博士专题：基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
植物功能基因组研究中的基因敲除技术
植物功能基因组研究中的基因敲除技术植物基因敲除技术是近年来植物功能基因组研究中的一项重要技术。
通过该技术可以精准地删去植物基因组中的某个基因，从而研究该基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
下面我们将详细介绍植物基因敲除技术的原理和应用。
一、植物基因敲除技术的原理植物基因敲除技术是通过基因编辑技术实现的。
目前主要有CRISPR/Cas9和TALEN两种技术用于植物基因编辑。
这两种技术都是利用人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA 序列，从而实现基因敲除。
先来介绍一下CRISPR/Cas9技术。
CRISPR是一种天然存在于细菌中的免疫系统。
通过CRISPR系统，细菌可以识别并摧毁侵入其体内的病毒DNA。
科学家们发现，CRISPR系统中有一种酶叫做Cas9，可以切割DNA序列。
利用人工合成的RNA序列，可以将Cas9定位到需要切割的基因上，并切割掉该基因。
这样就实现了精准的基因敲除。
TALEN技术原理类似于CRISPR/Cas9，也是通过人工合成的核酸序列，精准地识别和切割目标基因的DNA序列。
TALEN技术主要是利用一种叫做TALEN（转录激活样核酸酶）的酶来实现基因敲除。
二、植物基因敲除技术的应用植物基因敲除技术已经成为植物功能基因组研究中的一项重要技术。
它可以用于研究植物生长、发育和代谢等方面的功能。
以下是该技术的一些具体应用：1.研究基因功能植物基因敲除技术可以用于研究基因在植物生长、发育和代谢等方面的功能。
通过敲除某个基因，可以观察其对植物生长、发育和代谢等方面的影响。
这种方法可以帮助科学家们更好地了解植物基因的功能。
2.筛选基因植物基因敲除技术可以用于筛选植物基因。
在研究植物新陈代谢方面，需要筛选大量的植物基因，以了解这些基因在植物代谢中的作用。
植物基因敲除技术可以快速地筛选出与目标代谢过程相关的基因，从而加速研究进程。
3.改良植物品种植物基因敲除技术可以用于改良植物品种。
基因敲除技术在治疗疾病中的应用
基因敲除技术在治疗疾病中的应用基因敲除技术是一种利用基因编辑工具将指定基因从宿主生物细胞中永久性删除的技术。
该技术可以用于治疗一系列遗传疾病，包括肿瘤、家族性高胆固醇血症和免疫系统疾病。
本文将介绍基因敲除技术在治疗疾病中的应用，以及其在未来可能面临的挑战。
基因敲除技术的原理和发展基因敲除技术的核心是CRISPR-Cas9系统，它是一种常见的基因编辑工具，主要包括两个部分：Cas9蛋白和guideRNA。
Cas9蛋白具有DNA内切酶活性，guideRNA则指导Cas9与靶基因特异性结合，并切断其DNA链。
通过设计合适的guideRNA，可以将指定基因从细胞中删除，从而达到治疗疾病的目的。
近年来，随着对CRISPR-Cas9系统的深入研究和技术改进，基因敲除技术已经在动物模型和临床试验中得到了广泛应用。
以人类肝癌为例，科学家们利用基因敲除技术成功抑制了肝癌细胞的生长，并为肝癌患者寻找到了新的治疗思路。
此外，基因敲除技术还可以用于治疗遗传性疾病，如囊性纤维化、亚历山大病和色素性视网膜炎。
这些疾病通常由单一基因突变引起，基因敲除技术可以针对这些基因的异常表达或功能进行调整，从而达到治疗疾病的目的。
基因敲除技术的应用前景和挑战虽然基因敲除技术在治疗疾病中展现出了巨大的潜力，但其应用仍然面临许多挑战。
首先，基因敲除技术存在着非特异性的风险，即同样会影响其他与目标基因相关的基因。
这可能导致一系列不良反应，包括肝脏和肾脏功能减退、免疫功能低下等。
此外，基因敲除技术的精度和效率也需要不断得到改进。
虽然CRISPR-Cas9系统是一种高效的基因编辑工具，但其编辑效率仍然存在着一定的误差率和局限性。
目前，研究人员正在研发更加精确和高效的基因敲除工具，并探索基因敲除技术的新应用领域。
结论总之，基因敲除技术是一种重要的基因编辑工具，可以用于治疗许多遗传性疾病。
尽管存在着一些挑战和限制，但随着技术的不断发展和完善，基因敲除技术有望成为未来治疗各种疾病的有力工具。
基因敲除技术
基因敲除技术1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术基因敲除是一种通过将目标基因删除或改变其序列来研究该基因功能
的方法。
这一技术通常使用胚胎干细胞或转基因动物模型，方法是设计一
种包含两个草图和背靶RNA的末梢引物，然后将引物引导向目标基因的编
码序列，并在细胞合成双链DNA后通过NHEJ或HDR途径来进行切除修复，这会导致目标基因的敲除或替代。
通过比较敲除基因和野生型对照组织的
差异，科学家可以确定该基因在特定生物过程中的功能。
基因敲除技术
基因敲除技术1．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
2．实现基因敲除的多种原理和方法：2．1． 利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
2.1.1利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：a． 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
b．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]ｃ．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
