第九章基因功能研究常用方法
研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
第九章-真核生物基因的表达及其调控
第九章-真核⽣物基因的表达及其调控第九章真核⽣物基因的表达及其调控教学要点：名词：持家基因和奢侈基因静⽌⼦顺式作⽤元件反式作⽤因⼦双内含⼦ UA序列理解真核基因表达调控的复杂性掌握真核基因在染⾊体⽔平上的活化调节学习增强⼦在结构和功能上的特点掌握真核⽣物RNA聚合酶Ⅱ的结构特点及其相关启动⼦的各组分的功能。
掌握RNA编辑的机制授课时数：4学时真核⽣物基因表达调控：基因表达⽔平染⾊质⽔平转录⽔平（主要调控）转录后加⼯⽔平翻译⽔平翻译后⽔平第⼀节真核⽣物中基因表达⽔平的分析⼀、真核⽣物：受精卵→不同⽣物功能的分化细胞⼆、分化细胞：维持其正常结构和新陈代谢等⽣命活动；⾏使其特定的功能。
尽管各种⽣物的细胞中都有该种⽣物的⼀整套基因，然⽽不同种类的细胞中处于⼯作状态的基因种类却不尽相同。
三、cDNA-mRNA 杂交：所以某种mRNA 在群体中频率越⾼，相应的cDNA 的频率越⾼，cDNA 与过量mRNA 越容易形成杂合双链。
当少量单链DNA 与⼤量RNA 杂交时，所有能与RNA 互补的DNA 都会形成RNA-DNA 杂合分⼦。
第⼆节染⾊质⽔平上的基因活化调节⼀、染⾊质的疏松及活性染⾊质特征1.染⾊质纤维解旋—局部膨⼤—染⾊体泡2.染⾊质的模板容量——⼀定量的染⾊质所能合成的RNA的量3.常染⾊质与异染⾊质⼆、转录基因与核⼩体结构核⼩体相位：指同⼀类型的所有细胞中，组蛋⽩⼋聚体在DNA序列上的特殊定位。
改变调控元件的位置：启动⼦、增强⼦…三蛋⽩质的修饰与基因活化调节（⼀）组蛋⽩的调控1、组蛋⽩含量增加→DNA模板容量降低H2A、H2B、H3、H4：影响模板容量，阻⽌DNA链上RNA链的延长2、组蛋⽩修饰：核⼩体组蛋⽩上的某些氨基酸被共价修饰的现象●主要：⼄酰基化、甲基化、磷脂化、泛素化共性：组蛋⽩正电荷减少、碱性降低、松弛与DNA的结合、活化染⾊质、便于转录、调控（⼆）⾮组蛋⽩在基因表达中的作⽤—调节基因表达细胞分化：特异DNA序列上组蛋⽩与⾮组蛋⽩相互作⽤形成不同抑制区的结果。
分子生物学第九章--分子生物学研究方法电子教案精选全文
可编辑修改精选全文完整版•第九章分子生物学研究方法1．课程教学内容(1)核酸技术1—基本操作(2)核酸技术2—克隆技术(3)核酸技术3—测序(4)基因表达和表达分析基因定点诱变(5)蛋白质与核酸的相互作用(6)其他（热点）技术2．课程重点、难点基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测技术3．课程教学要求掌握基因克隆技术、杂交技术、测序技术、蛋白质与核酸的相互作用检测等各种技术的原理。
本章内容•核酸的凝胶电泳•DNA分子的酶切割•核酸的分子杂交•基因扩增•基因的克隆和表达•细菌的转化•DNA核苷酸序列分析•蛋白质的分离与纯化•研究DNA与蛋白质相互作用的方法一、核酸的凝胶电泳基本原理：当一种分子被放置在电场当中时，它们会以一定的速度移向适当的电极。
电泳的迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度，它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷成正比。
由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖和丙烯酰胺，从而降低了对流运动，故电泳的迁移率又同分子的摩擦系数成反比。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团，是呈离子化状态的。
从这个意义上讲，DNA和RNA的多核苷酸链可叫做多聚阴离子，因此，当核酸分子放置在电场中时，它就会向正极移动。
在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移率，取决于核酸分子本身大小和构型。
分子量较小的DNA 分子，比分子量较大的分子，具有较紧密的构型，所以其电泳迁移率也就比同等分子量的松散型的开环DNA分子或线性DNA分子要快些。
Gel matrix (胶支持物) is an inserted, jello-like porous material that supports and allows macromolecules to move through.Agarose (琼脂糖):(1) a much less resolving power than polyacrylamide,(2)but can separate DNA molecules of up to tens of kbDNA can be visualized by staining the gel with fluorescent dyes, such as ethidium bromide (EB 溴化乙锭)Polyacrylamide (聚丙稀酰胺):(1)has high resolving capability, and can resolve DNA that differfrom each other as little as a single base pair/nucleotide.(2)but can only separate DNA over a narrow size range (1 to a fewhundred bp).Pulsed-field gel electrophoresis (脉冲电泳)(1)The electric field is applied in pulses that are orientedorthogonally (直角地) to each other.(2)Separate DNA molecules according to their molecule weight, as wellas to their shape and topological properties.(3)Can effectively separate DNA molecules over 30-50 kb and up toseveral Mb in length.