10(1).基因功能的研究方法

基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门 新技术。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成 功奠定了基因敲除的技术基础。 • 1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因 敲除的理论基础。 • 到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠 模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。
5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质 之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map） 3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence tags,OSTs）
第十章.基因功能的研究方法 （一）
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
1．基因失活是功能分析的主要手段
传统的遗传分析主要借助突变型研究表型变异的遗传基础，利用 紫外线诱导及化学试剂处理可使生物群体产生突变个体，也可从 自然的群体中发现突变体。 经遗传分析将突变基因定位，然后观察这一突变体是否与改变的 表型对应。在此基础上采用分子生物学方法进一步分离与克隆目 标基因。
所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的分子标记，然后通过物理 图寻找靶位点。 上述传统遗传学分析的原理同样可用来设计从基因到表型的研究。 如果我们能找到某种方法，根据待测基因的顺序使生物体内该基因 失活，亦可鉴别由此产生的表型变异。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） 概念：基因敲除除可中止某一基因的 表达外，还包括引入新基因及引入定点 突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正Байду номын сангаас基因，也可以用正常基因敲 除相应的突变基因。
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题就是探知其功能，这是基
因组研究的一个难度很大的领域。 一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所了解的基因组内容比 真实的情况少的多。如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已 经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传学家认为这2种生物的大多 数基因已经通过突变鉴定，但实际上还有很多空白。 • 大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知道的只有1853个，仅占 43%。至于啤酒酵母，所知更少，仅为30%。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 2. 3. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上可视为同源基因； 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的80%的相似性不能称为 同源性。 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序列中所占的比例，而 相似性除一致性aa外还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的比 例总是高于一致性aa。
一、计算机预测基因功能
计算机预测基因功能的依据仍然是同 源性比较。同源基因都有1个共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序。 同源基因可以分为2类：
种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之前 的同一祖先。 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种 生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不 同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形成之 后，也可能出现于物种形成之前。 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因为 这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但它们 有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸位置是 相同的。 • 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从数 据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的相关 性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
3．内含子归巢突变 4．基因的超表达用于功能检测 5. 反义RNA
5.1 反义RNA的分类和作用机制 5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA ) 5.3 反义RNA的功能
5.3.1 调控细菌基因的表达
5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制 5.3.3 IS10转位作用的抑制
有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出现局部相似的区段。这种 情况表明，2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相似的顺 序是功能的核心区域。 虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却有共同的起源。它们都 是古老祖先的后裔，在进化中一方面发生独立突变，另一方面又因基 因组重排成为新基因的组成部分。例如信号传导蛋白，这类蛋白质一 般都有2个基本的功能域，即接受信号的功能域和传达信号的激酶域。
同源性分析可以给出整个基因或 某一区段功能的信息
同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA 顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多种， 而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要比核 苷酸的差异大的多。 以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更 加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的是 BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子邮 件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会得 到回音。
二、实验确认基因功能
同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能 分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将 同源性研究的结果进一步外延。 • 如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难 的问题之一。 • 大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于 从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究 是远远不够的。 基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系 列反应。 • 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； • 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。 因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基 因相关的表型。