分子生物学研究中的基因操纵技术
分子生物学研究中的基因操纵技术一、引言分子生物学一直是生物学研究的重要方向之一，其中基因操纵技术发挥着重要作用。
基因操纵技术是指通过人为手段改变生物体内某个基因的表达或结构，从而达到特定的研究目的。
本文将从基因操纵技术的定义、分类、原理、应用等方面进行探讨。
二、基因操纵技术的分类基因操纵技术可以根据其作用机理不同进行分类。
这里我们将其分为以下三种。
1. 基于功能的基因操纵技术：该技术是通过改变或剥夺一个基因的功能，来分析该基因的功能以及整个生物体的代谢和生理过程。
其中最常用的方法是Knockout（KO）和Knockin（KI）。
· Knockout技术：针对一个基因，将其打靶，使其失去功能。
常见方法包括基因敲除、RNA干扰、甲基化等方法。
例如，通过基因敲除技术，可以研究某个基因对细胞增殖、细胞分化或细胞凋亡的影响。
· Knockin技术：将外源DNA序列或它的突变体整合到目标基因的遗传位点上。
主要包括修饰基因的结构或功能，添加报告基因等。
例如，通过添加报告基因（如绿色荧光蛋白，GFP）在细胞和组织水平观察基因的表达和定位。
2. 依赖于DNA重组的技术：该技术是通过改变DNA序列，来寻找特定的功能基因组拆分，如插入外源DNA序列、通过替换来改变基因活性等。
其中最常见的技术为：·制造转基因：外源基因插入到宿主细胞中，形成转基因。
例如转基因水稻、转基因小麦等。
·化学诱变：通过化学诱变，诱发DNA之间的相互重组，引起植物基因的变异，从而筛选出有利的突变体。
例如，通过化学诱变对菜心、大葱、卷心菜和草莓等进行诱变。
·基因工程：通过基因工程技术，改变植物中代谢通路或抗病性基因等的表达或结构，从而提高植物的产量和耐受性。
3. 基于RNA技术的基因操纵技术：RNA技术主要通过基于RNA的基因靶向打靶靶向调节RNA特异性被调控的机制实现的。
包括RNA干扰（RNAi）和RNA修饰（RNAmod）。
动物基因编辑技术的研究与应用
动物基因编辑技术的研究与应用随着生物技术的不断发展，动物基因编辑技术也逐渐成为生物科学研究中的重要领域。
动物基因编辑技术是指通过人工手段对动物基因进行删减、插入或修改，从而达到精确控制动物基因表达，改变动物特性的目的。
该技术具有很高的准确性和灵活性，可以用于诊断和治疗遗传病、基因工程、生物学研究等方面。
一、动物基因编辑技术动物基因编辑技术主要包括三种方式：转基因、基因敲除和基因修饰。
1. 转基因技术转基因技术是指将外源基因或异种基因导入动物体内，从而使其产生新型或改良的性状。
该技术主要应用于生产优良动物品种，改进生物制品及其它方面。
转基因技术一般采用基因枪或基因导入技术将外源基因导入动物体内。
转基因技术的优点在于它可以在较短的时间内获得高水平的转基因动物，并且可以实现病毒抗性等目标。
2. 基因敲除技术基因敲除技术是指将目标基因取代或删除，从而达到产生相应突变体的目的。
该技术主要应用于研究基因功能、疾病的发生机理等方面。
基因敲除技术主要通过引入外源DNA（例如: Cre-loxP）或RNA干扰技术，从而消耗目标基因的产物。
3. 基因修饰技术基因修饰技术是指通过人为干预改变基因表达的过程，从而实现控制动物特性的目的。
常见的基因修饰技术包括：CRISPR/Cas9基因编辑技术、TALEN基因编辑技术和ZFN基因编辑技术。
基因修饰技术的特点在于它可以针对目标基因进行特异删减和修饰，并且可以通过筛选出致病基因，在体细胞及早期胚胎阶段对遗传病进行有效治疗。
二、动物基因编辑技术的应用动物基因编辑技术的应用范围非常广泛，从医学、食品安全、环境保护到基础学科研究等方面都有应用和发展。
1. 医学应用动物基因编辑技术在医学领域的应用主要是用于诊断和治疗遗传病和某些基因突变相关病症的研究。
这种技术可以精确地进行基因修饰和基因敲除，帮助治疗一些难以治疗的疾病，例如：肺癌、糖尿病、血友病等。
2. 食品安全应用动物基因编辑技术在食品安全方面的应用具有很大的前景。
基因敲除技术
基因敲除（gene knock-out)又称基因打靶，该技术通过外源 DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定位修饰和 基因改造，具有专一性强，染色体DNA可与目的片段共同稳 定遗传等特基因敲除 现阶段常用的四种定位重组系统：噬菌体的Cre/Loxp系统，Gin/Gix系统，酵母细胞的FLP/FRT系统和R/RS 系统。
(2)导入受体细胞:用电穿孔、显微注射等方法把重组ＤＮＡ转入受体细胞核
内;
(3)筛选:用选择性培养基筛选已击中的细胞，筛选方法有Southern杂交，PCR
扩增，正负选择; (4)检测:观察被击中细胞的生物学特征,将已击中的胚胎干细胞转入胚胎使其生 长,对转基因动物进行形态学及分子生物学检测。
（a）利用neo基因 替换目的基因外显 子Ⅳ指外显子Ⅵ区 段，得到IAP基因 敲除的ES细胞。 （b） Southern印迹 实验
除了基因敲除 法，还有人用 基因捕获的方 法通过随机插 入突变破坏靶 基因表达。
除了研究基因功能外，基因敲除技术还被广泛应用于 建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供遗 传学数据，为遗传病的治疗，为生物新品种的培育奠 定新基础。
基因敲除技术
基本原理
高等动物基因敲除技术 植物基因敲除技术
基本原理
经典遗传学（forward genetics，正向遗传学）
即从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出 该基因的编码序列。
