基因功能的研究方法
分子生物学研究法-基因功能研究技术
分子生物学研究法-基因功能研究技术第六章分子生物学研究法（下）基因功能研究技术随着越来越多的基因组序列相继被测定，人类对生物本质的认识已经发生了重大变化。
但是，海量序列信息也向我们提出了新的挑战。
如何开发利用这些序列信息，如何通过生物化学、分子生物学等方法研究基因的功能，从而进一步了解生物体内各种生理过程，了解生物体生长发育的调节机制，了解疾病的发生、发展规律，给出控制、减缓甚至完全消除人类遗传疾病，是新时期生物学家所面临的主要问题。
转录组测序技术、原位杂交技术、基因芯片技术为研究单个或多个基因在生物体某些特定发育阶段或在不同环境条件下的表达模式提供了强有力的手段。
用基因定点突变（site-directed mutagenesis）技术、基因敲除技术、RNAi技术可以全部或部分抑制基因的表达，通过观察靶基因缺失后生物体的表型变化研究基因功能。
酵母单杂交、双杂交技术，四分体技术等都是研究蛋白质相互作用、蛋白质-DNA相互作用等的重要手段。
随着分子生物学技术的发展，研究者可以在活细胞内和细胞外研究蛋白质之间的相互作用，为认识信号转导通路、蛋白质翻译后修饰加工等提供了丰富的技术支持。
本章将主要介绍研究基因功能的各种分子生物学技术和方法。
6. 1 基因表达研究技术6. 1. 1转录组测序6.1.1 转录组分析和RNA-Seq转录组（transcriptome），广义上指在某一特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或者生物体中所有RNA的总和，包括信使RNA（mRNA）、核糖体RNA（rRNA）、转运RNA（tRNA）及非编码RNA（non-coding RNA或sRNA）；狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA的总和。
基因组－转录组－蛋白质组（genome－transcriptome －proteome）是中心法则在组学框架下的主要表现形式。
通过特定生理条件下细胞内的mRNA丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度是目前基因表达研究的基本思路。
基因功能研究方法浅介
基因敲入方法的设计十分简单， 是一个类似于 普通基因敲除方法的一步同源重组过程。不同之处 在于， 设计打靶载体时， 需将靶基因第一个外显子的 并将新的暂替换基因置于靶基因的 ( 端序列缺失， 调控序列之下， 使其能精确地按照靶基因的调控模 式表达。采用这种方法不仅能用一种基因置换另一 种基因， 而且可以系统地改变基因的结构， 分析其蛋 白产物各功能区的作用。 哺乳动物的 ! % * ， +!, 和 ! % % 基因编码单一 ! 类别的进化上保守并且对胚胎期和后期生长发育至 关重要的转录因子。但对于为什么是 ! % * 的缺失 而非 +!, 或 ! % % 的缺失可以导致淋巴细胞发育停 ! 滞却 不 是 很 清 楚。为 了 了 解 在 哺 乳 动 物 发 育 中 研究者 ! % * 和 +!, - ! % % 特异性功能的分子基础， ! 构建并检验了包括在 ! -% 和 ! &, 外显子中有微小 突变以及用人 +!, 的 <’() 序列取代 ! -% 和 ! &, 外显子的 ! % * 基因敲除突变。结果发现， !% * 基 因编码的蛋白在支持 " 淋巴细胞的发育中起着添 加剂的角色， 此外还发现由 ! % * 内源启动子驱动的 既支持 " 淋巴细胞的发 +!, 能够取代 ! % * 的功能， ［-$］ 育 。
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功能基因组学及其研究方法
第22页，幻灯Βιβλιοθήκη 共51页（三）实验性研究基因功能
基因克隆 基因敲除（knock-out） 转座子插入突变 基因的超表达 反义RNA技术 RNAi
第23页，幻灯片共51时代
第15页，幻灯片共51页
（一）鉴定DNA序列中的基因 计算机对基因组序列(DNA序列)进行分析，
包括鉴定和描述推测的基因、非基因序列及 其功能。
第16页，幻灯片共51页
根据序列分析搜寻基因
☺ 查找开放阅读框（open reading frame, ORF）
☺ 开放阅读框都有一个起始密码子，ATG，还 要有终止密码子。
研究内容两大类：DNA 数据分析； 蛋白质数据分析。
第20页，幻灯片共51页
DNA序列分析
基因结构域分析，包括启动子、转录因子 结合序列、内含子、外显子、重复序列、 开放读码框架等。
同源分析和检索，包括DNA数据库、EST 数据库、STS数据库、Unigene数据库、 Swissprot数据库等。
A dot indicates the promoter for each gene or operon. Arrows and color indicate the direction of transcribtion: dark blue genes are transcribed left to right, light blue are transcribed right to left.Overlapping gene are shown in green.