二、DNA分子的酶切割Restriction endonucleases (限制性内切酶) cleave DNA molecules at particular sitesRestriction endonucleases (RE) are the nucleases that cleave DNA at particular sites by the recognition of specific sequences.RE used in molecular biology typically recognize (识别) short (4-8bp) target sequences that are usually palindromic (回文结构), and cut (切割) at a defined sequence within those sequences. e.g. EcoRIThe random occurrence of the hexameric (六核苷酸的) sequence: 1/4096 (4-6=1/46)(1) Restriction enzymes differ in the recognition specificity: target sites are different.(2) Restriction enzymes differ in the length they recognized, and thus the frequencies differ.(3) Restriction enzymes differ in the nature of the DNA ends they generate: blunt/flush ends (平末端), sticky/staggered ends (粘性末端).(4) Restriction enzymes differ in the cleavage activity.三、核酸的分子杂交原理：带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA，当它们混合在一起时，其相应的同源区段将会退火形成双链的结构。
基因功能研究的方法_李新枝
·综述·基因功能研究的方法李新枝,蔡佩玲,牟林春(成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室,四川成都 610083)【中图分类号】 Q78 【文献标识码】 A 1985年在加利福尼亚大学Santa Cruz分校举行的一次会议上,有人第一次提出了共同努力测出人类基因组序列的可能性,虽然这个主意引起了许多人的兴趣,但几乎没有强的支持者[1]。
1986年,诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco于《Science》上率先提出人类基因组计划(human geno me project,H GP),旨在阐明人类基因组的3×109个碱基对的序列,发现人类所有基因并阐明其在染色体上的位置,破译人类的全部遗传信息,使人类第一次在分子水平上全面认识自我[2]。
自1990年正式启动以来,随着人类基因组计划和其它模式生物基因组研究的顺利进行,生命科学研究已进入后基因组时代。
基因组学的研究也从结构基因组学转向功能基因组学的研究。
基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑战在于如何确定基因的功能和弄清全部的遗传信息。
因而基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题,它将是21世纪生命科学研究的重要领域。
经典的扣除杂交(subtractive hybridization)、差示筛选(diferential screening)、cDNA替代差异分析(repre-sentative dife rential analy sis,RDA)以及m RNA差异显示(diferential display)等技术已广泛应用于差异表达基因的鉴定和克隆,但这些技术和策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究来说是远远不够的[3]。
于是,随着后基因组时代的到来,一些能够对大量基因进行全面、系统分析的新技术应运而生。
本文主要介绍近年来用于基因功能研究的较新方法。
1 微阵列分析[1]微阵列(micro array)是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术。
新基因功能研究的策略和方法
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利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
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序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
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此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
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主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
第九章基因功能研究常用方法
第九章基因功能研究常用方法基因功能研究是生物学研究中的重要部分，通过研究基因的功能和表达方式，可以揭示基因在生物体发育、生长和疾病发生等方面的关键作用。
为了实现对基因功能的深入了解，科学家们发展了各种基因功能研究的方法。
以下将介绍一些常用的基因功能研究方法。
1. 基因敲除（Knockout）：这是一种研究基因功能的重要方法。
通过CRISPR/Cas9等技术将目标基因的部分或全部序列剔除，使其无法表达，观察敲除后的生物体表现出的表型变化。
这种方法可用于验证基因的功能，发现其在生物体中的作用。
2. 基因突变（Mutation）：通过诱发基因突变或筛选已有基因突变体，研究基因的功能和表达方式。
其中，随机突变（例如化学物质诱变）和目标突变方法（例如诱导突变）是常用的策略。
研究基因突变体可以揭示基因对于生物体正常发育和功能的影响。
3. 基因过表达（Gene Overexpression）：通过将目标基因插入表达载体并导入生物体，使基因在生物体中过度表达。
观察过度表达基因后生物体的表型变化，可以了解基因过度表达对生物体的影响。
此外，过度表达基因还可用于验证一些基因在特定条件下的功能和路径。