现代遗传学（reverse genetics，反向遗传学） 即从基因序列出发，推测其表型，进而推导出该基 因的功能。 基因敲除技术就是现代遗传学研究中的一个重要的技术手段。
完全基因敲除一般采 用取代型和插入型，
条件型基因敲除
高等动物基因敲除技术
博士专题：基因功能研究技术之基因敲除与基因编辑技术
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制：
有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结
基因编辑技术CRISPRCas9的应用方法总结CRISPR-Cas9基因编辑技术是一种革命性的生物工程工具，它利用细菌体内天然存在的免疫系统来精确修改基因。
自从2012年首次引入以来，CRISPR-Cas9已经被广泛用于改变生物学研究和医学治疗的方式。
本文将介绍CRISPR-Cas9的原理、应用方法，并总结其在不同领域的应用。
### CRISPR-Cas9的原理CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）是一种存在于细菌和古生菌基因组中的DNA序列，它记录了它们所受到的外来病毒基因组的片段。
Cas9是CRISPR系统中的一种蛋白质，具有剪切DNA 的能力。
利用这种系统，科学家们成功将CRISPR-Cas9技术应用于编辑生物体的基因。
CRISPR-Cas9系统的工作原理如下：1. 选择目标基因：确定需要编辑的特定基因序列，并设计与其互补的RNA引导分子（sgRNA）。
2. sgRNA的结合：通过合成互补基因组DNA片段成为单链RNA，与Cas9蛋白结合成一个复合物。
3. 定位到基因组：CRISPR-Cas9复合物进入靶细胞，通过与目标基因的序列互补对应，定位到特定的基因位点。
4. 剪切DNA：Cas9蛋白通过剪切DNA的方式精确修改目标基因，形成双链断裂。
5. 修复机制介入：细胞自身的DNA修复机制介入，通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式修复双链断裂。
6. 基因修复：通过修复机制，引入目标基因的缺陷或修复，实现基因编辑。
### CRISPR-Cas9的应用方法CRISPR-Cas9技术的应用方法主要包括基因敲除、基因敲入和基因打靶等。
下面将详细介绍这些方法：#### 1. 基因敲除基因敲除是指通过CRISPR-Cas9技术使目标基因完全失活。
其步骤如下：- 设计sgRNA：选择目标基因的外显子序列，设计与之相互配对的sgRNA。
基因敲除
二、基因敲除的方法
利用随机插入突变进行基因敲除。 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体 的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组 利用同源 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因 的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操 重组 作的工作量，限制了该项技术的应用 组范围内敲除任一基因目。 传统基因 敲除方法 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染 细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因 之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点 地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改 应用随机 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插 变细胞遗传特性的目的。 插入突变 入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲 除手段
二、基因敲除的方法
CRISPER/Cas系统的由来：
CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） 广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统， 该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。
CRISPR/Cas系统的分类：
TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质 量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌 体DNA或是外源质粒。
CRISPR/Cas的基因座结构
5'端为tracrRNA基因
CRISPR cas9基因敲除原理及其应用
CRISPR cas9基因敲除原理及其应用CRISPR Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) 是一种新兴的基因编辑技术，它利用CRISPR系统和Cas9酶实现对基因组的精确编辑。
本文将对CRISPR Cas9的基本原理进行详细介绍，并探讨其在生物学研究、医学治疗和农业育种等领域的应用前景。
一、CRISPR Cas9基因敲除原理CRISPR Cas9基因敲除是利用CRISPR-Cas9系统对目标基因进行精确编辑的一项技术。
