第九章 基因功能研究常用方法
基因功能的研究方法课件ppt
一、计算机预测基因功能
➢ 计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序 。同源基因可以分为2类：
➢ 种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之
前的同一祖先。 ➢ 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种
关键问题。 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综合性，区分其准确的功能更加棘手。
2 ticRNA transcription inhibitory complementary RNA Ⅲ类：这类反义RNA可直接抑制靶mRNA的转录。
✓ 目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大 已经完成基因组测序的多细胞生物基因注解时遇到的最大困难是，如何鉴别外显子以及可变剪切的类型。
② 改造动物基因型，鉴定新基因和/或
其新功能，研究发育生物学
➢ 深入研究基因敲除小鼠在胚胎发育及生命
各期的表现，可以得到详细的有关该基因 在生长发育中的作用，为研究基因的功能 和生物效应提供模式。
➢ 例如，目前人类基因组研究多由新基因序
列的筛选检测入手，进而用基因敲除法在 小鼠上观察该基因缺失引起的表型变化。 目前已报道了多种学习、记忆以及LTP、 LTD 有缺陷的基因敲除动物，发现多种基 因在学习、记忆的形成过程中必不可少。
反义RNA(anti sense RNA)是指mRNA互补的RNA分子。 这已在不少实验中得到证实。
高等真核细胞内外源DNA与靶细上。
2 基因敲除的技术路线如下：
自然发生同源重组的机率非常低，约为百万 对于能够引发疾病反应的蛋白互作可以采取药物干扰的方法，阻止它们的相互作用以达到治疗疾病的目的。
研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
功能基因组研究方法
功能基因组研究方法功能基因组学是一种研究基因产物在特定情况下（如特定发育阶段或疾病）的动态表达，并尝试建立基因型（功能）与表型联系的模型。
以下是功能基因组学的一些常见研究方法：1. 基因敲除（Knockout）：通过随机突变或特定的基因编辑技术（如CRISPR-Cas9）使细胞或生物体失去一个或多个基因的功能，以研究该基因的功能。
2. 基因过表达（Overexpression）：通过转染或转化技术使细胞或生物体表达更多的特定基因，以研究该基因的功能。
3. RNA干扰（RNAi）：利用RNA干扰技术来抑制或减少特定基因的表达，以研究该基因的功能。
4. 转录组学（Transcriptomics）：研究所有基因的转录产物（mRNA或非编码RNA）的表达和调控。
5. 基因芯片（Gene chips）：用于测定基因表达水平的高通量技术，可在同一实验中同时分析数千个基因的表达水平。
6. 体内或体外分子相互作用研究（In vivo or In vitro molecular interaction studies）：通过分析蛋白质和DNA、RNA等分子之间的相互作用，以了解它们之间的功能和关系。
7. Microarray 微阵列芯片（Microarray）是DNA探针的集合，探针通常是“喷墨印刷”在载玻片（Agilent）上或原位合成（Affymetrix）的挂衣核苷酸链（oligo）。
来自目标样品的标记单链DNA或反义RNA片段在特定调节下与DNA微阵列杂交，随后检测特定探针的杂交量。
杂交量与样品中的核酸片段数量成正比。
Microarray可分为：单色和双色。
以上信息仅供参考，如需获取更多详细信息，建议查阅相关书籍或咨询专业人士。
2016.1.12基因功能的常用研究方法
一个人什么时候，在哪里活动——提示其身份
基因表达的时间和部位——提示其功能 例如，如果基因A在胚胎发育过程中表达，成年后不表达，则提示该 基因与发育有关。基因B在在大脑的海马中表达，而海马与记忆有关， 那么这个基因可能与记忆有关
第一招： 天地人合举例——人合
第三个问题——她是哪个系的？她有什么兴趣爱好？ 信息来源：她有两个个形影不离的好朋友。你恰好有同学认识她的这 两个朋友。同学告诉你：她两个好朋友都是中文系的，都喜欢打羽毛 球
