因的发现、克隆及其在细胞周期控制与肿瘤发生中有非常重要的作用。
本文拟对p21在肿瘤中的研究进展，作一简要的综述。
1 p21的概述1.1 p21的发现Harpeer等在寻找CDK2的调节蛋白时发现了p21称其编码因子为CP1（CDK-interacting protein 1），并证明p21是CDK2和其他CDK的一个很好的抑制物，表明了p21在细胞分裂过程中起到一个关卡的作用。
V ogel stein等在寻找受p53转录调控的基因中，发现了p21基因，称之为WAF1( wild- type p53- activated fragment 1)。
当将它导入肿瘤细胞时，发现其与p53有同样的抑癌效应。
基于WAF1为p53所诱导和Cip1具有抑制cyclin - CDK的能力，又被命名为PIC1( p53-regulated inhibitor of CDKS)。
Smith等在研究细胞老化、寻找引起细胞衰老和丧失分裂能力的基因过程中发现了p21基因, 命名为SDI l ( senescent cell- derived inhibitor 1), 并证明SDI l能抑制DNA合成。
1.2 p21的作用机制p21直接与CDC2 ( CDK1), CDK2, CDK4和cyclin A, B,D, E共同参与形成具有酶活性的复合物, p21的分子克隆和纯化的p21蛋白在体外能与cyclin- CDK 重组成复合物,p21能作为一个潜在的普遍的CDK酶抑制剂, 从而能诱导细胞周期的停止。
P21活化激酶1小分子干扰RNA对胃癌BGC823细胞生长的影响
论著P21活化激酶1小分子干扰RNA对胃癌B GC823细胞生长的影响刘福囝滕勇张晓旭黎瀚刘璐孙瑞佳徐惠绵摘要目的观察Pak1si RNA对胃癌BGC823细胞生长和细胞周期的影响。
方法W esternb l ot检测P ak1在胃癌细胞中的表达。
BGC823细胞转染Pak1si R NA后,MTT分析和细胞计数观察BGC823细胞的生长情况,同时进行细胞周期测定。
结果Pak1在胃癌BGC823细胞中高表达,且能被P ak1si R NA干扰达7224%。
BGC823细胞在转染Pak1si R NA后,生长明显受到抑制(P<005),细胞周期在G2/M期发生阻滞,转染P ak1si R NA组G2/M比率[(2012164)%]较对照组[(870169)%,P=0008]明显升高。
结论P ak1s i R N A能够影响细胞周期,从而抑制胃癌BGC823细胞的生长。
关键词胃肿瘤;p21活化激酶类;RN A干扰;细胞生长过程;细胞周期E ffec ts of Pa k1si RNA to th e grow th of ga str ic ca ncer ce ll BG C823LIUF u nan,TENG Y ong,Z HA NGX i a o xu,LI H an,LIU Lu,SU N Rui jia,XU H ui m ian.Depa rt men t of Surgica l Oncology,The F irst Aff ilia tedH os pita l o f China M e d ica l Univ ersity,Shenyang110001,ChinaCorres ponding author:XUH ui m ian,Em a il:lfn540@126.co mAbstra ct O bjective To observe t he effects of P ak1si R NA to ce ll gro wth and cell cyc l e of gastriccancer ce ll BGC823.M ethod s The expressi on of P ak1i n gastr i c cancer cellwas de tected byW estern blot.Pak1si R NA was transfected i n t o BGC823ce l.l The gro wth ability of BGC823ce llwas observed byMTT assayand counti ng ce ll nu mber,and t he ce ll cycle was detected.R esu lts The express i on of P ak1i n B GC823ce llwas h i ghe r t han ot her gastric cancer ce lls,and t he express i on of P ak1i n BGC823cell i n terfered by Pak1si R NA was up to7224%.P ak1si RNA was transf ec ted int o BGC823ce l,l and then t he gro wth of BGC823ce ll was sig n ificantl y inh i bited(P<005).The ce ll cycle exh i bited a a rrest i n G2/M phase,and the G2/Mphase percentage of cells by transfec ting P ak1si R NA(2012%164%)was h i ghe r than the control groupce lls(870%169%,P=0008).C onc l u si on s Pak1si R NA could affected cell cycle of B GC823ce l,land t hen inh i bited the gro wth of BGC823ce l.lK ey wor ds Sto m ach neo p las m s;p21acti va ted k i nases;RNA i nterference;Ce ll gro wthprocesses;C ell cyc le胃癌是我国发病率和死亡率较高的恶性肿瘤之一,严重危害人类生命健康。