CRISPR是细菌和古细菌天然免疫系统中的一种防御机制，能够通过记录并抵御外源DNA入侵来保护细菌免受病毒感染。
而Cas9是CRISPR系统中的核酸酶，具有裁剪并去除外源DNA的功能。
CRISPR Cas9基因敲除的基本步骤如下：1.设计合适的引导RNA（gRNA），通过与目标基因序列特异性结合，将Cas9酶精确引导到目标基因的靶位点。
2.Cas9酶与gRNA结合后形成复合物，通过靶向性的DNA酶切活性，在目标位点引发DNA双链断裂。
3.在细胞的DNA修复过程中，通过非同源末端连接（Non-Homologous End Joining，NHEJ）机制，导致插入或缺失DNA碱基，从而实现基因的敲除。
二、CRISPR Cas9基因敲除的应用CRISPR Cas9基因敲除技术在生物学、医学和农业领域有着广泛的应用前景。
1.基因功能研究：通过敲除特定基因，科研人员可以深入了解该基因在生物体内的功能以及相关的生理和病理过程。
CRISPR Cas9技术的高效性和精确性使得基因功能研究更加便捷和可靠。
2.疾病治疗：基于CRISPR Cas9技术，科学家可以直接敲除或修复与疾病相关的基因突变，为基因治疗提供了新的途径。
例如，将CRISPR Cas9应用于肿瘤治疗，可以针对肿瘤细胞中的特定基因进行敲除，达到抑制肿瘤生长和扩散的目的。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
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（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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Cre/loxP系统作. 用原理示意图
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FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
基因敲除技术研究进展及其应用
目录
01 一、基因敲除技术的 基本原理和历史发展
02
二、基因敲除技术的 最新研究进展
03
三、基因敲除技术的 应用实例
04 四、未来展望
05 参考内容
基因敲除技术是一种重要的分子生物学研究工具，它通过删除或灭活特定基 因，研究基因功能以及其对细胞生命活动的影响。近年来，随着基因敲除技术的 不断发展和优化，其在医学、生物学等领域的应用也越来越广泛。本次演示将介 绍基因敲除技术
在工业领域，基因敲除技术主要应用于微生物工程、生物制药等领域。利用 基因敲除技术，科学家们可以改造微生物和菌种，提高微生物的工业发酵效率和 产率，为生物制药和化工生产等领域提供有效手段。
近年来，基因敲除技术的研究进展迅速，新的技术和应用不断涌现。例如， 通过结合基因编辑技术，科学家们可以实现对特定基因的精细调控，从而达到更 高的目标基因敲除效率；此外，利用基因敲除技术，科学家们还成功培育出多种 新型生物材料和工业菌种，为相关领域的发展带来了新的突破。
四、未来展望
随着基因敲除技术的不断发展和优化，未来其在医学、农业、生物学等领域 的应用前景将更加广阔。但同时也面临着一些挑战和问题。首先，如何提高基因 敲除技术的准确性和效率仍然是需要解决的重大问题。其次，如何将基因敲除技 术应用到更多的
生物物种和细胞类型中也是一个具有挑战性的问题。此外，如何在确保有效 性的同时降低基因敲除技术的成本和风险也是一个需要和研究的问题。
1、优点
基因敲除技术具有许多优点。首先，它是一种精确的基因编辑手段，可以准 确地在特定位置敲除或替换基因。其次，基因敲除技术可以用于研究基因的功能 及其对细胞生命活动的影响，有助于深入了解生命的本质和规律。此外，基因敲 除技术还可以用
生命科学中的基因修饰技术
生命科学中的基因修饰技术随着基因科学的不断发展，基因修饰技术已经逐渐成为生命科学中的一个关键领域。
基因修饰技术可以通过改变或修复人类或动物体内的基因来治疗疾病，甚至改善生物体的功能。
此外，基因修饰技术还可以用于改善农作物或动物品种，提高食物品质，增加农业产量等。
基因修饰技术的种类基因修饰技术有很多种类，包括基因敲除、基因导入、CRISPR/Cas9基因编辑技术等。
其中最常见的技术为基因敲除和基因导入技术。
基因敲除是指人工地使某个基因失去活性或抑制其表达的过程。
通过基因敲除技术，研究人员可以了解一个基因在细胞或生物体中所起的作用。
此外，基因敲除也有助于发现某些基因与疾病之间的关联，从而开展更精准的疾病治疗。
相对于基因敲除技术，基因导入技术则是指将人工合成的基因导入到细胞或生物体中的过程。
通常情况下，研究人员利用基因导入技术将一个正常的、健康的基因导入到缺陷细胞或身体中，以恢复生物体的健康状态。
例如，利用基因导入技术可以导入正常的血红蛋白基因来治疗镰状细胞贫血。
CRISPR/Cas9基因编辑技术是在基因敲除和基因导入技术的基础上发展出来的一种新型的基因修饰技术。
它具有更高的精准度和更快的速度。
此外，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，研究人员可以更精确地修改某个基因的序列，以修饰人类或动物的性状。
基因修饰技术在生物医学中的应用基因诊断、基因治疗和基因药物研究是基因修饰技术在生物医学中的重要应用。
基因诊断是指通过检测人体内的基因变异来诊断某种疾病。
例如，利用基因诊断技术可以检测出乳腺癌或卵巢癌的遗传风险，从而及早进行预防和治疗。
基因治疗则是指利用基因修饰技术来治疗某些遗传性疾病。