有时全身性的过表达、低表达或者基因敲除会出现我们不想要的结果。 例如，全身性的基因敲除会致命。为了解决这个问题，现已开发出许 多种组织特异性和时间特异性的过表达、低表达和基因敲除技术，使
得基因调控更加准确
第三招：上下求索
横向：基因需要经过转录为RNA、翻译为蛋白质至少两步才能发挥
功能。所以，研究一个基因的功能，就可以在DNA、RNA和蛋白质
第二招：患得患失
两种方法 第一种方法是失去
Βιβλιοθήκη 第二种方法是得到得到和失去，都可以让我们知道事物和人物的功能，而其中失去更为
有效
第二招：患得患失
得，指的是基因的过表达（Over-expression）；失，指的是基因敲除 （Knockout）或者低表达（Under-expression）。例如研究的假说是 基因A与记忆力呈正相关，那么可以这样设计实验：先过表达基因A， 预期结果是记忆力增强，再降低基因A的表达水平，或者完全敲除， 预期结果是记忆力减弱。高质量的实验设计，一般应该“患得患失”，
达水平的变化是否不足
第二招：患得患失
有时即使完全敲除一个基因也看不到任何表型的改变，此时也不能下 “研究基因与研究表型无关”结论。（桥、桥墩：桥墩在这里好比处 于同一个通路具有相似功能的基因，桥是否可以通车好比基因的表型 是否正常）。在敲除一个基因A看不到表型改变的情况下，可以在基 因B（与A的功能具有相似性，或者是上下游的基因）敲除的动物模 型上敲除基因A，观察敲除后是否有变化
第九章基因功能研究常用方法
第九章基因功能研究常用方法基因功能研究是生物学研究中的重要部分，通过研究基因的功能和表达方式，可以揭示基因在生物体发育、生长和疾病发生等方面的关键作用。
为了实现对基因功能的深入了解，科学家们发展了各种基因功能研究的方法。
以下将介绍一些常用的基因功能研究方法。
1. 基因敲除（Knockout）：这是一种研究基因功能的重要方法。
通过CRISPR/Cas9等技术将目标基因的部分或全部序列剔除，使其无法表达，观察敲除后的生物体表现出的表型变化。
这种方法可用于验证基因的功能，发现其在生物体中的作用。
2. 基因突变（Mutation）：通过诱发基因突变或筛选已有基因突变体，研究基因的功能和表达方式。
其中，随机突变（例如化学物质诱变）和目标突变方法（例如诱导突变）是常用的策略。
研究基因突变体可以揭示基因对于生物体正常发育和功能的影响。
3. 基因过表达（Gene Overexpression）：通过将目标基因插入表达载体并导入生物体，使基因在生物体中过度表达。
观察过度表达基因后生物体的表型变化，可以了解基因过度表达对生物体的影响。
此外，过度表达基因还可用于验证一些基因在特定条件下的功能和路径。
4. 基因沉默（Gene Silencing）：通过RNA干扰（RNAi）或转座子的反义RNA，使目标基因的转录或翻译过程受到阻碍。
基因沉默可用来研究基因造成的表型变化以及调控基因的功能。
5. 基因共表达（Gene Co-expression）：通过分析大规模基因表达数据，探索基因间的共表达关系。
通过比较共表达基因的功能和通路，可以发现基因的相互关联及其在生物体中的功能。
6. 基因互作（Gene Interaction）：通过分析基因间的物理相互作用和遗传相互作用关系，了解基因在调控和相互影响方面的作用。
这种方法对于揭示基因网络调控和疾病发生机制很有帮助。
7. 基因转移（Gene Transfer）：将外源基因导入目标细胞或生物体，以研究基因功能和转录调控。
第九章 基因治疗(一)PPT课件
(5) 基因干扰 ：也称基因失活，有两种干扰方法：
① 抑制有害基因：导入抑癌基因（TSG)来抑制癌基因的异 常表达，但不能恢复癌基因的正常功能；
② 封闭有害基因：用反义RNA或小分子抑制RNA(siRNA)
来封闭癌基因基因，同样不能恢复癌基因的正常功能，但
可用来抑制病原体的关键基因。
(6) 免疫调节：将抗体、抗原或细胞因子的基因导入患者体内， 改变患者免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。
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缺点是： （1）仅整合到处于分裂状态的细胞； （2）一些反转录病毒中存在原癌基因，其会
引起癌变的发生； （3）反转录病毒的LTR可致使细胞癌变； （4）常常只有短暂表达； （5）病毒滴度低（107pfu/ml）；插入容量有
限，不能插入较大的基因。
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2．构建重组反转录病毒载体