4. 基因沉默（Gene Silencing）：通过RNA干扰（RNAi）或转座子的反义RNA，使目标基因的转录或翻译过程受到阻碍。
基因沉默可用来研究基因造成的表型变化以及调控基因的功能。
5. 基因共表达（Gene Co-expression）：通过分析大规模基因表达数据，探索基因间的共表达关系。
通过比较共表达基因的功能和通路，可以发现基因的相互关联及其在生物体中的功能。
6. 基因互作（Gene Interaction）：通过分析基因间的物理相互作用和遗传相互作用关系，了解基因在调控和相互影响方面的作用。
这种方法对于揭示基因网络调控和疾病发生机制很有帮助。
7. 基因转移（Gene Transfer）：将外源基因导入目标细胞或生物体，以研究基因功能和转录调控。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
基因功能研究方法
反义技术的两种技术路线:
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内， 使细胞表达与目标基因互补的mRNA失活，从而阻断目 标基因的表达；
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等 途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作用。
反义寡聚核苷酸 与mRNA特异性结 合，阻断翻译过 程。
的部位，如球形或纤维状结构，他们介于二级结构和三级结构之间。
激活结构域:指转录因子中与转录起始复合体接触与互作的结构部
位。
优势：
它可应基因序列，它检测的相互作用在体 内发生，无需额外的纯化步骤。
删除、置换、修饰等手段重建DNA序列,使之成为靶载体； (2)将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA与胚胎干
细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的DNA 序列 整合到内源基因组中；
(3)将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚，将这些囊胚 导入假孕母鼠子宫中，产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠， 进而分析被剔除基因的功能。
优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
YAC要具备的主要功能成份
1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件
4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段，但对
于许多基因来说，简单的失活常导致令人费解的无改变 的表型。最常见的解释是某些其它基因取代了靶基因的 功能，但要在普通基因敲除小鼠中证明这一点十分困难。 基因敲入即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因以 确定它们是否具有相同功能。
第九章 基因治疗(一)PPT课件
(5) 基因干扰 ：也称基因失活，有两种干扰方法：
① 抑制有害基因：导入抑癌基因（TSG)来抑制癌基因的异 常表达，但不能恢复癌基因的正常功能；
② 封闭有害基因：用反义RNA或小分子抑制RNA(siRNA)
来封闭癌基因基因，同样不能恢复癌基因的正常功能，但
可用来抑制病原体的关键基因。
(6) 免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内， 改变患者免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。
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缺点是： （1）仅整合到处于分裂状态的细胞； （2）一些反转录病毒中存在原癌基因，其会
引起癌变的发生； （3）反转录病毒的LTR可致使细胞癌变； （4）常常只有短暂表达； （5）病毒滴度低（107pfu/ml）；插入容量有
限，不能插入较大的基因。
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2．构建重组反转录病毒载体
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1972年T.Friedmann 和R. Roblin在Science 上发表了题为“基因治疗人类的遗传病 （Gene therapy for human geneticdisease）” 的文章。
但鉴于体外重组技术刚刚问世，人们对 “基因治疗”尚感到远不可及，因而未得 到学术界的认可。
③外源野生型目的基因具有适宜的受体细胞并能在 体外有效表达；
④具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用 的动物模型。
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三、基因治疗的靶细胞选择
目前基因治疗中尚不能使用生殖细胞作为靶细胞， 而只能使用体细胞。选择靶细胞须考虑：
①最好为组织特异性细胞；
②细胞易获得，具有增殖优势，生命周期长，能存 活几个月至几年；
基因功能研究常用方法
第一节 DNA克隆技术
（一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部 导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之 发育成个体，即克隆(clone)。 这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或 母亲个体,为无性繁殖. 1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子 生物学发展最重要的事件
克隆羊“多利”
第三节、基因剔除技术
RNA干涉(RNAi)
• RNA干涉技术是利用体外合成的短双链 RNA(21-23nt) 抑制细胞内特定基因表达的 技术,是转录后基因失活的一种研究基因功 能的有力工具 • 机制:
RNAi技术
Dicer
RNAi技术
siRNA
5’
3’
3’
5’