例如，利用基因导入技术可以将正常的基因导入到患有缺陷基因的细胞或组织中，从而治疗疾病。
此外，CRISPR/Cas9基因编辑技术则具有更为精准的基因治疗应用前景。
基因药物研究则是指利用基因修饰技术来研究新型药物。
基因药物对某些疾病有着极佳的疗效，因此成为了当今生物医学领域中备受关注的领域。
基因敲除技术的优势与劣势分析
基因敲除技术的优势与劣势分析基因敲除技术是一种尖端的生物技术方法，通过选择性地抑制或消除特定基因的表达，可以帮助科学家们揭示基因功能、研究疾病机制、改良农作物品质以及培育转基因动物等方面发挥重要作用。
然而，任何一种技术手段都会存在优势与劣势，基因敲除技术也不例外。
本文将对基因敲除技术的优势与劣势进行分析，以帮助更好地理解这一技术的应用前景。
首先，基因敲除技术具有以下几个明显的优势。
第一，它能够精确地研究目标基因或基因家族的功能。
通过敲除特定基因，研究人员可以观察到单个基因敲除对生物体的影响，进而推断出该基因所起到的作用。
第二，基因敲除技术可以帮助鉴定疾病相关的基因。
通过将目标基因敲除或抑制，可以明确判断该基因是否与某种疾病有关，并进一步研究疾病的发生机制。
此外，基因敲除技术在药物研发和治疗方面也具有潜在的优势，它可以帮助筛选出与疾病相关的靶标基因，并测试候选药物的疗效。
最后，基因敲除技术对于转基因植物和动物的研究也起到了非常重要的作用，可以实现农作物的品质改良和人工培育出符合人类需要的转基因动物。
然而，基因敲除技术也存在一些劣势和限制。
首先，敲除一个基因可能会导致其他基因的变化。
因为基因之间存在相互作用和调控关系，敲除某个基因可能会引发级联反应，产生一系列的变化，从而造成研究结果的复杂性和不确定性。
其次，基因敲除技术只能对单一目标进行干预，不能同时作用于多个基因。
在研究基因家族或信号通路时，可能需要使用其他技术手段来实现多个基因的改变，以得到更准确的结果。
此外，基因敲除技术在应用上还存在诸多技术难题，如基因敲除效率不高、选择性敲除困难等问题，限制了其在实际应用中的推广和应用。
综上所述，基因敲除技术作为一种重要的基因功能研究方法，具有较多的优势。
它可以精确地、单一地研究特定基因的功能，鉴定疾病相关基因，推动药物研发和治疗，改良农作物品质，培育转基因动物等方面发挥作用。
然而，在应用中，我们需要考虑到基因敲除会产生其他基因变化、不能同时作用于多个基因、技术难题等劣势和限制。
基因敲除技术的优势与劣势分析与对比评价
基因敲除技术的优势与劣势分析与对比评价基因敲除技术是遗传学领域的一项重要工具，可以通过特定的方法来使细胞或生物个体中某个特定基因的功能完全丧失或失活。
这项技术在基因功能研究、药物开发和疾病治疗等方面具有广泛的应用前景。
然而，它也存在一些优势和劣势，需要进行详细的分析和评价。
首先，我们来探讨基因敲除技术的优势。
其一，基因敲除技术可以帮助科学家研究基因在生物体内的功能和作用。
通过敲除特定基因，研究人员能够观察到在该基因缺失的情况下生物体的表型变化，从而推断出该基因的功能。
这对于揭示基因背后的分子机制和细胞过程具有重要意义。
其二，基因敲除技术可以为药物发现和开发提供有力的工具。
通过敲除特定基因，研究人员可以模拟某些疾病状态，比如癌症，从而寻找治疗该疾病的药物靶点。
这种拟人细胞和动物模型的制作可以加速药物筛选和致效物的发现，为新药的研发提供更多可能性。
其三，基因敲除技术还可以帮助人们治疗遗传性疾病。
通过敲除导致疾病的基因，可以有效地阻断疾病的发展。
例如，基因敲除技术已经成功地应用于治疗一些单基因疾病，如囊性纤维化。
然而，基因敲除技术也存在一些劣势需要考虑。
其一，敲除一个基因有时可能导致其他基因的表达发生变化，从而产生不可预测的效应。
这使得研究人员在选择敲除目标基因时需要慎重考虑，以避免产生意想不到的结果。
其二，基因敲除技术的实施相对复杂，需要较高的技术水平和昂贵的设备。
这使得该技术对于一些实验室和研究机构来说可能不太容易实现。
此外，敲除基因在动物模型中的应用也需要遵守伦理和动物保护方面的规定。
最后，我们对基因敲除技术进行对比评价。
基因敲除技术与其他相关技术相比，如基因沉默和基因编辑技术，具有独特的优势和适用范围。
相对于基因沉默技术，基因敲除可以更直接地观察到基因失活后的表型变化，从而更准确地判断基因的功能。
相对于基因编辑技术，基因敲除技术相对简单和直接，更适用于对于特定基因功能的验证研究。
综上所述，基因敲除技术具有广泛的应用前景，可以用于基因功能研究、药物开发和疾病治疗等领域。
基因敲除和过度表达的技术原理和应用
基因敲除和过度表达的技术原理和应用近年来，生命科学技术发展迅猛，其中基因敲除和过度表达技术受到广泛关注。
这两种技术本质上都是针对生物体中基因表达失衡的问题，采用人工干预的方法来改变基因表达水平，对于基因功能研究和治疗疾病具有重要意义。
基因敲除技术的原理是通过对靶基因的DNA序列进行修饰或删除，使其不再产生功能性蛋白质。
这种技术现在主要分为两种方法：基于核酸相互作用介导的敲除和基于CRISPR/Cas9系统的敲除。
前者在具体实施时需要设计并合成目标基因的专一RNA （siRNA、shRNA和miRNA等）与细胞内RNA诸如RISC结合后介导DNA降解，最终生成dsRNA插入靶基因的mRNA，从而实现其敲除的目标。
后者的工作原理比较复杂，主要基于CRISPR/Cas复合物介导的DNA位点的切割，进而导致基因的敲除。
这种方法直接利用了细菌和古生物的天然防御机制，通过引入外源的RNA-guided nuclease蛋白质Cas9和定制的肺腺瘤衍生的CRISPR序列，利用这个复合物切割目标基因的DNA序列来达到敲除的效果。