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1972年T.Friedmann 和R. Roblin在Science 上发表了题为“基因治疗人类的遗传病 （Gene therapy for human geneticdisease）” 的文章。
但鉴于体外重组技术刚刚问世，人们对 “基因治疗”尚感到远不可及，因而未得 到学术界的认可。
③外源野生型目的基因具有适宜的受体细胞并能在 体外有效表达；
④具有安全有效的转移载体和方法，以及可供利用 的动物模型。
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三、基因治疗的靶细胞选择
目前基因治疗中尚不能使用生殖细胞作为靶细胞， 而只能使用体细胞。选择靶细胞须考虑：
①最好为组织特异性细胞；
②细胞易获得，具有增殖优势，生命周期长，能存 活几个月至几年；
第九章基因功能研究常用方法
载体
目的基因（外源基因）
质粒 噬菌体 病毒 基因组DNA
限制酶消化
开环载体DNA
cDNA 人工合成 PCR产物
目的基因
连接酶
重组体
转化 体外包装，转染
带重组体的宿主
筛选
表型筛选
酶切电泳鉴定
菌落原位杂交
目录
第二节 转基因技术与核转移技术
一、转基因技术
转基因技术 采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动 物子宫，使之发育成个体。
获取同一拷贝的过程称为克隆化()，即无性 繁殖。
技术水平：分子克隆 即 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物）
克隆
应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传 物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然 的或人工的）与载体接合成一具有自我复制能力 的分子——复制子，继而通过转化或转染宿主细 胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行 扩增提取获得大量同一分子。 也称基因克隆或重 组。
转基因——被导入的目的基因 转基因动物( ) ——目的基因的受体动物
转基因生物是指用实验方法导入的外源基因
在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从1982年等首次将大鼠生长激素基因 导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体比对照 组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项高新技 术受到各国重视，发展迅速，取得不少突破，全 世界已申请的工程动物专利达到80多项。
重组技术中常用的工具酶
பைடு நூலகம்
（三）目的基因
目的基因 ① 分离获得某一感兴趣的基因或 ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
• • 基因组
（四）基因载体
定义 为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达 有意义的蛋白质所采用的一些分子。
现代分子生物学-第九章 分子生物学基本研究法(下)-基因功能研究技术
转录组测序分析和RNA-Seq
转录组(transcriptome)，广义上指在某一特定生理 条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所 有RNA的总和，包括信使RNA (mRNA)、核糖体 RNA (rRNA)、转运RNA (tRNA)及非编码 RNA(non-coding RNA或sRNA); 狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
转录因子与顺式作用元件结合，激活最基本启动子Pmin， 使报告基因表达。若接入3个以上顺式作用元件，可增强 转录因子的识别和结合效率。
结构域
二者融合 导入酵母 细胞
上游
启动子 下游
酵母单杂交体系主要用于：
确定某个DNA分子与某个蛋白质之间是否存在相互作用；
分离编码结合于特定顺式调控元件或其他DNA位点的功
胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定 了哺乳动物基因敲除的技术基础。
6. 2. 3 植物基因敲除技术
T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广 泛的基因敲除手段。
利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基 因的DNA序列整合到基因组DNA上，如果这段 DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基 因的表达，从而使该基因“失活”。
关于基因敲除技术，噬菌体的Cre/Loxp系统、 Gin/Gix系统、酵母细胞的FLP/FRT系统和 R/RS系统是现阶段常用的四种定位重组系统， 尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。
1、完全基因敲除：
Neo基因有双重作用：①形成靶位点的插入突变；②作为
正向筛选标记。
取代型
插入型
由于基因转移的同源重组自然发生率极低， 动物的 重组概率约为10-2～10-5，植物的概率为10-4～10-5， 即使采用双向选择法也很难保证一次就从众多细胞 中筛选出真正发生 了同源重组的胚胎干细胞。
分子生物学-基因功能研究方法
质谱技术的基本原理是样品分子离子化后，根据 不同离子间质荷比(m/z)的差异来分析蛋白质和多肽
的分子量和对蛋白质进行鉴定，磷酸化蛋白质分析、 糖基化蛋白质分析等, 也能检测核酸的SNP。
MALDI-TOF 和 ESI-MS
MALDI基质辅助激光解吸离子化是将样品均匀包埋在固体基 质中，基质吸收激光提供的能量而蒸发，携带部分样品分子 进入气相，并将一部分能量传递给样品分子使其离子化，这
快速、大信息量的检测。
主要特点
高通量、微型化和自动化。芯片上集成 的成千上万的密集排列的分子微阵列， 能够在短时间内分析大量的生物分子， 使人们快速准确地获取样品中的生物信 息，效率是传统检测手段的成百上千倍。 但目前的成本较高，重复性较差。
生物芯片分类 (1) ---用途
1 . 样品制备芯片 2. 生化反应芯片（如PCR芯片）
Protein-protein 相互作用的检测
免疫共沉淀技术 (CoIP)
蛋白-蛋白相互作用 常验证酵母双杂交的结果
Protein检测
蛋白质磷酸化分析
蛋白磷酸化是一种重要的细胞信号调控方 式
一般在丝氨酸, 苏氨酸和酪氨酸上磷酸化. 蛋白激酶---磷酸化;
蛋白质磷酸酯酶----去磷酸化. 一般通过双向电泳和质谱分析. 也可通过磷酸化抗体Western blot检测
分子生物学-基因功能研究方 法
分子生物学技术体系
一. 基本技术 二. 基因(狭义)及产物 分子检测技术 三. 基因(狭义)及产物 获取技术 四. 基因 () 功能研究技术
一. 基本技术
1. 琼脂糖凝胶电泳 2. SDS-PAGE 电泳 3. PCR技术 4. 细菌转化
1.琼脂糖凝胶电泳
基因功能研究方法
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酵母双杂交系统
酵母双杂交系统是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相 互作用的简便而有效的研究方法。
双杂交技术的基础是在一些转录因子中发现的DNA结合结构与和 转录激活结构域，一个转录激活结构域联合一个DNA结合结构域有可 能在TATA框位置启动RNA聚合酶Ⅱ复合体的装配，引发转录过程。
优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
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YAC要具备的主要功能成份
1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件
主要方法有物理的、化学的和生物的方法。
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2.1 物理方法 1>. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但
注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
2>. 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。
