第九章基因功能研究常用方法

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——目的基因的受体动物
转基因生物是指用实验方法导入的外源基因 在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激 素基因导人小鼠受精卵雄性原核中,获得了个体 比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来,这项 高新技术受到各国重视,发展迅速,取得不少突 破,全世界已申请的工程动物专利达到80多项。
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M13噬菌体DNA改造系统(含lacZ基因) M13mp系列 pUC系列
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 (如腺病毒,腺病毒相关病毒,逆转录病毒)
转基因动物的鉴定
• Southern杂交 确定外源基因的整合以及整 合的拷贝数
• RT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平 • Western杂交 确定外源基因蛋白质的表达
情况 • 实时PCR(荧光定量PCR)
转基因技术的应用
• (1)建立致病基因表达、调控的动物模型 • (2)动植物新品种的培育 • (3)各种基因工程产品的制备 • (4)探讨生殖细胞的基因治疗方法
第九章 基因功能研究常用方法
主讲教师:熊伟
大理学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室
弄清基因的生物学功能,才能明确基因 在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生 的分子机制。常用的基因功能研究技术包 括:
(1)DNA克隆技术 (2)转基因技术和核转移技术(动物克隆) (3)基因敲除技术 (4)反义技术 (5)RNA干涉技术
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
基因工程(genetic engineering) —— 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程, 又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)
(二)工具酶
• 限制性核酸内切酶 • DNA聚合酶Ⅰ • 逆转录酶 • T4DNA连接酶 • 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶
二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术,将动物体细胞核全部 导入另一个体的去胞核的受精卵内,使之 发育成个体,即克隆(clone)。
这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或 母亲个体,为无性繁殖.
1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子 生物学发展最重要的事件
克隆羊“多利”
第三节、基因剔除技术
囊性纤维变性是一种遗传 病,患者体内会产生粘稠的 粘液,阻塞肺部、胰腺和消 化器官的内部通道,大约有 一半的患者活不过31岁。英 国PPT公司培育了植入人体 基因的克隆羊,羊奶中含有 能够治疗囊性纤维变性的人 体蛋白。
维尔莫特所在的研究所曾 向德国一家药厂出售一头这 样的转基因羊,获得50万英 镑。
又名DNA聚合酶I大片段,具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性,而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成,双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补,标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化,或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法
原位杂交 Southern印迹
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
重组DNA技术操作的主要步骤
载体
目的基因(外源基因)
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA
限制酶消化
开环载体DNA
cDNA 人工合成 PCR产物
基因定位的基本方法
• 1.体细胞杂交法 p283 • 2.原位杂交和荧光原位杂交 • 3.连锁分析
体细胞杂交:
• 细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞 融合成一个新细胞(杂种细胞).
• 大多数细胞杂交是用人的细胞与小鼠的体细胞杂 交,它的特点是在其繁殖传代过程中保留小鼠染色 体而人染色体逐渐丢失
克隆方式 ① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库; ② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探
针,筛选cDNA文库。
(二)定位克隆
定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩
小范围,最后克隆该基因。
系统的定位克隆工作 ① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位) 交换分析、连锁不平衡分析 ② 分子生物学分析 染色体异常(缺失、易位等)分析、基因 文库的筛选与基因克隆
第一节 DNA克隆技术
(一) DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning), 即无性繁殖。
技术水平:分子克隆 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆(动物或植物)
DNA克隆
应用酶学的方法,在体外将各种来源的遗传 物质(同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA)与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子——复制子,继而通过转化 或转染宿主细胞,筛选出含有目的基因的转化子 细胞,再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 也称基因克隆或重组DNA 。
多个单一酶切位点,称为多克隆位点; • 分子量小,以容纳较大的外源DNA。
1. 质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制;带有某些
遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
2. 噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列(插入型,适用cDNA克隆) EMBL系列(置换型,适用基因组克隆)
RNA干涉(RNAi)
• RNA干涉技术是利用体外合成的短双链 RNA(21-23nt) 抑制细胞内特定基因表达的 技术,是转录后基因失活的一种研究基因功 能的有力工具