应用这两种方法可以产生同一个功能性蛋白对应的数个不同的靶标细胞，从而实现基因功能改变的研究或治疗。
相比较而言，过度表达技术同样应用了人工干预的方法来调节基因表达水平，但其目的是让靶基因产生更多的蛋白，而非不产生或将其量降到极致。
过度表达技术的实现方法就是将某些外源分子水平和特定的基因放入至目标细胞。
这种方法与选择肿瘤细胞及人类免疫缺陷病毒共存的细胞系也很相似。
其主要应用于研究基因的过度表达如何通过诸如癌症等生病的方式来影响整个生物过程的机制，同时还可以为癌症治疗进行一系列研究以找到潜在药物治疗方案。
基因敲除和过度表达技术各有其优缺点。
相比基因敲除，过度表达技术更不可控，其有可能导致严重的基因突变和细胞增殖，并建立起严重且不可预知的副作用的潜在可能。
然而，这种技术也具有更明显和迅速的效果，是寻找药物治疗方案的极佳选择。
基因敲除技术
细菌的基因工程技术是本世纪分子生物学史上的一个重大突破， 而基因敲除技术则可能是遗传工程中的另一重大飞跃。它为定向改 造生物，培育新型生物提供了重要的技术支持。
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③.由于RNAi能高效特异的阻断基因的表达，它成为研究信号传导通 路的良好工具。
④.RNAi还被用来研究在发育过程中起作用的基因，如可用RNAi来阻 断某些基因的表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的增殖和分化过 程中其起着关键作用。
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基因敲除技术的应用
①．建立生物模型
在基因功能，代谢途径等 研究中模型生物的建立非常重 要。基因敲除技术就常常用于 建立某种特定基因缺失的生物 模型，从而进行相关的研究。 这些模型可以是细胞，也可以 是完整的动植物或微生物个体。 最常见的是小鼠。
定义2：将细胞基因组中某基因去除或使基因失去活性的方法。敲除的基因用 以观察生物或细胞的表型变化，是研究基因功能的重要手段。 所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）
定义3：在基因组水平上改变或破坏靶基因的结构，使其功能完全丧失的实验 技术。 所属学科：遗传学（一级学科）；发育精品遗课件传学（二级学科）
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②.提供ห้องสมุดไป่ตู้价的异种移植器官
众所周知，器官来源稀少往往是人体器官移植的一大制约因素， 而大量廉价的异种生物如猪等的器官却不能用于人体。这是因为异 源生物的基因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源分子，如 果能将产生这些异源分子的基因敲除，那么动物的器官将能用于人 体的疾病治疗，这将为患者带来具大的福音。
基因敲除简介
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
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cas9基因敲除原理
cas9基因敲除原理Cas9基因敲除原理。
Cas9基因敲除是一种常用的基因编辑技术，它可以通过引导RNA的辅助下，精准地切割DNA分子，从而实现对特定基因的敲除。
这一技术的应用广泛，不仅在基础科学研究中发挥着重要作用，还在农业、医学等领域具有巨大的潜力。
本文将从Cas9基因敲除的原理、操作流程和应用前景等方面进行介绍。
首先，我们来了解一下Cas9基因敲除的原理。
Cas9是一种细菌免疫系统中的蛋白质，它具有特异性的DNA切割活性。
在基因敲除过程中，研究人员首先设计并合成一段特定序列的引导RNA（gRNA），该gRNA能够与目标基因的特定区域形成互补配对。
一旦gRNA与目标基因结合，Cas9蛋白就会被激活，与gRNA一起形成复合物，并精准地识别并切割目标基因的DNA分子。
这样，就实现了对目标基因的敲除。
接下来，我们将介绍Cas9基因敲除的操作流程。
首先，研究人员需要选择目标基因，并设计合适的gRNA序列。
随后，合成gRNA，并与Cas9蛋白质一起导入到目标细胞中。
在细胞内，Cas9/gRNA复合物将与目标基因结合，并引发DNA双链切割。
细胞为了修复这一切割，可能会出现非同源末端连接或同源重组等修复方式，从而导致目标基因的敲除。
通过这一系列操作，研究人员就可以实现对目标基因的精准敲除。
最后，我们来探讨一下Cas9基因敲除技术的应用前景。
目前，Cas9基因敲除技术已经被广泛应用于基因功能研究、疾病治疗、农作物改良等领域。
在基因功能研究中，研究人员可以利用Cas9基因敲除技术，研究特定基因在细胞生物学或生物化学过程中的功能。
在疾病治疗方面，Cas9基因敲除技术可以被用来治疗一些遗传性疾病，比如囊性纤维化等。
此外，农业领域也可以利用Cas9基因敲除技术，对作物的抗病性、产量等性状进行改良。
总之，Cas9基因敲除技术作为一种强大的基因编辑工具，为基础科学研究和应用研究提供了重要的手段。
随着技术的不断完善和深入，相信Cas9基因敲除技术在未来会有更广阔的应用前景。
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（三）诱导型基因敲除
• 诱导型基因敲除法也是利用Cre/Loxp系统
为基础，利用控制Cre表达的启动子的活性 或所表达的Cre酶活性具有可诱导的特点， 通过对诱导剂给予时间的控制从而在动物 的一定发育阶段和组织细胞中实现对特定 基因的敲除。
