第九章 基因功能研究常用方法

交换分析、连锁不平衡分析
② 分子生物学分析 染色体异常(缺失、易位等)分析、基因 文库的筛选与基因克隆
基因定位的基本方法
• 1.体细胞杂交法 p283 • 2.原位杂交和荧光原位杂交 • 3.连锁分析
体细胞杂交:
• 细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞 融合成一个新细胞(杂种细胞). • 大多数细胞杂交是用人的细胞与小鼠的体细胞杂 交,它的特点是在其繁殖传代过程中保留小鼠染色 体而人染色体逐渐丢失 • 仅保留少数甚至一条人染色体的细胞正是进行基 因连锁分析和基因定位的有用材料只需要集中精 力于某一染色体上,就可找到某一基因座位
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成
PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化 连接酶
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
带重组体的宿主
筛选
表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
目录
第二节 转基因技术与核转移技术
转基因动物的鉴定
• Southern杂交 确定外源基因的整合以及整 合的拷贝数 • RT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平 • Western杂交 确定外源基因蛋白质的表达 情况 • 实时PCR（荧光定量PCR）
转基因技术的应用
• • • • （1）建立致病基因表达、调控的动物模型 （2）动植物新品种的培育 （3）各种基因工程产品的制备 （4）探讨生殖细胞的基因治疗方法
外源基因与载体的连接
重组体的筛选
克隆基因的表达
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
目录
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的 氨基酸序列 。 2.基因组DNA文库(genomic DNA library) 3. cDNA文库(cDNA library) 4. 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) （见第22章）
论文格式
• 题目 • 摘要（Abstract) 200字以内 • 正文 前言 正文 问题与展望 参考文献 10-15篇
• 完成方式：手写稿或电子打印稿 • 完成日期：2012年12月15日前交到医学实 验楼B-312或者下周上课课堂上交。
第
五
节
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
1. 质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些 遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
2. 噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（臵换型，适用基因组克隆）
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
（二）克隆载体的选择和构建 若将外源基因连接到复制子(基因载体) 上,外源DNA就可以作为复制子的一部分 在受体细胞内复制. 在基因克隆中基因载体的选择与构建是 一项技术性很强的工作,直接影响到基 因克隆的成败.
（三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接
(2)不同限制酶切位点连接
二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部 导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之 发育成个体，即克隆(clone)。 这样的个体所携带的性状仅来自一个父亲或 母亲个体,为无性繁殖. 1996年,克隆羊”多莉”的产生成为当年分子 生物学发展最重要的事件
克隆羊“多利”
第三节、基因剔除技术
配伍末端连接
非配伍末端连接
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌（从大肠杆菌K-12改造） 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 导入方式 转化
转染
感染
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
基因转移和基因剔除技术在 医学中的应用
建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制
① 单基因决定疾病模型
进行基因剔除以模拟基因失活.