• 结构基因组学(structural genomics)是通过人类基因组计 划(Human Genome Project, HGP) 的实施来完成的。
研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
植物基因功能研究策略
克隆并分析目标基因启动子序列，鉴定转录因子结合位点和顺式作用 元件，揭示基因表达的调控机制。
蛋白质组学与代谢组学研究
蛋白质组学技术
利用质谱技术对植物蛋白质进行鉴定和定量，分析蛋白质 表达谱和互作网络，揭示蛋白质在植物生长发育和胁迫响 应中的作用。
代谢组学技术
通过高通量代谢物检测技术分析植物体内代谢物组成和含 量变化，研究代谢途径和代谢调控机制，解析基因功能与 代谢表型的关联。
功能冗余与分化分析
比较同一基因家族内不同成员在表达模式、蛋白结构等方 面的差异，分析它们之间的功能冗余与分化情况。
基因家族与表型多样性关联研究
结合自然群体或人工创制的遗传材料，分析基因家族多态 性与表型多样性之间的关联，揭示其在植物适应性进化中 的作用。
CHAPTER 05
植物基因功能研究挑战与展 望
化学诱变
利用化学诱变剂如EMS等处理植物材料，诱导基因突变，结合表型筛选和遗传分析，鉴定 基因功能。
基因表达与调控研究
实时荧光定量PCR
通过特异性引物扩增目标基因，结合荧光信号实时监测PCR产物积 累，用于研究基因在不同组织、发育阶段或胁迫条件下的表达模式 。
转录组测序
对特定生理状态下的植物组织或细胞进行高通量测序，分析转录本 丰度和差异表达基因，揭示基因调控网络和代谢途选目标基 因突变体，分析表型变化以研究基因功能。
基因互补与基因功能恢复验证
01
野生型基因互补
将野生型目标基因转入功能缺失突变体中，观察是否能恢复突变体表型
，从而验证基因功能。
02
等位基因互补
利用等位基因之间的互补性，将等位基因转入突变体中，观察是否能恢
复突变体表型，从而研究等位基因间的功能差异。
功能基因组学的基本研究思路与基本方法
功能基因组学的基本研究思路与基本方法功能基因组学，听起来像是一个高大上的专业名词对吧？别急，今天就带你走进这个有点“深奥”却又超有趣的领域，让你明白这玩意到底是怎么回事。
你知道吗？其实功能基因组学不是什么高高在上的学术语言，它就是帮助我们弄清楚基因在生物体内到底是干什么的。
咱们人体里有成千上万的基因，它们每一个都像是一个小小的工人，埋头在不同的岗位上忙碌着。
那这些工人到底在干嘛？它们有没有默契合作？这一切，就是功能基因组学要解开的谜团。
哎，你想想，咱们日常生活中，有些人特别擅长做饭，有些人擅长修电脑，大家在自己的“岗位”上发挥特长。
基因也是一样，它们各有分工。
功能基因组学就是要告诉我们，这些“基因小工人”在细胞里面扮演什么角色，如何配合，甚至是他们的工作出错会有什么后果。
想像一下，如果厨房里负责切菜的人突然拿错了刀，结果把土豆切成了蒜瓣，哈哈，后果可想而知！功能基因组学的研究，不就是要找出那些“出错”的基因吗？就是这么一回事。
说到研究方法嘛，那可真是五花八门。
咱们简单聊几种，毕竟一提到方法，很多人都头大。
不过你放心，我不会让你感觉像是读了一本《基因学大辞典》。
最常见的一种方法叫基因表达分析。
这个听起来有点复杂对吧？简单说，它就是看看哪些基因在某个时间点特别活跃。
就好比一个办公室，大家有时忙得团团转，有时又像是开了个假期。
所以，基因表达分析就相当于在记录每个基因“上班”的情况，看看他们究竟啥时候最忙，忙些什么，或者是根本没动静。
另外一种常用方法叫基因敲除，顾名思义，就是把某个基因“敲掉”，看看它不在时会发生什么。
就像在一个车间里，工人突然消失，大家还会正常运作吗？这个方法能帮我们了解某些基因是不是特别重要，或者是说，没有了它，大家还能正常工作。
就像是你家猫咪，突然变得特别粘人，原来是家里有了新鲜的空气净化器，它的基因变化影响了它的行为。
听起来是不是很有意思？不过也不是所有敲除都那么简单，毕竟有些基因真的是“全能工人”，一不小心就会把整个系统搞崩溃。
基因功能研究的具体步骤
基因功能研究的具体步骤
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊超级神奇的基因功能研究的那些事儿。
咱得先搞清楚要研究的是哪个基因，就像你要了解一个新朋友，得先知道他叫啥。
这一步呢，就需要从茫茫的基因海洋里把咱们的“目标基因”给揪出来。
可以通过各种高大上的技术，比如基因测序啥的。
揪出来之后，就得看看这个基因在细胞或者生物体里到底在啥地方待着。
这就好像要知道你的朋友平时喜欢在哪活动一样。
科学家们会用一些特别厉害的染色方法或者显微镜技术，把基因的位置给找出来。
然后呢，还得研究这个基因和其他基因之间的关系。
它是不是有一群好“基友”，大家一起合作完成重要的任务？还是它特立独行，自己玩自己的？这就得通过一系列复杂又有趣的实验来搞明白。
再说说基因的突变吧。
有时候基因会发生一些小变化，就像人会偶尔犯个小错误一样。
咱们得看看这些小错误会给基因的功能带来啥影响，是变得更强大了，还是直接“罢工”了？
还得把咱们研究出来的这些结果，放到实际的疾病或者生物现象中去验证。
看看这个基因是不是真的和某些病有关系，能不能成为治疗疾病的新靶点。
啊，研究基因功能就像是一场刺激的冒险，充满了惊喜和挑战。
科学家们就像超级侦探，一步步揭开基因的神秘面纱，为人类的健康和未来努力探索着！怎么样，是不是觉得超级酷？。
《基因功能分析》课件
蛋白质组学分析
利用质谱等技术对蛋白质进行鉴定 和定量分析，了解蛋白质的表达情 况和功能。
基因突变分析
Sanger测序
通过对目标基因进行双脱氧终止法测序，检测基 因突变位点和类型。
高通量测序
对全基因组或目标区域进行深度测序，发现基因 突变和结构变异。