• 机制:
RNAi技术
Dicer
RNAi技术
5’ 3’
wenku.baidu.com
siRNA
3’ 5’
Initiation Step
ATP ADP + ppi
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶


限制性核酸内切酶 识别特异序列,切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键,使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
independent candidate gene approaches) (四)定位候选基因克隆策略(positional
candidate gene approaches )
(一)功能性克隆
定义 从对一种致病基因的功能的了
解出发,克隆该致病基因。 应用
生化机制已明确、基因表达产物 较易得到部分纯化的遗传性疾病。
ATP ADP + ppi
DICER KINASE RdRP
Effector Step
• siRNA binding • siRNA unwinding • RISC activation
RNAi 技术
《医学分子生物学》课程作业
根据自身专业和研究方向,以
《RNAi技术在XXX领域的研究进展》为题目, 写一篇小综述。
碱性磷酸酶 切除末端磷酸基
(三)目的基因
目的基因 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)
• cDNA • 基因组DNA
(四)基因载体
定义 为携带目的基因,实现其无性繁殖或
表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。
常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
• 完成日期:2012年12月15日前交到医学实 验楼B-312或者下周上课课堂上交。
第五节
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
克隆疾病相关基因的策略
(一)功能性克隆(functional cloning) (二)定位克隆(positional cloning) (三)非定位候选基因克隆策略(position-
反义技术
• 反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为 三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成 双链;作用于非编码区;作用于启动子
• 反义DNA在DNA或RNA水平上以至转录与翻译, 其稳定性好,有广泛药用价值
• 核酶是具有酶活性的RNA,参与RNA加工与成熟,人 工合成的核酶能抑制特定基因的表达
二、重组DNA技术基本原理
克隆基本过程
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建
外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌
重组体的筛选
克隆基因的表达
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
目录
(一)目的基因的获取
1. 化学合成法 要求:已知目的基因的核苷酸序列或其产物的 氨基酸序列 。
2.基因组DNA文库(genomic DNA library)
• 转基因动物是动物整体水平研究目的基因 的生物技术,特点是“分子及其细胞水平 的操作,组织及动物整体水平表达”
转基因动物构建过程
• 转基因载体的构建 • 将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干
细胞 • 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小
鼠子宫中 • 对转基因动物进行鉴定
转基因的技术方法
• DNA显微注射法 • 克隆法 • 胚胎干细胞技术 • 逆转录病毒介导的基因转移 • 精子载体法等 各有优点和缺点,常用的是显微注射和克隆法
(三)外源基因与载体的连接
1. 粘性末端连接
方式:(1)同一限制酶切位点连接 (2)不同限制酶切位点连接 配伍末端连接 非配伍末端连接
(四)重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌(从大肠杆菌K-12改造) 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态
导入方式 转化 转染 感染
(五)重组体的筛选
1. 直接选择法
3. cDNA文库(cDNA library)
4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章)
(二)克隆载体的选择和构建
若将外源基因连接到复制子(基因载体) 上,外源DNA就可以作为复制子的一部分 在受体细胞内复制.
在基因克隆中基因载体的选择与构建是 一项技术性很强的工作,直接影响到基 因克隆的成败.
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活, 有目的去除动物体内某种基因的技术。
基因剔除程序
• 将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使 这一灭活的基因通过同源重组取代原有目 的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过 显微注射到小鼠囊胚.
• 细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成 嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES 细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除 小鼠.
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准
• 能自主复制; • 具有两个以上的遗传标记物,便于重组体
的筛选和鉴定; • 有克隆位点(外源DNA插入点),常具有
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装,转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
目录
第二节 转基因技术与核转移技术
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞,然后将细胞导入动物子 宫,使之发育成个体。
转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
基因转移和基因剔除技术在 医学中的应用
建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制
① 单基因决定疾病模型 进行基因剔除以模拟基因失活.
单基因疾病模型:地中海贫血,动脉硬化,老年痴呆等
② 多基因决定疾病模型 多基因疾病模型:肿瘤,高血压,糖尿病
第四节 基因沉默技术
基因沉默技术
• 反义(antisen)技术 • RNA干涉(RNA Interference,RNAi)
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