• 由Cre/Loxp系统和诱导系统两个部分组成。Loxp
• 片段插入
目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
靶向基因技术
• 经典方法 ：
– 自杀质粒，同源重组 – 几率低(~1 HR event per 106 cells），难！
• 饱含希望与失望的技术：
– ZFN，被Sigma公司垄断
• 新的里程碑：
– TALEN
TALEN技术
基于TALEN (transcription activator-like (TAL) effector nucleases，类转录因子效应物核酸酶)的靶向基因敲除技术是一 种崭新的分子生物学工具，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼与大 鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶识别 靶点核酸序列，并发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基 因敲条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限
制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定
阶段的一种特殊的基因敲除方法。 • 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。 • 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统
和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
• 锌指结构中每一个α螺旋可以特异识别 3-4个碱基； • 人工设计识别特异DNA序列的α螺旋采 用如上的通用序列，通过改变其中7个 X来实现识别不同的三联体碱基， TGEK是多个螺旋间的连接序列； • 构建成对人工锌指结构域和FokI融合 蛋白（ZFN）可以在指定区域切断 DNA双链。
• 单个ZFN的DNA结合结构域一般包含3-6个Cys2-His2锌 指结构域，每个锌指结构域能特异识别1个三联体碱基， 与锌指蛋白相连接的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端
该技术已经有用于治疗HIV的ZFN药物进入二期
临床实验。
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术
专利被少数几家商业公司控制。
（二）
崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除
转基因动物是用常规基因打靶技术构建成的，基因
组中待修饰区域两端各携带1个Loxp位点的转基因
动物。诱导系统是指所携带的Cre基因的表达或所
表达的Cre的酶活性具有可诱导性的转基因动物。 人们可以通过对诱导剂给予时间的预先设计来对动 物基因敲除的时空特异性进行人为控制，以避免出 现死胎或动物出生后不久即死亡的现象。
人工构建TALE模块识别指定核酸序列
…… 14 – 18个重复
102碱基模块单元 真核表达
…… 14 – 18个重复 34氨基酸单元 特异识别指定的14 -18 个核酸序列并与之结合
TALEN 发展过程
TALEN 基因敲除
TALEN (TALE+FOK I) 表达质粒对 TALEN 表达质粒对转染、表达 切割靶位点 切割诱发DNA损伤修复机制 （nonhomologous end-joining， NHEJ）。由于在此修过程中总是 有一定的错误率存在。在修复中发 生移码突变错误的个体即形成目标 基因敲除突变体
• 常见的几种诱导型基因敲除类型有：四环素诱导型；
干扰素诱导型；激素诱导型；腺病毒介导型。
III、基因编辑技术
• ZFN系统 • TALEN系统 • CRISPR/Cas 系统
（一）ZFN技术系统
ZFN 技术原理
锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内 切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。
TAL 靶点识别模块
FokI
X2
TALEN介导的同源重组
HR
基因敲入
片段删除 Left arm Right arm
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
Donor plasmid
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
Cre-LoxP重组酶系统
• LoxP（locus ofX-overP1）序列：来源于P1噬菌体，是
有两个13bp反向重复序列和中间间隔的8bp序列共同组成， 8bp的间隔序列同时也确定了LoxP的方向。Cre在催化 DNA链交换过程中与DNA共价结合，13bp的反向重复序 列是Cre酶的结合域。其序列如下 ：
（一）完全基因敲除
• 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同 源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因 等)的载体上，成为重组载体。基因敲除是为了使某一基因失 去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