随着基因技术的进步，相关的伦理和法规 也将不断完善，以保障技术的安全和合理 应用。
THANKS
[ 感是生物多样性的基础。不同物种或同一物种不同种群间的基因变异导致了生物多 样性的产生和发展。了解基因变异对生物多样性的影响有助于保护和利用生物资源。
CHAPTER 04
基因功能研究的应用
医学诊断与治疗
基因诊断
利用基因检测技术，对遗传性疾病进行早期诊断，有助于制定个性 化的治疗方案。
基因与药物反应个体差异
不同个体对同一种药物的反应可能存在差异，这种差异部 分由基因变异引起。了解个体基因变异情况有助于预测患 者对特定药物的反应。
基因与进化
基因变异与物种形成
基因变异是生物进化的驱动力之一。通过自然选择和遗传漂变，基因变异在种群中积累并 最终导致新物种的形成。
基因与适应性进化
生物在适应环境过程中，某些基因变异有助于提高生存和繁殖能力，从而在自然选择作用 下得到保留和传播。这些变异可以影响生物的生理机能、行为和形态等方面。
03
基因与个性化医疗
了解基因变异对疾病的影响有助于实现个性化医疗，为患者提供更精准
的诊断和治疗方案。
基因与药物反应
基因与药物代谢
药物代谢酶的基因变异可以影响药物的代谢速率和效果。 有些变异可能导致药物代谢过快或过慢，从而影响治疗效 果。
基因功能的研究方法
摘
要
人 类 基 目组 计 划 的顺 利 进 行 使 基 因 功 能 研 究 成 为 生命 科 学领 域 中 的 重 大 课 题 ， 因转 导 、 义 技 术 、 基 基 反 转
中圈分类号
随 着 人 类 基 因 组计 划 的 顺 利能研究成 为生命科学 领域 中的重太课 题 ， 基 目前
基 因 功 能 研 究 方 法 主 要 有 基 因 转 导 、 义技 术 、 基 园 和 基 反 转
的基 因 的 ３端 加 上 ｐｌ ｏ Ａ信 号 后 ， 达 水 平 至少 提 高 １ ｙ 表 Ｏ倍 ，
体 ｍ Ｎ 。 Ｒ Ａ
因剔除 、 色体转导 、Ｎ 染 Ｒ Ａ干 涉 等
１ 基 固转 导技 术
将 月的 基 因转 导 入 某 一 细 胞 中 ， 过 观 察 细 胞 生 物 学 行 通 为 的娈 化 来 认 识 基 因 的 功 能 ， 目前 应 用 最 多 、 术 最 成 熟 是 技 的 基 因 功 能 研 究 方 法 由 于 基 用 表 达受 转 导 效 率 和 是 丙 持 续 稳 定 表 达 两 方 面 因 素 影 响 因 此 需 慎 重 选 择 转 导 系 统 ‘： 常 用 的 基 因 转 导 系 统 分 为 非 病 毒性 表 达 系统 和 病 毒 性 表 达 系 统
因 和 基 因剔 除 、 色 体 转 导 、ｈ 染 Ｒ Ａ干 涉 等 是 目前 研究 幕 因功 能 的 主 要 方 法 ． 的 技 术 不 断 涌 现 ， 各 有 其 特 点 和 局 新 且
限性 。 关键词 基 因 功能 基 甩 转 导 ． 义核 苷 酸 ．转基 冈 ．基 因 剔 除 ． 色 体 转 导 ． Ｎ 反 染 Ｒ Ａ干 涉 叩 ５ ３ 文 献 标 识码 ｃ 文 章 编 号 ｌ０ 一０ １ ２０ ） ｔ １ ７ ４ ０ ｏ３ ６ Ｉ０ ２ ０ 一 １ — ０ ０
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
基因功能研究方法
反义技术的两种技术路线:
将表达与体内基因或mRNA互补序列的基因转入体内， 使细胞表达与目标基因互补的mRNA失活，从而阻断目 标基因的表达；
体外合成mRNA互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等 途径进入细胞，特异性的与目标mRNA作用。
反义寡聚核苷酸 与mRNA特异性结 合，阻断翻译过 程。
的部位，如球形或纤维状结构，他们介于二级结构和三级结构之间。
激活结构域:指转录因子中与转录起始复合体接触与互作的结构部
位。
优势：
它可应基因序列，它检测的相互作用在体 内发生，无需额外的纯化步骤。
删除、置换、修饰等手段重建DNA序列,使之成为靶载体； (2)将靶载体导入小鼠的胚胎干细胞中,使外源DNA与胚胎干
细胞基因组相应部分发生同源重组,将靶载体的DNA 序列 整合到内源基因组中；
(3)将胚胎干细胞受体细胞注入小鼠的囊胚，将这些囊胚 导入假孕母鼠子宫中，产生的雄性嵌合鼠子代与正常 的雌鼠交配即可获得生殖系统携带该基因的纯合鼠， 进而分析被剔除基因的功能。
优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
YAC要具备的主要功能成份
1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件
4.2 基因敲入 基因敲除技术已经成为研究基因功能的强有力手段，但对
于许多基因来说，简单的失活常导致令人费解的无改变 的表型。最常见的解释是某些其它基因取代了靶基因的 功能，但要在普通基因敲除小鼠中证明这一点十分困难。 基因敲入即通过基因打靶用一种基因替换另一种基因以 确定它们是否具有相同功能。
几种常用的基因功能分析方法和工具
几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。
Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。
在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。
这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。
研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。