碲化镉量子点细胞毒性研究进展
碲化镉量子点细胞毒性研究进展陆杰;张婷;唐萌【摘要】随着纳米技术和纳米医学的飞速发展,越来越多的纳米材料应用于生物医学领域.量子点(QDs)作为一种新型的荧光材料在工业和医学领域有着广阔的应用前景,而碲化镉量子点(cadmium telluride quantum dots, CdTe QDs)是目前常用的一种QDs,其生物安全性引起了极大的关注.体内外的研究表明CdTe QDs可以对生物体造成损害.CdTe QDs的细胞毒性主要表现为细胞活力和生存率降低,细胞正常形态被破坏,基因突变,染色体畸变以及细胞凋亡的出现.而毒性机制的研究集中于活性氧(ROS)水平的升高,线粒体形态和功能的破坏,DNA受损和自噬作用等方面.笔者综述了CdTe QDs对体外细胞造成的毒性作用及其机制,旨在为CdTe QDs的生物安全性研究和更好的应用提供有价值的参考.%With the rapid development of nanotechnology and nano-medicine, a growing number of nano-materials are applied in the biomedical field.Quantum dots (QDs), a kind of novel fluorescent material, have a potential biological and biomedical applications.Since cadmium telluride quantum dots (CdTe QDs) are one of frequently used QDs, their bio-safety has gained intensive concerns.Several in vitro and in vivo toxicological studies suggested that CdTe QDs exposure could damage cells and living organisms.The cytotoxic effects of CdTe QDs include decreases in cell viability, impairment of cellular normal morphology, gene mutation, chromosomal aberration, and occurrence of cell apoptosis.Those studies focusing on toxic mechanisms of CdTe QDs causing these adverse effects found that CdTe QDs induced increased ROS generation, impairment of mitochondria construction and function, DNAdamage and autophagy.This review briefly introduced the toxic effects of CdTe QDs on in vitro cells and some underlying mechanisms, which aimed to support further bio-safety assessments and better applications of CdTe QDs.【期刊名称】《生态毒理学报》【年(卷),期】2016(011)005【总页数】8页(P24-31)【关键词】碲化镉量子点;细胞毒性;毒作用机制;影响因素【作者】陆杰;张婷;唐萌【作者单位】东南大学公共卫生学院&苏州纳米科技协同创新中心,南京 210009;环境医学工程教育部重点实验室,南京 210009;江苏省生物材料与器件重点实验室,南京 210009;东南大学公共卫生学院&苏州纳米科技协同创新中心,南京 210009;环境医学工程教育部重点实验室,南京 210009;江苏省生物材料与器件重点实验室,南京 210009;东南大学公共卫生学院&苏州纳米科技协同创新中心,南京 210009;环境医学工程教育部重点实验室,南京 210009;江苏省生物材料与器件重点实验室,南京 210009【正文语种】中文【中图分类】X171.5随着纳米技术快速发展，纳米材料广泛应用于各个领域。
MAPK信号通路与细胞凋亡的关系
一 ＭＡＰＫ信号转导途径MAPK途径的基本组分 MAPK级联反应包含三个顺序激活的成分:MAPK激酶的激酶(MAPKKK或MEKK)，MAPK 激酶(MAPKK,MKK 或MEK) 和MAPK [1]。