Initiation Step
ATP ADP + ppi
囊性纤维变性是一种遗传 病，患者体内会产生粘稠的 粘液，阻塞肺部、胰腺和消 化器官的内部通道，大约有 一半的患者活不过31岁。英 国PPT公司培育了植入人体 基因的克隆羊，羊奶中含有 能够治疗囊性纤维变性的人 体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾 向德国一家药厂出售一头这 样的转基因羊，获得50万英 镑。
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
几种常用的基因功能分析方法和工具
几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。
Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。
在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。
这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。
研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。
在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。
EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。
由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。
研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。
其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。
EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。
由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。
这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。
同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。
2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。
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克隆方一种致病基因的染色体定位出发逐步缩
小范围，最后克隆该基因。
系统的定位克隆工作 ① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位) 交换分析、连锁不平衡分析 ② 分子生物学分析常用的工具酶
工具酶
功
能
限制性核酸内切酶 识别特异序列，切割DNA
DNA连接酶
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接
DNA聚合酶Ⅰ
Klenow片段 反转录酶
多聚核苷酸激酶
①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端
第一节 DNA克隆技术
（一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。
获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
技术水平：分子克隆 即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
DNA克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我 复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化 或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子 细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。 也称基因克隆或重组DNA 。
independent candidate gene approaches) （四）定位候选基因克隆策略(positional
candidate gene approaches )
（一）功能性克隆
定义 从对一种致病基因的功能的了
解出发，克隆该致病基因。 应用
生化机制已明确、基因表达产物 较易得到部分纯化的遗传性疾病。
基因转移和基因剔除技术在 医学中的应用
建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制
① 单基因决定疾病模型 进行基因剔除以模拟基因失活.
单基因疾病模型:地中海贫血,动脉硬化,老年痴呆等
② 多基因决定疾病模型 多基因疾病模型:肿瘤,高血压,糖尿病
第四节 基因沉默技术
基因沉默技术
• 反义(antisen)技术 • RNA干涉(RNA Interference,RNAi)
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
基因剔除程序
• 将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使 这一灭活的基因通过同源重组取代原有目 的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过 显微注射到小鼠囊胚.
• 细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成 嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES 细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除 小鼠.
基因定位的基本方法
• 1.体细胞杂交法 p283 • 2.原位杂交和荧光原位杂交 • 3.连锁分析
体细胞杂交:
• 细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞 融合成一个新细胞(杂种细胞).