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优点：此技术整合位点确定、精确，转移基因频率较 高，既可以用正常基因敲除突变的基因，以进行性状 的改良和遗传病的治疗；又可以用突变的基因敲除正 常的基因，以研究此基因在发育和调控方面的作用。
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目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: (1)克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA序列, 用插入、
基因功能分析的方法和原理
基因功能分析的方法和原理基因功能分析是研究基因在细胞内所起作用的一种方法。
它探究基因是如何影响生物的生理活动、发育过程和疾病表现的。
通过基因功能分析，科学家可以深入了解基因的调控机制，揭示基因在不同生物体系中的功能，并且有助于识别和理解疾病的基因变异。
基因功能分析的方法主要包括基因沉默、基因过表达和基因敲除等。
其中，基因沉默是指抑制基因的表达，减少或消除基因的功能。
常用的基因沉默技术有RNA 干扰（RNAi）和使用反义寡核苷酸技术。
RNAi 是一种通过介导mRNA的降解来抑制特定基因表达的机制。
通过合成双链小干扰RNA (siRNA) 或构建操纵RNAi的表达载体，可以选择性地降低目标基因的表达水平。
反义寡核苷酸技术则是设计成与目标基因的mRNA序列互补的寡核苷酸，以阻断其翻译或增加其降解，从而靶向抑制特定基因。
基因过表达是指增加特定基因的表达水平，以增加或改变基因的功能。
基因过表达的方法主要包括转基因技术、CRISPR/Cas9技术和表达载体介导的过表达等。
转基因技术通过把目标基因导入到特定生物体系中，使其在细胞内产生高表达。
CRISPR/Cas9技术则是一种高效且精准的基因编辑工具，可以实现基因的过表达。
表达载体介导的过表达则是通过构建含有目标基因的表达载体，并将其转染至细胞中，使细胞能够大量产生目标基因。
基因敲除是指在生物体内删除目标基因，观察敲除后生物体发生的变化。
常用的基因敲除技术有CRISPR/Cas9技术和选择性基因敲除技术。
CRISPR/Cas9技术通过设计合成特定的RNA与Cas9蛋白结合，形成RNA-Cas9复合物并导入到细胞中，从而切割目标基因的DNA序列，导致基因敲除。
选择性基因敲除技术则是通过设计引物，在细胞内产生剪切效应，并从整个基因组中获得目标基因的敲除。
基因功能分析的原理是基于对基因组、转录组和蛋白质组进行系统性的分析。
通过利用不同的技术手段，如DNA测序、RNA测序和质谱仪等，研究人员可以获得大量的基因和蛋白质的信息，进而了解它们的表达模式、功能等。
基因功能的实验验证方法
基因功能的实验验证方法
一、基因敲除和回复实验
基因敲除实验是通过特定的方法将基因敲除或沉默，观察其敲除或沉默后对细胞或生物体的影响，从而验证基因的功能。
回复实验则是将敲除的基因恢复，以验证基因的缺失是导致表型改变的原因。
二、基因转录和翻译水平检测
1.转录水平检测：通过逆转录PCR（RT-PCR）等技术检测基因的转录产物，
了解基因在不同条件下的表达水平，从而验证基因的功能。
2.翻译水平检测：通过Western blot等技术检测基因的蛋白质产物，了解蛋
白质的表达水平和修饰情况，进一步验证基因的功能。
三、基因表达谱分析
基因表达谱分析是通过高通量测序等技术检测细胞或组织中所有基因的表达情况，了解基因在不同条件下的表达差异，从而筛选出与特定生物学过程相关的基因，进一步验证其功能。
四、蛋白质相互作用研究
蛋白质相互作用研究是通过特定的实验方法检测蛋白质之间的相互作用，了解蛋白质之间的相互关系和作用机制，从而验证基因的功能。
常见的蛋白质相互作用研究方法包括酵母双杂交、免疫共沉淀等。
五、生物信息学分析
生物信息学分析是通过计算机技术和算法对生物数据进行分析和挖掘，了解基因的结构、序列、表达和功能等信息，从而验证基因的功能。
常见的生物信息学分析方法包括基因注释、基因网络分析等。
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（二）克隆载体的选择和构建 若将外源基因连接到复制子(基因载体) 上,外源DNA就可以作为复制子的一部分 在受体细胞内复制. 在基因克隆中基因载体的选择与构建是 一项技术性很强的工作,直接影响到基 因克隆的成败.