目前在人类主要有三组MAPK通路：ERK1/2(细胞外信号调节激酶)MAPK家族，P38MAPK家族，JNK/SAPK(c-Jun 氨基端激酶/应激活化蛋白激酶)MAPK 家族[2]。
1.1 ERK1/2家族ERK1/2信号通路包括五个亚组，ERK1/2,ERK3/4和ERK5[3]。
ERK1 /2 与细胞增殖最为密切,其上游激酶为MAPK 激酶(MEK1/2), MEK1与细胞分化有关,而MEK2 与细胞增殖有关[4]。
1.2 JNK/SAPK MAPK家族外界刺激可通过Ras依赖或非Ras依赖的两条途径激活JNK[6]。
已有研究证实，双特异性激酶JNK Kinase（JNKK）是JNK／S A P K的上游激活物，其中M K K7／JNKK2可特异性地激活JNK[5]，MKK4则可同时激活JNK1和p38。
1.3 P38MAPK家族p38是由360个氨基酸组成的38kD的蛋白,与JNK 同属应激激活的蛋白激酶。
研究表明,在许多细胞反应中发现P38 活化，并且与细胞种类及外界刺激有关。
p38MAPK 通路可被应激刺激(Uv、H2O2、热休克和缺氧等)、炎性因子(TNF-α、IL-1 和FGF 等) 及LPS 和革兰氏阳性细菌细胞壁成分而激活[7，8]。
SKF86002 是第一个报道的P38M A P K抑制剂,以后又出现了SB203580 和其他的2 ,4 ,5 -三芳基咪唑, 它们能够特异性地抑制P38 MAPKα和P38 MAPKβ,而不影响JNK和ERK 的活性[9]。
二 并行的ＭＡＰＫｓ 信号通路在细胞信号转导中的协调作用研究表明，哺乳类细胞可通过多种机制维持其每一条MAPKs信号通路信号转导的特异性。
Nedd4蛋白家族与肿瘤的研究进展
Nedd4蛋白家族与肿瘤的研究进展泛素-蛋白水解酶复合体通路（UPP）是真核细胞中蛋白质降解的主要途径，在维持细胞正常生理功能中发挥重要作用。
Nedd4蛋白家族作为UPP的核心成员，近年研究已指出Nedd4蛋白家族在肿瘤的发生和發展起着重要作用。
现就Nedd4蛋白家族与肿瘤关系作一综述。
标签：Nedd4蛋白家族；UPP；肿瘤泛素-蛋白水解酶复合体通路（UPP）是一个复杂又有序的特异性蛋白质降解过程，可以降解细胞内错误折叠的和特定时间、空间的蛋白质，是一条重要的非溶酶体降解途径，它在多种细胞内信号分子传导的调节中发挥重要作用。
它通过泛素化修饰与靶蛋白的精细结合，对蛋白质翻译后修饰和降解起了关键作用，参与调控DNA 损伤修复、细胞周期进程、细胞凋亡、抗原呈递、炎症反应等绝大多数细胞事件。
对于肿瘤，UPP能选择性降解癌基因、抑癌基因的产物、激活物或抑制物、凋亡调控蛋白等达到调控细胞突变和肿瘤发生的目的。
Nedd4蛋白家族作为UPP中关键因子，近年来研究其在癌细胞的发生发展，侵袭，转移等课题中已备受瞩目。
人类的Nedd4 家族有9个成员，分别是Nedd4、Nedd4L、Smurf1、Smurf2、Itch、WWP1、WWP2、NEDL1 和NEDL2。
Nedd4家族蛋白不仅参与多种蛋白的生理过程，维持细胞的正常功能，还通过对TGFβ、EGF、IGF等细胞因子介导的信号通路以及原癌、抑癌因子的调控在肿瘤的发生发展中起重要作用。
1 Smurf1Smurf1 在较多肿瘤组织中都呈现高表达。
有研究发现Smurf1的表达水平在乳腺癌中明显高于良性病变且有淋巴结转移的更明显，说明在乳腺癌的侵袭和淋巴结转移过程中Smurf1可能是与乳腺癌转移有关的一个肿瘤标志物。
Yu[1]等研究表明，在儿童横纹肌肉瘤组织及骨肉瘤组织中Smurf1蛋白的高水平表达提高了肿瘤细胞的转移活性，同时通过RNA 干扰Smurf1 的表达，细胞表面突起形成、血管生成受到非常明显的抑制。
水凝胶递送碱性成纤维细胞生长因子对氧糖剥夺后NIH3T3_细胞功能的影响
第 49 卷第 6 期2023年 11 月吉林大学学报（医学版）Journal of Jilin University（Medicine Edition）Vol.49 No.6Nov.2023DOI：10.13481/j.1671‑587X.20230611水凝胶递送碱性成纤维细胞生长因子对氧糖剥夺后NIH3T3细胞功能的影响惠文婷1, 宋潼潼2, 黄敏1, 陈霞1（1. 吉林大学基础医学院药理学系，吉林长春130021；2. 吉林大学基础医学院人体解剖学系，吉林长春130021）［摘要］目的目的：探讨水凝胶递送碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）对氧糖剥夺（OGD）后小鼠成纤维NIH3T3细胞功能的影响，并阐明负载bFGF的水凝胶对OGD条件下成纤维细胞氧化应激反应的改善作用。
方法方法：制备bFGF明胶水凝胶，将对数生长期NIH3T3细胞分为空白组、20%明胶组和20%明胶+戊二醛组，采用CCK-8法检测6、12和24 h水凝胶浸出液共培养的NIH3T3细胞活性。
将NIH3T3细胞分为对照组、OGD组和OGD+不同质量 bFGF负载组（OGD+1 ng bFGF组、OGD+10 ng bFGF组和OGD+100 ng bFGF组）。
采用Western blotting法检测各组细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原蛋白和Ⅲ型胶原蛋白表达水平。