单基因疾病模型:地中海贫血,动脉硬化,老年痴呆等
② 多基因决定疾病模型
多基因疾病模型:肿瘤,高血压,糖尿病
第四节
基因沉默技术
基因沉默技术
• 反义(antisen)技术 • RNA干涉(RNA Interference,RNAi)
Klenow片段
反转录酶 多聚核苷酸激酶
末端转移酶
碱性磷酸酶
在3´羟基末端进行同质多聚物加尾
切除末端磷酸基
（三）目的基因
目的基因 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
• cDNA
• 基因组DNA
（四）基因载体
定义
为携带目的基因，实现其无性繁殖或 表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分 子。 常用载体 质粒DNA 噬菌体DNA 病毒DNA
克隆疾病相关基因的策略
（一）功能性克隆(functional cloning)
（二）定位克隆(positional cloning) （三）非定位候选基因克隆策略(positionindependent candidate gene approaches) （四）定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches )
第九章 基因功能研究常用方法
主讲教师：熊伟
大理学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室
弄清基因的生物学功能,才能明确基因 在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生 的分子机制。常用的基因功能研究技术包 括： （1）DNA克隆技术 （2）转基因技术和核转移技术（动物克隆） （3）基因敲除技术 （4）反义技术 （5）RNA干涉技术
的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我
复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化
或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子
细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。
也称基因克隆或重组DNA 。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) —— 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
囊性纤维变性是一种遗传 病，患者体内会产生粘稠的 粘液，阻塞肺部、胰腺和消 化器官的内部通道，大约有 一半的患者活不过31岁。英 国PPT公司培育了植入人体 基因的克隆羊，羊奶中含有 能够治疗囊性纤维变性的人 体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾 向德国一家药厂出售一头这 样的转基因羊，获得50万英 镑。
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子
宫，使之发育成个体。
转基因——被导入的目的基因
转基因动物(transgenic animal)
——目的基因的受体动物
转基因生物是指用实验方法导入的外源基因 在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激 素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体 比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项 高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突 破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。
DICER
ATP ADP + ppi
KINASE
RdRP
Effector Step
• siRNA binding • siRNA unwinding • RISC activation
RNAi 技术
《医学分子生物学》课程作业 根据自身专业和研究方向，以 《RNAi技术在XXX领域的研究进展》为题目， 写一篇小综述。 写作要求： 1. 按照一般发表文献的格式书写。 2. 可查阅CNKI（中国知网）或Pubmed上相 关文献，不得抄袭！ 3. 字数：3000字左右。 4. 不得抄袭！
RNA干涉(RNAi)
• RNA干涉技术是利用体外合成的短双链 RNA(21-23nt) 抑制细胞内特定基因表达的 技术,是转录后基因失活的一种研究基因功 能的有力工具 • 机制:
RNAi技术
Diwk.baidu.comer
RNAi技术
siRNA
5’
3’
3’
5’
Initiation Step
ATP ADP + ppi
• 转基因动物是动物整体水平研究目的基因 的生物技术，特点是“分子及其细胞水平 的操作，组织及动物整体水平表达”
转基因动物构建过程
• 转基因载体的构建 • 将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干 细胞 • 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小 鼠子宫中 • 对转基因动物进行鉴定
转基因的技术方法
• DNA显微注射法 • 克隆法 • 胚胎干细胞技术 • 逆转录病毒介导的基因转移 • 精子载体法等 各有优点和缺点，常用的是显微注射和克隆法
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
第一节 DNA克隆技术
（一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
技术水平：分子克隆
细胞克隆
即DNA 克隆
个体克隆（动物或植物）
DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传
物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然
又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）工具酶
• 限制性核酸内切酶
• DNA聚合酶Ⅰ
• 逆转录酶
• T4DNA连接酶
• 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
（一）功能性克隆
定义 从对一种致病基因的功能的了 解出发，克隆该致病基因。
应用 生化机制已明确、基因表达产物 较易得到部分纯化的遗传性疾病。
克隆方式
① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；
② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探
针，筛选cDNA文库。
（二）定位克隆
定义 从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩 小范围，最后克隆该基因。 系统的定位克隆工作 ① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
基因剔除程序
• 将灭活的基因放入胚胎干细胞(ES细胞),使 这一灭活的基因通过同源重组取代原有目 的基因,筛选到基因定点灭活的细胞后,通过 显微注射到小鼠囊胚. • 细胞在小鼠囊胚参与胚胎的发育,最终形成 嵌合体小鼠,由于一部分生殖细胞来源于ES 细胞,通过小鼠培养可获得纯合子基因剔除 小鼠.
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准
• 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有 多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
反义技术
• 反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为 三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成 双链;作用于非编码区;作用于启动子 • 反义DNA在DNA或RNA水平上以至转录与翻译, 其稳定性好,有广泛药用价值 • 核酶是具有酶活性的RNA,参与RNA加工与成熟,人 工合成的核酶能抑制特定基因的表达
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
二、重组DNA技术基本原理
克隆基本过程
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体菌