（三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接
方式：(1)同一限制酶切位点连接
(2)不同限制酶切位点连接
又称重组DNA工艺学。
目的 ① 分离获得某一感兴趣的基因或DNA ② 获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）
（二）工具酶
• 限制性核酸内切酶
• DNA聚合酶Ⅰ
• 逆转录酶
• T4DNA连接酶
• 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶
重组DNA技术中常用的工具酶
工具酶 功 能
限制性核酸内切酶
交换分析、连锁不平衡分析
② 分子生物学分析法
• 1.体细胞杂交法 p283 • 2.原位Βιβλιοθήκη 交和荧光原位杂交 • 3.连锁分析
体细胞杂交:
• 细胞杂交又称细胞融合,是将来源不同的两种细胞 融合成一个新细胞(杂种细胞). • 大多数细胞杂交是用人的细胞与小鼠的体细胞杂 交,它的特点是在其繁殖传代过程中保留小鼠染色 体而人染色体逐渐丢失 • 仅保留少数甚至一条人染色体的细胞正是进行基 因连锁分析和基因定位的有用材料只需要集中精 力于某一染色体上,就可找到某一基因座位
克隆载体(cloning vector)
为使插入的外源 DNA序列被扩增而特意
设计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源 DNA序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为表达载体。
载体的选择标准
• 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体 的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有 多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我
复制能力的DNA分子——复制子，继而通过转化
或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子
细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子。
也称基因克隆或重组DNA 。
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等 基因工程(genetic engineering) —— 实现基 因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，
RNA干涉(RNAi)
• RNA干涉技术是利用体外合成的短双链 RNA(21-23nt) 抑制细胞内特定基因表达的 技术,是转录后基因失活的一种研究基因功 能的有力工具 • 机制:
RNAi技术
Dicer
RNAi技术
siRNA
5’
3’
3’
5’
Initiation Step
ATP ADP + ppi
转基因动物的鉴定
• Southern杂交 确定外源基因的整合以及整 合的拷贝数 • RT-PCR 确定外源基因的转录和转录水平 • Western杂交 确定外源基因蛋白质的表达 情况 • 实时PCR（荧光定量PCR）
转基因技术的应用
• • • • （1）建立致病基因表达、调控的动物模型 （2）动植物新品种的培育 （3）各种基因工程产品的制备 （4）探讨生殖细胞的基因治疗方法
论文格式
• 题目 • 摘要（Abstract) 200字以内 • 正文 前言 正文 问题与展望 参考文献 10-15篇
• 完成方式：手写稿或电子打印稿 • 完成日期：2012年12月15日前交到医学实 验楼B-312或者下周上课课堂上交。
第
五
节
疾病相关基因的克隆与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
第九章 基因功能研究常用方法
主讲教师：熊伟
大理学院基础医学院生物化学与分子生物学教研室
弄清基因的生物学功能,才能明确基因 在疾病发生中的具体作用、弄清疾病发生 的分子机制。常用的基因功能研究技术包 括： （1）DNA克隆技术 （2）转基因技术和核转移技术（动物克隆） （3）基因敲除技术 （4）反义技术 （5）RNA干涉技术
第一节 DNA克隆技术
（一） DNA克隆
克隆(clone) 来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)， 即无性繁殖。
技术水平：分子克隆
细胞克隆
即DNA 克隆
个体克隆（动物或植物）
DNA克隆 应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传
物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然
1. 质粒 (plasmid)
特点 能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些 遗传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。
2. 噬菌体(phage)
λ噬菌体DNA改造系统 λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）