检测各组细胞中丙二醛（MDA）水平和乳酸脱氢酶（LDH）及超氧化物歧化酶（SOD）活性。
采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测bFGF体外释放率。
结果：CCK-8法检测，与空白组比较，不同浸出时间20%明胶组和20%明胶+戊二醛组NIH3T3细胞活性差异无统计学意义（P>0.05）。
Western blotting法检测，与对照组比较，OGD组NIH3T3细胞中α-SMA和Ⅰ型胶原蛋白表达水平明显升高（P<0.05或P<0.01）；与OGD组比较，OGD+1 ng bFGF组、OGD+10 ng bFGF组和OGD+100 ng bFGF组NIH3T3细胞中α-SMA蛋白表达水平均明显降低（P<0.01），Ⅰ型胶原蛋白表达水平均明显降低（P<0.05或P<0.01），并呈剂量依赖性。
肺癌线粒体DNA诱导小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3恶性转化的研究
肺癌线粒体DNA诱导小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3恶性转化的研究姬宏利1a，姬宏娟2，王保健1b作者单位：1解放军联勤保障部队第九八八医院郑州院区，a肿瘤科，b呼吸科，河南郑州450042；2解放军联勤保障部队第九八八医院开封院区特诊科，河南开封475003通信作者：王保健，男，副主任医师，研究方向为肺部肿瘤的基础和临床工作，Email：******************基金项目：解放军联勤保障部队第九八八医院（原一五三医院）科研基金（2012013）摘要：目的观察转染了A549及H226肺癌细胞线粒体DNA（mtDNA）的小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的生物学行为的变化。
方法将重组载体pcDNA3.1（+）-A549mtDNA、pcDNA3.1（+）-H226mtDNA通过Lipofection2000TM转染NIH3T3细胞；荧光原位杂交（FISH）法观察mtDNA在核内的整合情况；分析转染前后细胞染色体核型；流式细胞仪（FCM）检测转染细胞的凋亡；四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法（MTT法）测定不同组别细胞的增殖率。
结果转染A549-mtDNA、H226-mtDNA的NIH3T3细胞染色体出现了易位、断裂的结构畸形，其畸形的多倍体数目百分比（11.78±0.60）%、（11.33±1.05）%和染色体数目（3.55±0.57）%、（5.02±0.72）%高于未转染的NIH3T3细胞（1.38±0.17）%、（0.54±0.10）%。
荧光显微镜观察到mtDNA能够整合在转染A549-mtDNA、H226-mtDNA的NIH3T3细胞染色体间期核中。
同时，转染了A549-mtDNA、H226-mtDNA重组表达载体，A549-mtDNA组（5.20±0.20）%、H226-mtDNA组（7.75±0.11）%较NIH3T3组（19.04±0.08）%细胞的凋亡率明显下降（F=8381.21，P< 0.001）。
P53P21通过抑制TIMP-2表达促进人胶质瘤干细胞侵袭的机制研究的开题报告
P53P21通过抑制TIMP-2表达促进人胶质瘤干细胞侵袭的机制研究的开题报告一、研究背景胶质瘤是一种高度侵袭性的肿瘤，具有很高的死亡率。
近年来，研究表明胶质瘤干细胞起着重要的作用，是胶质瘤治疗中难以克服的难题。
因此，对胶质瘤干细胞分子调控机制的研究具有重要的意义。
P53是一种肿瘤抑制因子，与肿瘤的发生和发展密切相关。
P21是P53介导的抑癌基因。
研究表明，P53P21可以通过抑制细胞周期的进程，起到抑制肿瘤细胞增殖的作用。
而TIMP-2是一种金属蛋白酶抑制剂，具有抑制肿瘤细胞侵袭和转移的作用。
因此，本研究旨在探究P53P21通过抑制TIMP-2表达促进胶质瘤干细胞侵袭的机制，为胶质瘤的治疗提供新的思路和方法。
二、研究内容和方法1.研究内容通过建立胶质瘤干细胞模型，验证P53P21的抑癌作用和TIMP-2的抑制作用。
进一步研究P53P21是否能够通过抑制TIMP-2表达来促进胶质瘤干细胞的侵袭和转移。
2.研究方法2.1 建立胶质瘤干细胞模型选择人胶质瘤干细胞进行研究。
利用细胞培养技术和肿瘤球体培养技术，建立胶质瘤干细胞模型。
2.2 验证P53P21的抑癌作用和TIMP-2的抑制作用采用Western blotting技术检测胶质瘤干细胞中P53、P21和TIMP-2的表达水平，并采用MTT实验检测不同浓度P53P21和TIMP-2的抗增殖作用。
2.3 研究P53P21是否能够通过抑制TIMP-2表达来促进胶质瘤干细胞的侵袭和转移采用Transwell实验和Wound healing实验检测胶质瘤干细胞的侵袭和转移能力，观察P53P21和TIMP-2对胶质瘤干细胞侵袭和转移能力的影响。
三、研究意义和预期结果本研究可以对胶质瘤干细胞的分子调控机制有更深入的认识，为胶质瘤的治疗提供新的思路和方法。
预期结果是通过研究P53P21和TIMP-2的调控机制，探究P53P21是否能通过抑制TIMP-2表达来促进胶质瘤干细胞的侵袭和转移，为胶质瘤的治疗提供新的方向和方法。