在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。
EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。
由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。
研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。
其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。
EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。
由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。
这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。
同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。
2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。
基因功能分析范文
基因功能分析范文
基因敲除是一种通过将基因从生物体中删除来研究其功能的方法。
这可以通过使用人工合成的核酸链，如小干扰RNA或剪接酶导向的Cas9系统来实现。
通过将这些核酸链引入生物体，可以选择性地靶向并删除目标基因。
通过观察删除基因后是否会引起生物体的明显变化，可以确定基因在生物体中的功能。
基因过表达是一种研究基因功能的方法，可以通过在生物体中大量表达目标基因来揭示其功能。
这可以通过将目标基因的DNA序列插入到带有启动子和增强子的表达载体中来实现。
然后，携带表达载体的质粒可以被转染到生物体细胞中，从而导致目标基因的过表达。
通过观察基因过表达后生物体的变化，可以推测出基因的功能。
基因功能分析的最终目标是理解基因在生物体内的作用以及其在自然选择中的起源和演化。
这些研究对于疾病诊断和治疗、农业改良和生物技术的发展都具有重要意义。
通过深入研究基因功能，我们可以更好地理解生物体的生命活动和表型表达，为未来的研究和应用提供更多的机会。
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一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
➢ 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因 为这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但
它们有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸
位置是相同的。 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从
数据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的 相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
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根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高一区段功能的信息
5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
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三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质
一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们 所了解的基因组内容比真实的情况少的多。如 大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前 已经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传 学家认为这2种生物的大多数基因已经通过突 变鉴定，但实际上还有很多空白。
大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知 道的只有1853个，仅占43%。至于啤酒酵母， 所知更少，仅为30%。
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➢有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出 现局部相似的区段。这种情况表明，2个无 亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相 似的顺序是功能的核心区域。
➢虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却 有共同的起源。它们都是古老祖先的后裔， 在进化中一方面发生独立突变，另一方面又 因基因组重排成为新基因的组成部分。例如 信号传导蛋白，这类蛋白质一般都有2个基 本的功能域，即接受信号的功能域和传达信 号的激酶域。
➢经遗传分析将突变基因定位，然后观察这 一突变体是否与改变的表型对应。在此基 础上采用分子生物学方法进一步分离与克 隆目标基因。
