基因定位常用的方法PPT
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
染色体定位：只把基因定位到某条染色体上。 细胞水平上的基因图又称细胞遗传图
区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等 技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体 的具体区带。
3
一、基因定位的方法
1、体细胞杂交法基因定位： 体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细
胞。 1）体细胞杂交的概念：
也称细胞融合（cell infusion），是 将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。 新产生的细胞称杂种细胞（hybrid cell）， 含双亲不同的染色体。
DNA（Nick translation 标记法），变性成单 链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交。 在荧光显微镜下观察并记录结果。
FISH
优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区 域定位。
缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。
16
单色FISH
17
多色FISH
18
3.连锁分析（Linkage analysis）
7
因此在HAT培养基上
人细胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受
阻。 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄
嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍）
8
鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通 道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成 腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合 成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟 嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌 呤和嘧啶都可以正常合成）
1）概念： 基因定位的连锁分析是根据基因在染
色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成 连锁群的原理，即应用被定位的基因与同 一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的 特点进行定位。
19
2）重组值（recombination fraction） 是基因定位时两个基因间遗传图距的量
6
HAT选择系统：
人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT培养基中
HAT培养基： H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提 供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑 制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核 苷酸，为DNA合成提供原料
2）原理：碱基的互补配对，同源的DNA-DNA双链 或DNA-RNA双链在一定条件下能结合成双链。用放 射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互 补的cDNA作探针，可检测细胞基因组中的同源部 分。
13
3）原位杂交的特点：
杂交在载玻片上的中期染色体上进行， 而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指 在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放 射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探 针杂交，通过放射自显影来检测染色体上 特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条 染色体的区带出现的最高频率或荧光的强 度来确定探针的位置，从而准确地进行基 因定位。
基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的 认识有重要意义。
1
明确几个基本概念
基 因：DNA的功能片段。 基因组：有机体全部DNA序列（它包括基因
外的非基因DNA序列），它是基因和 非基因DNA序列的总和。 基因定位：是用一定的方法将基因确定到染 色体的实际位置。
2
遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两 个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离， 它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组 率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。
10
TK-
TK+
HPRT+ 鼠
X
人
HPRT-
鼠
鼠
人
人
HAT 鼠人 TK+ HPRT+
17 3
TK+ 17 3
பைடு நூலகம்
17
TK+
3
TK-
11
②克隆嵌板法(clone panel method)
根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有 时是重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因 定位方法。
克隆嵌板
杂种克隆
保留的人染色体
1 2 345678
A
+ + + +- - - -
B
+ + - -++- -
C
+ - + - + - +-
12
2.原位杂交和荧光原位杂交
1）原位杂交（in situ hybridization）：是最 直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在 基因定位中的应用，胰岛素基因用此方法定位于 11p15。
14
4）原位杂交的步骤
制备中期染色体
DNA原位变性
变性
放射性或非放射性标记探针
杂交（在载玻片上）
洗膜 检测
放射性标记：放射自显影 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合
记录杂交信号
结合染色体形态进行基因定位
15
5）荧光原位杂交
（florescence in situ hybridization，FISH） 用 特 殊 荧 光 素 （ dig 或 Biotin ） 标 记 探 针
9
将筛选出来的杂种细胞转移到正常培 养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同 的生化和免疫学特性，Miller等运用体细 胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种 细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含 有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性 而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定 位于17号染色体上，这是首例应用体细胞 杂交法进行的基因定位。