p21研究进展综述-shx
p21在肿瘤中的研究进展摘要：p21基因是Clp家族中的一员，它是位于p53基因下游的细胞周期素依赖性激酶抑制因子。
p21可以和p53共同构成细胞周期G1检查站，因DNA损伤后不经过修复则无法通过，减少了受损DNA的复制和积累，从而发挥抑癌作用。
研究表明，p21与肿瘤的分化、浸润深度、增生和转移有关，具有判断预后的价值。
关键词：p21基因；肿瘤；细胞周期；基因多态性；细胞凋亡p21基因是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂家族中的重要成员。
它既与肿瘤抑制作用密切相关，又能抑制周期素。
周期素依赖激酶复合物活性，协调细胞周期、DNA复制与修复之间的关系，从而将肿瘤抑制作用与细胞周期控制过程紧密相连。
p21基因的发现、克隆及其在细胞周期控制与肿瘤发生中有非常重要的作用。
本文拟对p21在肿瘤中的研究进展，作一简要的综述。
1 p21的概述1.1 p21的发现Harpeer等在寻找CDK2的调节蛋白时发现了p21称其编码因子为CP1（CDK-interacting protein 1），并证明p21是CDK2和其他CDK的一个很好的抑制物，表明了p21在细胞分裂过程中起到一个关卡的作用。
V ogel stein等在寻找受p53转录调控的基因中，发现了p21基因，称之为WAF1( wild- type p53- activated fragment 1)。
当将它导入肿瘤细胞时，发现其与p53有同样的抑癌效应。
基于WAF1为p53所诱导和Cip1具有抑制cyclin - CDK的能力，又被命名为PIC1( p53-regulated inhibitor of CDKS)。
Smith等在研究细胞老化、寻找引起细胞衰老和丧失分裂能力的基因过程中发现了p21基因, 命名为SDI l ( senescent cell- derived inhibitor 1), 并证明SDI l能抑制DNA合成。
1.2 p21的作用机制p21直接与CDC2 ( CDK1), CDK2, CDK4和cyclin A, B,D, E共同参与形成具有酶活性的复合物, p21的分子克隆和纯化的p21蛋白在体外能与cyclin- CDK 重组成复合物,p21能作为一个潜在的普遍的CDK酶抑制剂, 从而能诱导细胞周期的停止。
苦参提取物
苦参提取物苦参提取物为豆科苦参属的植物苦参Sophora flavescens中提取的一种生物碱。
生于向阳山坡、灌丛及河岸沙地。
药材主产于山西、湖北、河南、河北及陕西秦岭。
苦参具有美白，消炎，抗痘，抗菌等多种效用，早在几百年前就被用于美容护肤，现在更是各大药妆亲睐的化妆品原料。
产品基本信息【中文名称】：苦参提取物【拉丁名称】：Radix Sophorae Flavescentis【英文名称】：Lighiyellow Sophora Root P.E【学名】：中文学名：苦参，别名：地槐、莵槐、骄槐、白茎、虎麻、岑茎、禄白、陵郎、苦骨、川参、凤凰爪、牛参、槐木、苦槐子、苦参子等【提取来源】：豆科植物苦参的干燥根【产品性状】：白色粉末无臭，味苦；久置露空气中，有引湿性，本品在乙醇、氯仿、甲苯、苯中极易溶解，在丙酮中易溶，在水中溶解，在热水、石油醚中略溶。
【产品规格】：苦参碱98% HPLC【植物形态】：落叶亚灌木，高1～3m。
根圆柱状，浅棕黄色，茎直立，多分枝。
幼枝青色，有疏毛，后变无毛。
羽状复叶；小叶25～29，披针形，长2～3cm，宽1～2cm，先端渐尖，基部圆形，下面密被平贴柔毛；总状花序顶生；花萼钟形，花冠淡黄色，旗瓣匙形，翼瓣无耳；雄蕊10，仅基部愈合；雌蕊1，子房柄被毛。
荚果线形，先端具长喙，节间紧缩不甚规则。
种子3～7粒，近球形，棕褐色。
花期5～7月。
果期7～9月。
【产地】：生于向阳山坡、灌丛及河岸沙地。
药材主产于山西、湖北、河南、河北及陕西秦岭。
【炮制方法】：春、秋二季采挖。
除去根头及小支根，洗净，干燥，或趁鲜切片，干燥。
后进行专业提取。
【化学成分】：含苦参碱（matrine）、氧化苦参碱（oxymatrine）、苦参醇碱（sophoranole）、N-甲基金雀花碱（N-methylcytisine）、安那吉碱（anagyrine）、膺靛叶碱（baptifoline）、脱氢苦参碱（sophocarpine）、D-异苦参碱（D-isomatrine）、苦参啶（kuraridin）、去甲苦参酮（norkurarinone）、苦参啶醇（kuraridinol）、苦参醇（kurarinol）、新苦参醇（neokurarinol）、去甲苦参醇（norkurarinol）、异苦参酮，另含芒柄花黄素（formononetin）。
MAPK信号通路
MAPK信号通路2008-06-04 21:50MAPK,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶。
研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有至关重要的作用。
研究表明，MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。
1并行MAPKs信号通路的组成及其活化特点在哺乳类细胞目前已发现存在着下述三条并行的MAPKs信号通路［1］。