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➢所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的 分子标记，然后通过物理图寻找靶位点。
➢上述传统遗传学分析的原理同样可用来设 计从基因到表型的研究。如果我们能找到 某种方法，根据待测基因的顺序使生物体 内该基因失活，亦可鉴别由此产生的表型 变异。
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二、实验确认基因功能
➢ 同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能 分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将 同源性研究的结果进一步外延。
如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难 的问题之一。
大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于 从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究 是远远不够的。
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
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3．内含子归巢突变 4．基因的超表达用于功能检测 5. 反义RNA
5.1 反义RNA的分类和作用机制
5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA )
5.3 反义RNA的功能
5.3.1 调控细菌基因的表达 5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制 5.3.3 IS10转位作用的抑制
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1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
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➢基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
➢ 同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA 顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多 种，而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要 比核苷酸的差异大的多。
➢ 以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更 加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的 是BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子 邮件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会 得到回音。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
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确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
➢ 基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系 列反应。
传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。
因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基 因相关的表型。
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1．基因失活是功能分析的主要手段
➢传统的遗传分析主要借助突变型研究表型 变异的遗传基础，利用紫外线诱导及化学 试剂处理可使生物群体产生突变个体，也 可从自然的群体中发现突变体。
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一、计算机预测基因功能
➢计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序。 同源基因可以分为2类：
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➢ 种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之 前的同一祖先。
➢ 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种 生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的 不同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形 成之后，也可能出现于物种形成之前。