第四节 基因定位常用的方法
Wilson于1911年将红绿色盲基因首次定位于X 染色体上,开创了人类基因定位的先河.1968 年,Donahue利用系谱分析的方法将Duffy血型基因 定位于1 号染色体上,是人类首次在常染色体上进 行的基因定位.20世纪70年代后,体细胞杂交重组 DNA、分子杂交和PCR等技术的出现和应用，基因 定位的方法愈加先进，基因定位的速度、数量明 显加快。人类基因组计划的实施和完成，更加促 进了基因定位的进程。
4
2）对象： 人的细胞 鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠
3）杂种细胞的特点： 在繁殖传代过程中，人的染色体优先
丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色 体，而啮齿类的染色体被保留下来。
5
4）原理：
细胞进行融合时，培养液中只有部分细 胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双 亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。 为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而 亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细 胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的 差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择 系统。
区域定位：从细胞遗传学水平，用染色体显带等 技术在光学显微镜下观察，将基因定位到染色体 的具体区带。
3
一、基因定位的方法
1、体细胞杂交法基因定位： 体细胞：即生物体除生殖细胞外的任一细
胞。 1）体细胞杂交的概念：
也称细胞融合（cell infusion），是 将来源不同的两种细胞融合成一个新细胞。 新产生的细胞称杂种细胞（hybrid cell）， 含双亲不同的染色体。
DNA（Nick translation 标记法），变性成单 链后与变性后的染色体或细胞核靶DNA杂交。 在荧光显微镜下观察并记录结果。
FISH
优点：可用来作基因或特定DNA片段的染色体区 域定位。
缺点：必须在已知探针的情况下方可进行。
16
单色FISH
17
多色FISH
18
3.连锁分析（Linkage analysis）
7
因此在HAT培养基上
人细胞： ①由于A的存在，正常的DNA 合成通路受
阻。 ②同时由于HGPRT的缺乏，无法利用次黄
嘌呤通过旁路合成DNA（ 嘌呤合成障碍）
8
鼠细胞：由于A的存在正常的DNA合成通 道受阻，有HGPRT可以利用次黄嘌呤合成 腺嘌呤，鸟嘌呤，但由于无TK，无法合 成胸腺嘧啶。（嘧啶合成障碍 ） 杂种细胞：有HGPRT旁路合成腺嘌呤,鸟 嘌呤；并可以利用TK合成胸腺嘧啶（嘌 呤和嘧啶都可以正常合成）
1）概念： 基因定位的连锁分析是根据基因在染
色体上呈直线排列，不同基因相互连锁成 连锁群的原理，即应用被定位的基因与同 一染色体上另一基因或遗传标记相连锁的 特点进行定位。
19
2）重组值（recombination fraction） 是基因定位时两个基因间遗传图距的量
6
HAT选择系统：
人的突变细胞株：缺乏HGPRT酶 小鼠细胞株：缺乏TK酶 两者融合培养于HAT培养基中
HAT培养基： H为次黄嘌呤，是HGPRT的底物，为DNA合成提 供原料（核苷酸旁路合成原料） A可阻断正常的DNA合成（嘌呤及TMP合成受抑 制） T在胸苷激酶（TK）的作用下生成胸腺嘧啶核 苷酸，为DNA合成提供原料
2）原理：碱基的互补配对，同源的DNA-DNA双链 或DNA-RNA双链在一定条件下能结合成双链。用放 射性或非放射性物质标记的DNA、RNA或与mRNA互 补的cDNA作探针，可检测细胞基因组中的同源部 分。
13
3）原位杂交的特点：
杂交在载玻片上的中期染色体上进行， 而不是在溶液和膜上进行。所谓原位是指 在标本上DNA原位变性，再与放射性或非放 射性物质（通常用3H）标记的已知核酸探 针杂交，通过放射自显影来检测染色体上 特异DNA或RNA顺序，用放射性颗粒在某条 染色体的区带出现的最高频率或荧光的强 度来确定探针的位置，从而准确地进行基 因定位。
基因定位对提高人类对疾病产生的病因学的 认识有重要意义。
1
明确几个基本概念
基 因：DNA的功能片段。 基因组：有机体全部DNA序列（它包括基因
外的非基因DNA序列），它是基因和 非基因DNA序列的总和。 基因定位：是用一定的方法将基因确定到染 色体的实际位置。
2
遗传做图：是以研究家族的减数分裂，以了解两 个基因分离趋势为基础来绘制基因座位间的距离， 它表明基因之间连锁关系和相对距离，并以重组 率来计算和表示，以厘摩（cM）为单位。
10
TK-
TK+
HPRT+ 鼠
X
人
HPRT-
鼠
鼠
人
人
HAT 鼠人 TK+ HPRT+
17 3
TK+ 17 3
பைடு நூலகம்
17
TK+
3
TK-
11
②克隆嵌板法(clone panel method)
根据不同杂种细胞保留或丢失的人染色体有 时是重叠的情况,设计的一种简便而实用的基因 定位方法。
克隆嵌板
杂种克隆
保留的人染色体
1 2 345678
A
+ + + +- - - -
B
+ + - -++- -
C
+ - + - + - +-
12
2.原位杂交和荧光原位杂交
1）原位杂交（in situ hybridization）：是最 直接的基因定位方法之一，是分子生物学技术在 基因定位中的应用，胰岛素基因用此方法定位于 11p15。
14
4）原位杂交的步骤
制备中期染色体
DNA原位变性
变性
放射性或非放射性标记探针
杂交（在载玻片上）
洗膜 检测
放射性标记：放射自显影 非放射性标记：荧光染料与抗体或蛋白结合
记录杂交信号
结合染色体形态进行基因定位
15
5）荧光原位杂交
（florescence in situ hybridization，FISH） 用 特 殊 荧 光 素 （ dig 或 Biotin ） 标 记 探 针
9
将筛选出来的杂种细胞转移到正常培 养基继续培养，由于人和鼠都有各自不同 的生化和免疫学特性，Miller等运用体细 胞杂交并结合杂种细胞的特征，证明杂种 细胞的存活需要胸苷激酶（TK）。凡是含 有人17号染色体的杂种细胞都因有TK活性 而存活，反之则死亡，从而推断TK基因定 位于17号染色体上，这是首例应用体细胞 杂交法进行的基因定位。
第四节 基因定位常用的方法
Wilson于1911年将红绿色盲基因首次定位于X 染色体上,开创了人类基因定位的先河.1968 年,Donahue利用系谱分析的方法将Duffy血型基因 定位于1 号染色体上,是人类首次在常染色体上进 行的基因定位.20世纪70年代后,体细胞杂交重组 DNA、分子杂交和PCR等技术的出现和应用，基因 定位的方法愈加先进，基因定位的速度、数量明 显加快。人类基因组计划的实施和完成，更加促 进了基因定位的进程。
4
2）对象： 人的细胞 鼠类：大鼠、小鼠、仓鼠
3）杂种细胞的特点： 在繁殖传代过程中，人的染色体优先
丢失，以至最后只剩几条或一条人的染色 体，而啮齿类的染色体被保留下来。
5
4）原理：
细胞进行融合时，培养液中只有部分细 胞融合成杂种细胞，还有大量未融合的双 亲细胞。这就需要选择分离纯化杂种细胞。 为此要创造一种只让杂种细胞生长繁殖而 亲本细胞死亡的环境。这就要利用杂种细 胞和亲本细胞对生长条件的要求和代谢的 差异来进行选择。其中最常用的是HAT选择 系统。