1．1ERK（extracellularsignal-regulatedkinase）信号通路1986年由Sturgill等人首先报告的MAPK。
最初其名称十分混乱，曾根据底物蛋白称之为MAP2K、ERK、MBPK、RSKK、ERTK等。
此后，由于发现其具有共同的结构和生化特征，而被命名为MAPK。
近年来，随着不同MAPK家族成员的发现，又重新改称为ERK。
在哺乳类动物细胞中，与ERK相关的细胞内信号转导途径被认为是经典MAPK信号转导途径，目前对其激活过程及生物学意义已有了较深入的认识。
研究证实，受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联的受体和部分细胞因子受体均可激活ERK信号转导途径。
如：生长因子与细胞膜上的特异受体结合，可使受体形成二聚体，二聚化的受体使其自身酪氨酸激酶被激活；受体上磷酸化的酪氨酸又与位于胞膜上的生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的SH2结构域相结合，而Grb2的SH3结构域则同时与鸟苷酸交换因子SOS（SonofSevenless）结合，后者使小分子鸟苷酸结合蛋白Ras的GDP解离而结合GTP，从而激活Ras；激活的Ras进一步与丝／苏氨酸蛋白激酶Raf-1的氨基端结合，通过未知机制激活Raf-1；Raf-1可磷酸化MEK1／MEK2（MAPkinase／ERKkinase）上的二个调节性丝氨酸，从而激活MEKs；MEKs为双特异性激酶，可以使丝／苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化，最终高度选择性地激活ERK1和ERK2（即p44MAPK和p42MAPK）。
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收稿日期:2005-05-17作者简介:康洁(1967-),女,河南民权人,商丘师范学院副教授,主要从事细胞生物学和分子免疫学的教学与研究.第22卷第5期2006年10月商丘师范学院学报J OU RNAL O F SHAN GQ IU TEACH ERS COLL EGE Vol.22No.5October ,2006p 21基因对NIH 3T 3细胞生长的抑制作用康 洁(商丘师范学院生物系,河南商丘476000) 摘 要:为了证明p21是抑制细胞生长所必须的因子,我们用p21融合基因载体转染N IH3T3细胞,观察它的形态变化和生长周期,免疫印迹检测p21的表达和其下游蛋白PRb 的磷酸化情况.结果显示NIH3T3细胞出现了衰老样变化,生长周期延长,生长速度缓慢;在转染了p21基因的N IH3T3细胞中PRb 磷酸化程度降低.实验表明,过量表达的p21基因是通过降低PRb 磷酸化水平抑制DNA 的转录来抑制细胞生长的.关键词:N IH3T3细胞;p21基因;诱导表达;PRb 蛋白;生长抑制中图分类号:Q25 文献标识码:A 文章编号:1672-3600(2006)05-0133-04Inhibitory effect of p 21gene on the grow th of NIH 3T 3cellKAN G Jie(Department of Biology ,Shangqiu Teachers College ,Shangqiu 476000,China )Abstract :In order to p rove t hat p21was essential gene to rest rain t he growt h of cell ,used p21f usion gene vector to t ransfect N IH3T3cell ,observed t he morp hology changes and growt h cycle ,t he expression of p21and t he varation of downriver p rotein p hosp horylation were checked by immunoblotting.The result showed t hat N IH3T3cells revealed premat ure senescence 、growt h cycle prolonged and growt h speeding slowed ,prb ′sp ho sp horylation degree in N IH3T3cells infected by p21genes falled.This test showed t hat excessive exp ression p21genes inhibited t he growt h of cell t hrough debasing PRb p hosp horylation degree which leaded to inhibit t ranscription of DNA.K ey w ords :N IH3T3cell ;p21genes ;induced exp ression ;PRb ;inhibited growt h细胞衰老是当今生物学研究的主要热点之一,它与人类癌症的发生及衰老相关疾病的形成直接相关.