EMBL系列（臵换型，适用基因组克隆）
M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因） M13mp系列 pUC系列
2. 免疫学方法
如免疫化学方法及酶免检测分析等
重组DNA技术操作的主要步骤 载体
质粒 噬菌体 病毒
目的基因（外源基因）
基因组DNA cDNA 人工合成
PCR产物
开环载体DNA
限制酶消化 连接酶
目的基因
转化 体外包装，转染
重组体
带重组体的宿主
筛选
表型筛选 酶切电泳鉴定 菌落原位杂交
目录
第二节 转基因技术与核转移技术
• 转基因动物是动物整体水平研究目的基因 的生物技术，特点是“分子及其细胞水平 的操作，组织及动物整体水平表达”
转基因动物构建过程
• 转基因载体的构建 • 将转基因载体导入受精卵细胞或者胚胎干 细胞 • 将转基因受精卵或胚胎干细胞植入假孕小 鼠子宫中 • 对转基因动物进行鉴定
转基因的技术方法
• DNA显微注射法 • 克隆法 • 胚胎干细胞技术 • 逆转录病毒介导的基因转移 • 精子载体法等 各有优点和缺点，常用的是显微注射和克隆法
DICER
ATP ADP + ppi
KINASE
RdRP
Effector Step
• siRNA binding • siRNA unwinding • RISC activation
RNAi 技术
《医学分子生物学》课程作业 根据自身专业和研究方向，以 《RNAi技术在XXX领域的研究进展》为题目， 写一篇小综述。 写作要求： 1. 按照一般发表文献的格式书写。 2. 可查阅CNKI（中国知网）或Pubmed上相 关文献，不得抄袭！ 3. 字数：3000字左右。 4. 不得抄袭！
DNA连接酶 DNA聚合酶Ⅰ
识别特异序列，切割DNA
催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸 二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接 ①合成双链cDNA分子或片段连接 ②缺口平移制作高比活探针 ③DNA序列分析 ④填补3´末端 又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53 聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于 cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标记等 ①合成cDNA ②替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析 催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针
囊性纤维变性是一种遗传 病，患者体内会产生粘稠的 粘液，阻塞肺部、胰腺和消 化器官的内部通道，大约有 一半的患者活不过31岁。英 国PPT公司培育了植入人体 基因的克隆羊，羊奶中含有 能够治疗囊性纤维变性的人 体蛋白。 维尔莫特所在的研究所曾 向德国一家药厂出售一头这 样的转基因羊，获得50万英 镑。
基因转移和基因剔除技术在 医学中的应用
建立动物疾病可遗传的模型,探讨疾病发生机制
① 单基因决定疾病模型
进行基因剔除以模拟基因失活.
单基因疾病模型:地中海贫血,动脉硬化,老年痴呆等
② 多基因决定疾病模型
多基因疾病模型:肿瘤,高血压,糖尿病
第四节
基因沉默技术
基因沉默技术
• 反义(antisen)技术 • RNA干涉(RNA Interference,RNAi)
配伍末端连接
非配伍末端连接
（四）重组DNA导入受体菌
受体菌条件 安全宿主菌（从大肠杆菌K-12改造） 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态 导入方式 转化
转染
感染
（五）重组体的筛选 1. 直接选择法
(1) 抗药性标记选择 (2) 标志补救(marker rescue) (3) 分子杂交法 原位杂交 Southern印迹
反义技术
• 反义RNA是根据RNA序列合成的互补RNA,可分为 三类:作用于核蛋白体结合位点或与靶mRNA形成 双链;作用于非编码区;作用于启动子 • 反义DNA在DNA或RNA水平上以至转录与翻译, 其稳定性好,有广泛药用价值 • 核酶是具有酶活性的RNA,参与RNA加工与成熟,人 工合成的核酶能抑制特定基因的表达
其他
酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
二、重组DNA技术基本原理
克隆基本过程
目的基因的获取 克隆载体的选择和构建 DNA导入受体菌
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子
宫，使之发育成个体。
转基因——被导入的目的基因
转基因动物(transgenic animal)
——目的基因的受体动物
转基因生物是指用实验方法导入的外源基因 在染色体基因组内稳定整和并能遗传给后代的一 类动物。自从1982年Palmiter等首次将大鼠生长激 素基因导人小鼠受精卵雄性原核中，获得了个体 比对照组大一倍的转基因“超级小鼠”以来，这项 高新技术受到各国重视，发展迅速，取得不少突 破，全世界已申请的工程动物专利达到80多项。