• 大多数细胞杂交是用人的细胞与小鼠的体细胞杂 交,它的特点是在其繁殖传代过程中保留小鼠染色 体而人染色体逐渐丢失
囊性纤维变性是一种遗传 病，患者体内会产生粘稠的 粘液，阻塞肺部、胰腺和消 化器官的内部通道，大约有 一半的患者活不过31岁。英 国PPT公司培育了植入人体 基因的克隆羊，羊奶中含有 能够治疗囊性纤维变性的人 体蛋白。
维尔莫特所在的研究所曾 向德国一家药厂出售一头这 样的转基因羊，获得50万英 镑。
二、重组DNA技术基本原理
克隆基本过程
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建
外源基因与载体的连接 DNA导入受体菌
重组体的筛选
克隆基因的表达
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
目录
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章）
（二）克隆载体的选择和构建
若将外源基因连接到复制子(基因载体) 上,外源DNA就可以作为复制子的一部分 在受体细胞内复制.
在基因克隆中基因载体的选择与构建是 一项技术性很强的工作,直接影响到基 因克隆的成败.
RNA干涉(RNAi)
• RNA干涉技术是利用体外合成的短双链 RNA(21-23nt) 抑制细胞内特定基因表达的 技术,是转录后基因失活的一种研究基因功 能的有力工具
• 机制:
RNAi技术
Dicer
RNAi技术
5’ 3’
siRNA
3’ 5’
Initiation Step
ATP ADP + ppi
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。
表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成
多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准
• 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有
又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等
①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析
催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
末端转移酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
写作要求：
1. 按照一般发表文献的格式书写。 2. 可查阅CNKI（中国知网）或Pubmed上相
关文献，不得抄袭！
3. 字数：3000字左右。 4. 不得抄袭！
论文格式
• 题目
• 摘要（Abstract) 200字以内
• 正文
前言
正文
问题与展望
参考文献
10-15篇
• 完成方式：手写稿或电子打印稿
二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部 导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之 发育成个体，即克隆(clone)。
这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或 母亲个体,为无性繁殖.
1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子 生物学发展最重要的事件
克隆羊“多利”
第三节、基因剔除技术
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
ATP ADP + ppi
DICER KINASE RdRP
Effector Step
• siRNA binding • siRNA unwinding • RISC activation
RNAi 技术
《医学分子生物学》课程作业
根据自身专业和研究方向，以
《RNAi技术在XXX领域的研究进展》为题目， 写一篇小综述。
• 完成日期：2012年12月15日前交到医学实 验楼B-312或者下周上课课堂上交。
第五节
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
克隆疾病相关基因的策略
（一）功能性克隆(functional cloning) （二）定位克隆(positional cloning) （三）非定位候选基因克隆策略(position-
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
目录
第二节 转基因技术与核转移技术
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。
转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
——目的基因的受体动物
转基因生物是指用实验方法导入的外源基因 在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激 素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体 比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项 高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突 破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。
反义技术
• 反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为 三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成 双链;作用于非编码区;作用于启动子
• 反义DNA在DNA或RNA水平上以至转录与翻译, 其稳定性好,有广泛药用价值
• 核酶是具有酶活性的RNA,参与RNA加工与成熟,人 工合成的核酶能抑制特定基因的表达
转基因动物的鉴定
• Southern杂交 确定外源基因的整合以及整 合的拷贝数
• RT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平 • Western杂交 确定外源基因蛋白质的表达
情况 • 实时PCR（荧光定量PCR）
转基因技术的应用
• （1）建立致病基因表达、调控的动物模型 • （2）动植物新品种的培育 • （3）各种基因工程产品的制备 • （4）探讨生殖细胞的基因治疗方法
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
基因工程(genetic engineering) —— 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程， 又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）工具酶
• 限制性核酸内切酶 • DNA聚合酶Ⅰ • 逆转录酶 • T4DNA连接酶 • 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