基因被完全敲除之后使得表型分析受到很多限制： 有些重要的靶基因被敲除后会引起胚胎早期死亡，使得 无法分析该基因在胚胎发育晚期和成年期的功能；某些基 因在不同的细胞类型中执行不同的功能，完全敲除会导致 突变小鼠出现复杂的表型，使研究者很难判断异常的表型 是由一种细胞引起的，还是由几种细胞共同引起的。
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的 DNA序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP 系统在真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一 个由423个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需 要任何辅助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的 另一个成分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点 非常相似，同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了 目的片段的缺失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作 用的最佳温度不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp 重组酶为30℃。因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP 和FRT位点的序列如图所示
胞或发育的某一特定阶段
的一种特殊的基因敲除方 法。它实际上是在常规的
基因敲除的基础上，利用
重组酶Cre介导的位点特异 性重组技术，在对小鼠基 因修饰的时空范围上设置 一个可调控的“按钮”， 从而使对小鼠基因组的修 饰的范围和时间处于一种
可控状态。
Cre/loxP系统作用原理示意图
FLP／FRT 系统
TALEN 发展过程
• 1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。 • 2007年 发现其序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA • 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列 的对应关系被破译
由34个aa组成一个单元模块，重复17 -18次 34个aa中的第12和13个氨基酸（Repeat Variant Diresidue, RVD) 对应识别一个目标碱基
4. TALEN真核表达质粒转入（卵） 细胞，表达TALEN重组蛋白
X2
5. 检测突变效率，筛选（移码） 突变体
• 基因敲除技术分为完全基因敲除、条件型基因敲除、诱导 型基因敲除。 • 完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或动物个
体中的靶基因活性。
• 条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空 间的基因敲除。
• 诱导型基因敲除是通过对诱导剂给予时间的控制，在动物
的一定发育阶段和一定组织细胞中实现对特定基因进行敲 除的技术。
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
刘惠荣 内蒙古农业大学生命科学学院
II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细
胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从
《Heritable gene targeting in zebrafish using customized TALENs》 •
一篇综述 《Move over ZFN》
TALEN靶向（基因敲除）技术 基本流程
1. 选择、确定靶点
2. TALE识别模块串联构建
X2
3. TALEN真核表达质粒构建
X2
96个氨基酸残基组成的DNA剪切域，每个FokI单体与一
个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，但2 个识别位点相距6-8bp距离时，2个单体ZFN相互作用产生
酶切功能。在此特异位点产生1个DNA双链切口，然后利
用固有的同源重组或非同源末端连接修复机制进行切口修 复。从而达到对精确位点进行定点修饰的目的。
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre-LoxP重组酶系统在新型基因打靶中获得广泛 应用，是条件型基因打靶、诱导型基因打靶、时 空特异性基因打靶策略的技术核心。
Cre-LoxP重组酶系统
• Cre重组酶：于1981年从P1噬菌体中发现，属于λ Int酶超
基因家族。Cre重组酶基因编码区序列全长1029bp （EMBL数据库登录号X03453），编码38kDa蛋白质。 Cre 重组酶是一种由 343 个氨基酸组成的单体蛋白。它 不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能识别特异的 DNA 序列，即 loxP 位点，使 loxP位点间的基因序列被 删除或重组。Cre重组酶有70%的重组效率，不借助任何 辅助因子，可作用于多种结构的 DNA 底物，如线形、环 状甚至超螺旋 DNA。