多方面的研究表明;细胞衰老是一把双刃剑,在生命的早期抑制癌变和肿瘤的发生,有利于生命的健康;在生命的晚期促进细胞的癌化和衰老相关疾病的产生,所以,研究细胞衰老探讨其发生机理对预防治疗癌症和衰老相关疾病有重要意义.众多的实验证据表明:在衰老的细胞中p21基因过量表达[1-2],说明p21基因是一种细胞周期抑制因子;与细胞衰老相关p21基因,又是肿瘤抑制因子p53的直接靶点[3],与p19ARF 一起构成p19ARF /P53/p21Cip 信号通路,说明p21也是肿瘤细胞生长抑制因子,所以说,p21参与调节细胞周期、细胞分化、细胞凋亡等多种过程.但是p21基因是否对细胞衰老的发生起着必不可少的作用仍有待证明,为此,我们设计了该实验,在NIH3T3细胞中高表达p21基因,探讨p21基因对细胞生长的抑制作用,以期对细胞衰老机制的理解和阐明有所帮助.1 材料和方法111 质粒的扩增、纯化和鉴定按照《分子克隆实验指南》[4]上的方法扩增质粒p Retro -on 和p Retro -on -p21(朋友惠增).以“Nucleo Trap G el Extrac 2tion Kit ”DNA 纯化试剂盒(购自clonetech 公司)提取并纯化质粒.用1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定质粒.112 细胞的培养、转染和筛选(1)以含10%胎牛血清的DM EM 高糖培养基于37℃、5%的二氧化碳培养箱中培养293包装细胞和N IH3T3靶细胞.质粒转染前24h ,293细胞传代,使其贴壁后密度为40%-60%.(2)用脂质体介导的方法,以空载体p Retro -on 和p Retro -on -p21分别转染293细胞,3h 后换完全培养基,继续培养48h ,分别取细胞培养上清液,离心,得到两种含有p Pretro -on 和p Retro -on -p21的病毒粒子.(3)将得到的两种病毒载体加至细胞密度为30%-45%的N IH3T3靶细胞中,再以4μg/ml 的量加入脂质体polybrene ,浸染6h ,然后换新鲜的完全培养基.(4)将病毒浸染后的N IH3T3靶细胞按1∶4传代,以含116μg/ml 的嘌呤霉素的培养基筛选一周,获得抗生素抗性克隆,将其扩增,即得到转有外源基因的稳定的细胞株.113 细胞衰老的诱导在N IH3T3/p Retro -on -p21和N IH3T3/p Retro -on 细胞培养液中分别加入115μg/ml 脱氧四环素诱导p21基因的表达,4d 后用倒置显微镜观察细胞形态变化.114 测定细胞生长曲线胰酶消化对数生长期的N IH3T3/p Retro -on 细胞和N IH3T3/p Retro -on -p21细胞及未经诱导的NIH3T3/p Retro -on -p21细胞,制成单细胞悬液.取105个细胞接种于直径为60mm 的平皿中.待细胞贴壁后,在培养基中加入115μg/ml 脱氧四环素,以12h 为间隔,用血细胞板作细胞计数,未经脱氧四环素诱导的N IH3T3/p Retro -on -p21细胞作对照(C K ),绘制细胞生长曲线.115 检测p 21基因的表达图1 p Retro 2on 2p21质粒的鉴定M.DNA Marker 1.Not Ⅰ酶切,21Bam H Ⅰ酶切,31Xho Ⅰ/Sai Ⅰ酶切,41EcoR Ⅰ酶切,51K pnⅠ酶切分别用胰蛋白酶消化、收获经脱氧四环素诱导的NIH3T3/p Retro -on -p21与N IH3T3/p Retro -on 细胞和未经诱导的NIH3T3/p Retro -on -p21细胞(C K ),加入100μL的SDS 上样缓冲液,100℃煮沸裂解5min ,12%聚丙烯酰胺凝胶电泳.蛋白经SDS -PA GF 分离后,转至硝酸纤维素膜上,将膜用TBS 清洗2次,3%BSA -TBS 封闭30min ,室温下一抗(p21单抗)孵育2h ,T TBS (含013%Tween20的TBS )洗涤3次,加入碱性磷酸酯酶偶联的二抗(兔抗鼠血清)孵育,PBS 充分洗膜,最后加入5ml 含底物NB T/BCTP 的溶液避光显色.116 免疫印迹检测p Rb 的磷酸化水平方法同115,做聚丙烯酰胺凝胶电泳时改用6%的SDS -PA GE ,p Rb 单抗做一抗.2 结果211 p Ret ro -o n 和p Ret ro -on -p 21质粒的鉴定琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示,根据p Retro -on 图谱和p21基因的限制性内切酶位点分析所得结果正确.212 N IH 3T 3细胞衰老形态出现和生长抑制经脱氧四环素诱导的N IH3T3/p Retro -on -p21细胞形态发生了明显变化,与N IH3T3/p Retro -on 细胞相比细胞变得宽大、铺展、形态不规则,有的细胞还出现空泡化和多核现象,如图2.而且,诱导的N IH3T3/p Retro -on -p21细胞与N IH3T3/p Retro -on 细胞和未经诱导的N IH3T3/p Retro -on -p21细胞相比生长速度十分缓慢,分裂周期大大延长,如图3,说明细胞生长抑制是p21基因的表达,而非脱氧四环素引起的.213 p 21基因的表达和p Rb 的磷酸化水平降低转染有p Retro -on 和p Retro -on -p21的两株细胞,经脱氧四环素诱导后2d ,做免疫印迹实验.