研究基因功能的方法
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
➢ 至于高等生物，因其某些表型具有难以捉摸的综 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不同成员，其共同的祖先基因可能
存在于物种形成之后，也可能出现于物种形成之前。 将Ac因子转座酶的编码基因与组成型启动子如35S构建成嵌合基因表达载体，由于除去了转座因子两侧的反向重复顺序，转座酶的编
植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外
源基因在转基因植株中成功表达。
➢植物中有许多转座子系统，它们的转座机
制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
根据这个特性，将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Bait protein的基因构建在同一个表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-
的贡献，也可列出很长的一串名单。 Bait protein。
基因功能测定方法
基因功能测定方法
基因功能测定就像是在生命的神秘宝库里寻宝！咱先说说步骤呗。
首先得确定要研究的基因，这就好比在茫茫大海中找到那艘有宝藏的船。
然后可以通过基因敲除、基因过表达等方法来观察生物体的变化。
比如基因敲除，就像是把一个特定的工具从工具箱里拿走，看看没了这个工具，机器还能不能正常运转。
注意事项呢？那可不少！一定要精准地操作，不然就像射箭没瞄准，白费力气。
而且要确保实验环境稳定，不能一会儿热一会儿冷，那可不行。
说到安全性，这可是个大问题。
就像走钢丝，得小心翼翼。
在进行基因功能测定时，要确保不会对生物体造成不可挽回的伤害。
稳定性也很重要，不能今天测出一个结果，明天又变了。
这就像盖房子，得稳稳当当的，不能摇摇晃晃。
那应用场景可多了去了！在医学领域，可以帮助我们了解疾病的发生机制，找到治疗的新方法。
这不就像在黑暗中找到了一盏明灯吗？在农业领域，可以培育出更优良的品种，提高产量。
哇塞，这多棒啊！优势也很明显，能够深入了解生命的奥秘，为人类的发展做出巨大贡献。
实际案例来啦！比如研究某种疾病相关的基因，通过测定其功能，找到了新的治疗靶点。
这就像在迷宫中找到了出口，让人兴奋不已！
基因功能测定真的超级厉害！它就像一把神奇的钥匙，能打开生命奥秘的大门。
让我们一起探索这个神秘的领域吧！。
基因操作方法知识
基因操作方法知识
基因操作方法是指通过改变生物体的基因组来改变其性状或特征的方法。
这些方法可以用来研究基因的功能、生物体的生理机制，或者用来改良作物、畜禽、微生物等生物体。
常见的基因操作方法包括基因克隆、基因敲除、基因编辑、基因组测序等。
基因操作方法包括以下几种：
1. 基因克隆：通过将感兴趣的基因从一个生物体中克隆出来，然后将其转移到另一个生物体中，来研究该基因的功能。
2. 基因敲除：通过使用CRISPR/Cas9等基因编辑技术来敲除或静默特定基因，从而研究该基因在生物体中的功能。
3. 基因编辑：利用CRISPR/Cas9、TALEN等基因编辑技术，直接对生物体的基因组进行编辑，实现精准的基因修饰。
4. 基因组测序：通过测序一个生物体的全部基因组来了解其基因组结构和功能，从而深入研究生物体的遗传特性和进化过程。
5. 转基因技术：将外源基因导入到目标生物体中，使其表达新的特性或功能，常用于改良作物、畜禽等经济作物的品质和产量。
基因操作方法在生物学研究、医学治疗、农业生产等领域具有重要的应用价值，同时也引发了一系列的伦理和安全问题，因此在进行基因操作时需遵守相关的法律法规和伦理标准。
基因功能研究的具体步骤
基因功能研究的具体步骤
嘿，朋友们！今天咱们来聊聊超级神奇的基因功能研究的那些事儿。
咱得先搞清楚要研究的是哪个基因，就像你要了解一个新朋友，得先知道他叫啥。
这一步呢，就需要从茫茫的基因海洋里把咱们的“目标基因”给揪出来。
可以通过各种高大上的技术，比如基因测序啥的。
揪出来之后，就得看看这个基因在细胞或者生物体里到底在啥地方待着。
这就好像要知道你的朋友平时喜欢在哪活动一样。
科学家们会用一些特别厉害的染色方法或者显微镜技术，把基因的位置给找出来。
然后呢，还得研究这个基因和其他基因之间的关系。
它是不是有一群好“基友”，大家一起合作完成重要的任务？还是它特立独行，自己玩自己的？这就得通过一系列复杂又有趣的实验来搞明白。
再说说基因的突变吧。
有时候基因会发生一些小变化，就像人会偶尔犯个小错误一样。
咱们得看看这些小错误会给基因的功能带来啥影响，是变得更强大了，还是直接“罢工”了？