结果表明p21基因得到显著表达,如图4;在诱导表达了p21的N IH3T3/p Retro -on -p21细胞中,p Rb 的磷酸化水平显著降低,如图5.431商丘师范学院学报 2006年 图2 a.经四环素诱导的N IH3T3/p Retro 2on 细胞 b.经四环素诱导的N IN3T3/p Retro 2on 2p21细胞 图3 免疫印迹检测p21基因的表达11加115μg/ml 脱氧四环素的N IH3T3/p Retro 2on 细胞21未加脱氧四环素的NIH3T3/p Retro 2on 2p21细胞(C K )31加115μg/ml 脱氧四环素的N IH3T3/p Retro 2on 2p21细胞 图4 转染后N IH3T3细胞的生长曲线Ⅰ加115μg/ml 脱氧四环素的NIH3T3/p Retro 2on 2p21细胞Ⅱ未加脱氧四环素的N IH3T3/p Retro 2on 2p21细胞(C K )Ⅲ加115μg/ml 脱氧四环素的NIH3T3/p Retro 2on细胞图5 转染后NIH3T3细胞中p Rb 的磷酸化水平 11加115μg/ml 脱氧四环素的NIH3T3/p Retro 2on 细胞 21加脱氧四环素的N IH3T3/p Retro 2on 2p21细胞(C K ) 31加115μg/ml 脱氧四环素的N IH3T3/p Retro 2on 2p21细胞3 讨论关于p21是否是细胞衰老必不可少的因子一直存在着两种相互矛盾的观点,多数研究表明p21在细胞衰老过程中起重要作用,而Pantoja C [5]和Obata M [6]的研究结果说明高水平的p21未必能引起细胞衰老.为了探讨p21的表达对细胞生长起何种作用,我们将p21基因真核表达载体p Retro -on -p21用逆转录病毒介导的方法导入鼠永生化细胞NIH3T3中,经嘌呤酶素筛选,得到稳定整合有p21基因的细胞株.通过脱氧四环素诱导p21基因表达,其转化细胞发生了明显的表型变化,细胞变得宽大、铺展、形态不规则,折光率降低,细胞生长明显受到抑制.说明p21基因的表达抑制细胞的生长,促进了N IH3T3细胞的衰老,至少在鼠细胞中如此.为研究p21抑制细胞生长的机理,我们又检测了p21下游蛋白p Rb 的磷酸化水平,结果表明,未表达p21的细胞中p Rb 以磷酸化形式存在,经诱导衰老的细胞中p Rb 以去磷酸化状态存在.这提示p21所引起的细胞生长抑制是通过降低p Rb 磷酸531 第5期 康洁:p21基因对NIH3T3细胞生长的抑制作用631商丘师范学院学报 2006年 化水平,使与p Rb结合的E2F基因转录因子不能被释放出来,因而不能进行DNA复制实现的.细胞的衰老和生长抑制与细胞周期调控紧密相关,在细胞周期运行中有众多的调节因子,其中CD Ks能促进细胞G1期向S期转换,而它的活性反过来被C KIs抑制.p21就是C KIs家族成员之一,与CD K2相关复合体结合,抑制CD K2的活性,进而使p Rb处于有活性的去磷酸化状态,p Rb与转录因子E2F牢牢结合,使E2F失去活性,DNA不能合成,细胞周期不可逆停滞,细胞发生衰老.p21是肿瘤抑制因子p53的直接靶点,当细胞的分裂次数增多或受到损伤时,p53活性升高,p21水平随之升高,最终使肿瘤细胞分裂速率降低,所以p21也是肿瘤抑制因子.根据本实验结果,我们推测,在肿瘤细胞内激活其内在的p21表达机制可能会阻碍肿瘤细胞的进一步分裂,在即将走向衰老的细胞内降低p21的表达量可能会延缓细胞的衰老,这将不失为治疗肿瘤和衰老相关疾病的一种潜在的有效方法.参考文献:[1] Noda A,Ning Y,Venable SF,et al.Cloning of senescent cell-derived inhibitors of DNA synthesis using an expressionscreen[J].Exp.Cell Res.,Mar,1994,211(1):90-98.[2] Chang BD,Watanabe K,Broude EV,et al.Effects of p21(Wafl/Cip/Sdil)on cellular gene expression:Implications for carcinogen2esis,senescence,and age-related diseases[J]A,2000,97(8):4291-4296.[3] Itahana K,Dimri G,Campisi J.Regulation of cellular senescence by p53[J].Eur J Biochem,2001,268(10):2784-2791.[4] 斯佩克特D L,戈德曼R D,莱因万德L A,等.分子克隆实验指南[M].北京:科学出版社,2001.121-132.[5] Pantoja C,Serrano M.Murine fibroblasts lacking p21undergo senescence and are resistant to transformation by oncogenicRas[J].Sep,1999,18(35):4974-4982.[6] Obata M,Imamura E,Y oshida Y,et 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