还得把咱们研究出来的这些结果，放到实际的疾病或者生物现象中去验证。
看看这个基因是不是真的和某些病有关系，能不能成为治疗疾病的新靶点。
啊，研究基因功能就像是一场刺激的冒险，充满了惊喜和挑战。
科学家们就像超级侦探，一步步揭开基因的神秘面纱，为人类的健康和未来努力探索着！怎么样，是不是觉得超级酷？。
基因功能研究方法
3.2 反义RNA技术 反义RNA 技术是利用基因重组技术,构建人工表达载 体,使其离体或体内表达反义RNA ,反义RNA 能与靶mRN A形成较稳定的二聚体,从而抑制靶基因的表达。其作 用机理可能在DNA 复制、转录及翻译多水平上抑制靶 基因的表达。
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3.3 核酶技术
核酶(Ribozyme) 技术是一类具催化活性的特殊RNA 分 子,通过碱基配对原则特异性灭活靶RNA 分子。可裂解 与其互补的mRNA及在DNA内插入DNA片段构成三链结构， 单个核酶分子可以结合多个mRNA 分子并使之在特定部 位断裂,而其本身具有较稳定的空间结构,不易受RNase 攻击,因而催化效率比反义RNA 高。常见的核酶有锤头 状、发夹状和斧头状三种,应用最多的是锤头状核酶。
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芯片的制作
• 目前常用的基因芯片制作方法：
•
接触点样法、喷黑法、原位合成法。
• 接触点样法：是将样品直接点在基体上，其优点是仪器结 构简单、容易研制，是一种快速、经济、多功能的仪器， 可以在3.6cm2面积内点上10000个cDNA。不足之处是每个 样品都必须合成好、经过纯化、事先保存的。
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• 喷黑法:是以定量供给的方式，通过压电晶体或其他推进 形式从很小的喷嘴内把生物样品喷射到玻璃载体上。同样 需要合成好的纯样品，包括cDNA、染色体DNA片段和抗体。 在1cm2面积上可喷射10000个点。
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原理: 将成千上万条DNA片段(cDNA、表达序列标 签(expressed sequence tag ,EST) 或特异的寡核苷 酸片段) 按横行纵列方式有序点样在固相支持物上。 固相支持物为硝基纤维膜或尼龙膜时称为微阵列。固 相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微 阵列就称为DNA芯片。
基因工程的手段
基因工程的手段
基因工程（genetic engineering）又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
基因工程的手段主要包括以下几种：
1.基因克隆技术：这是基因工程的基础技术之一，通过将某个有
意义的DNA片段插入到载体DNA上，形成重组DNA分子，再将其导入细胞中，使细胞表达出与该DNA片段相关的功能蛋白
质。
2.基因敲除技术：利用RNA干扰或CRISPR/Cas9技术，将目标基
因的DNA序列进行改变或剪切，使其失去功能。
这种技术可以用于研究基因的功能，也可以用于治疗某些遗传性疾病。
3.基因编辑技术：这是近年来发展迅速的一种基因工程技术，主
要包括CRISPR/Cas9系统和锌指核酸酶技术等。
这些技术可以在基因组内进行精确的修改，包括插入、删除或替换特定的
DNA序列。
4.基因转移技术：将外源基因导入到受体细胞中，使其表达并产
生相应的效应。
这种技术可以用于改良作物品种、生产药物和疫苗等。
除了以上几种主要的基因工程技术外，还有一些辅助性的技术手段，如PCR技术、凝胶电泳技术、基因测序技术等，这些技术为基因工程的实施提供了重要的支持和保障。
需要注意的是，基因工程技术虽然具有巨大的潜力和应用价值，但同时也存在一定的风险和挑战。
因此，在应用基因工程技术时，需要严格遵守伦理和法规要求，确保技术的安全性和可控性。
基因功能的研究方法
摘
要
人 类 基 目组 计 划 的顺 利 进 行 使 基 因 功 能 研 究 成 为 生命 科 学领 域 中 的 重 大 课 题 ， 因转 导 、 义 技 术 、 基 基 反 转
中圈分类号
随 着 人 类 基 因 组计 划 的 顺 利能研究成 为生命科学 领域 中的重太课 题 ， 基 目前
基 因 功 能 研 究 方 法 主 要 有 基 因 转 导 、 义技 术 、 基 园 和 基 反 转
的基 因 的 ３端 加 上 ｐｌ ｏ Ａ信 号 后 ， 达 水 平 至少 提 高 １ ｙ 表 Ｏ倍 ，
体 ｍ Ｎ 。 Ｒ Ａ
因剔除 、 色体转导 、Ｎ 染 Ｒ Ａ干 涉 等
１ 基 固转 导技 术
将 月的 基 因转 导 入 某 一 细 胞 中 ， 过 观 察 细 胞 生 物 学 行 通 为 的娈 化 来 认 识 基 因 的 功 能 ， 目前 应 用 最 多 、 术 最 成 熟 是 技 的 基 因 功 能 研 究 方 法 由 于 基 用 表 达受 转 导 效 率 和 是 丙 持 续 稳 定 表 达 两 方 面 因 素 影 响 因 此 需 慎 重 选 择 转 导 系 统 ‘： 常 用 的 基 因 转 导 系 统 分 为 非 病 毒性 表 达 系统 和 病 毒 性 表 达 系 统
因 和 基 因剔 除 、 色 体 转 导 、ｈ 染 Ｒ Ａ干 涉 等 是 目前 研究 幕 因功 能 的 主 要 方 法 ． 的 技 术 不 断 涌 现 ， 各 有 其 特 点 和 局 新 且
限性 。 关键词 基 因 功能 基 甩 转 导 ． 义核 苷 酸 ．转基 冈 ．基 因 剔 除 ． 色 体 转 导 ． Ｎ 反 染 Ｒ Ａ干 涉 叩 ５ ３ 文 献 标 识码 ｃ 文 章 编 号 ｌ０ 一０ １ ２０ ） ｔ １ ７ ４ ０ ｏ３ ６ Ｉ０ ２ ０ 一 １ — ０ ０
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
几种常用的基因功能分析方法和工具
几种常用的基因功能分析方法和工具（转自新浪博客）一、GO分类法最先出现的芯片数据基因功能分析法是GO分类法。
Gene Ontology（GO，即基因本体论）数据库是一个较大的公开的生物分类学网络资源的一部分，它包含38675 个Entrez Gene 注释基因中的17348个，并把它们的功能分为三类：分子功能，生物学过程和细胞组分。
在每一个分类中，都提供一个描述功能信息的分级结构。
这样，GO中每一个分类术语都以一种被称为定向非循环图表（DAGs）的结构组织起来。
研究者可以通过GO分类号和各种GO 数据库相关分析工具将分类与具体基因联系起来，从而对这个基因的功能进行描述。
在芯片的数据分析中，研究者可以找出哪些变化基因属于一个共同的GO功能分支，并用统计学方法检定结果是否具有统计学意义，从而得出变化基因主要参与了哪些生物功能。
EASE（Expressing Analysis Systematic Explorer）是比较早的用于芯片功能分析的网络平台。
由美国国立卫生研究院（NIH）的研究人员开发。
研究者可以用多种不同的格式将芯片中得到的基因导入EASE 进行分析，EASE会找出这一系列的基因都存在于哪些GO分类中。
其最主要特点是提供了一些统计学选项以判断得到的GO分类是否符合统计学标准。
EASE能进行的统计学检验主要包括Fisher 精确概率检验，或是对Fisher精确概率检验进行了修饰的EASE 得分（EASE score）。
由于进行统计学检验的GO分类的数量很多，所以EASE采取了一系列方法对“多重检验”的结果进行校正。
这些方法包括弗朗尼校正法（Bonferroni），本杰明假阳性率法（Benjamini falsediscovery rate）和靴带法（bootstraping）。
同年出现的基于GO分类的芯片基因功能分析平台还有底特律韦恩大学开发的Onto-Express。
2002年，挪威大学和乌普萨拉大学联合推出的Rosetta 系统将GO分类与基因表达数据相联系，引入了“最小决定法则”（minimal decision rules）的概念。
基因的功能筛选
基因的功能筛选
基因的功能筛选是指通过实验手段，确定一个基因在细胞或生物体中的功能和作用。
下面是一些基因功能筛选的方法：
基因敲除：使用CRISPR/Cas9等技术将目标基因的DNA序列精确地剪切或修改，使其无法进行转录或翻译。
观察敲除后的细胞或生物体的表现，比较与正常情况下的差异，可以确定目标基因的功能和作用。
基因过表达：将目标基因的DNA序列克隆到表达载体中，使其在细胞或生物体中得到过度表达。
观察过度表达后的表现，比较与正常情况下的差异，可以确定目标基因的功能和作用。
RNA干扰：使用RNA干扰技术，通过介导RNA降解或转录抑制，使目标基因的表达受到抑制。
观察RNA干扰后的细胞或生物体的表现，比较与正常情况下的差异，可以确定目标基因的功能和作用。
基因组编辑：通过基因组编辑技术，对整个基因组进行修改，可以发现一些对于细胞或生物体生长发育、代谢等方面具有关键作用的基因。
以上是一些常见的基因功能筛选方法，不同的筛选方法可以提供不同
的信息和角度，综合使用可以更全面地了解一个基因的功能和作用。
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研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。