10(1).基因功能的研究方法
基因功能研究的新方法
基因功能研究的新方法近年来，随着科技的飞速发展，科学家们对基因功能研究提出了新的方法。
传统的方法主要是通过基因敲除、基因表达调控和蛋白质相互作用等手段，来研究基因在生命过程中的作用。
然而，这些方法存在一些局限性，如不适用于所有基因，无法准确定位基因在细胞中的功能区等。
现在，我们介绍几种新的基因功能研究方法。
一、人工合成基因人工合成基因是一种全新的研究方法，它通过化学合成技术合成人工基因，进而研究其功能。
这种方法相较于传统方法具有以下优势：1. 可以设计和合成任意长度、任何碱基序列的DNA，因此可以快速建立大规模的基因库和基因芯片。
2. 对于难以获取的天然基因，人工合成基因可以用来替代，以便进行功能的研究。
3. 可以通过人工合成的基因来验证生物体内哪些基因是真正发挥作用的。
二、基因启动子的重组基因启动子是控制基因表达的开关。
传统的研究方法是将基因启动子与一个荧光蛋白基因连接起来，然后将其插入到实验生物中，通过观察细胞发出的荧光信号来研究基因启动子的功能。
然而，这种方法只能研究单个基因的启动子，并且无法控制启动子在不同组织或时间点的表达模式。
现在，一种新的基因启动子的重组技术被提出。
这种方法是通过将基因启动子与荧光蛋白基因分别放入两个DNA片段中，然后再将它们组合起来，形成一个完整的“基因启动子荧光蛋白基因”，即可研究这个基因的启动子功能，同时还可以控制这个基因在不同组织和时间点的表达模式，从而更全面地了解基因在生命过程中的作用。
三、CRISPR技术CRISPR技术是目前最为流行的基因编辑技术。
它可以精准地切割DNA，粘贴新的基因或删除基因。
这种技术不仅可以用于基因治疗，还可以用于基因功能研究。
CRISPR技术可以用于体细胞基因编辑或胚胎基因编辑，以快速建立基因敲除或敲入的细胞系，从而研究其变异后的性状，从而探究这些基因在生物体中的功能。
这些新的基因功能研究方法为科学家们提供了更准确和全面的研究手段。
基因功能研究常用手段
抗凝血酶III转基因羊---国际首例获准上市的药用 转基因动物
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细胞水平转基因 外源基因通过转基因过程插入到细胞的染 色体中，使其在细胞中稳定表达，成为可以表 达该外源基因的特定细胞株
基本过程
外源基因片段克隆到真核表达质粒中→用重组 表达质粒转染哺乳动物细胞→克隆化筛选→转染 细胞表达目的蛋白质→蛋白质的提取和鉴定
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1.反义技术（antisense）
根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列 的反义核酸，从而抑制特定基因的表达
类别
反义RNA 反义DNA 核酶（ribozyme）
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指由短双链RNA诱导的同源RNA降解的过程
RNAi 技术
指人工建立的利用体外合成或在细胞内表 达的短双链RNA（21-23 nt）抑制细胞内特 定基因表达的技术
主要用途
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基因功能的研究细胞模型 获得外源基因产物
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基因剔除技术
①．建立生物模型 在基因功能，代谢途径等研究 中模型生物的建立非常重要。基因敲除 技术就常常用于建立某种特定基因缺失 的生物模型，从而进行相关的研究。
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基因剔除技术
①．建立生物模型
裸鼠，此动物缺乏胸腺，不能生产T细胞， 因此造成免疫缺陷。多用于肿瘤生物学研究 以及异体移植学研究。
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基因剔除技术
基因敲除技术的应用 ②.提供廉价的异种移植器官
器官来源稀少往往是人体器官移植的一 大制约因素，而大量廉价的异种生物如猪等的 器官却不能用于人体。这是因为异源生物的基 因会产生一些能引起人体强烈免疫排斥的异源 分子，如果能将产生这些异源分子的基因敲除， 那么动物的器官将能用于人体的疾病治疗，这 将为患者带来具大的福音。
基因功能研究方法浅介
基因敲入方法的设计十分简单， 是一个类似于 普通基因敲除方法的一步同源重组过程。不同之处 在于， 设计打靶载体时， 需将靶基因第一个外显子的 并将新的暂替换基因置于靶基因的 ( 端序列缺失， 调控序列之下， 使其能精确地按照靶基因的调控模 式表达。采用这种方法不仅能用一种基因置换另一 种基因， 而且可以系统地改变基因的结构， 分析其蛋 白产物各功能区的作用。 哺乳动物的 ! % * ， +!, 和 ! % % 基因编码单一 ! 类别的进化上保守并且对胚胎期和后期生长发育至 关重要的转录因子。但对于为什么是 ! % * 的缺失 而非 +!, 或 ! % % 的缺失可以导致淋巴细胞发育停 ! 滞却 不 是 很 清 楚。为 了 了 解 在 哺 乳 动 物 发 育 中 研究者 ! % * 和 +!, - ! % % 特异性功能的分子基础， ! 构建并检验了包括在 ! -% 和 ! &, 外显子中有微小 突变以及用人 +!, 的 <’() 序列取代 ! -% 和 ! &, 外显子的 ! % * 基因敲除突变。结果发现， !% * 基 因编码的蛋白在支持 " 淋巴细胞的发育中起着添 加剂的角色， 此外还发现由 ! % * 内源启动子驱动的 既支持 " 淋巴细胞的发 +!, 能够取代 ! % * 的功能， ［-$］ 育 。
-&./ ./, 0,1,234+,*. 35 /’+)* 6,*3+, 4738,9.，./,7, /)1, :,,* +37, )*0 +37, ’*;*3<* 5’*9.&3*= !
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研究基因功能的方法
研究基因功能的方法
基因功能的研究思路主要包括:
1.基因的亚细胞定位和时空(发育期或梯度药物处理浓度,不同组织/器官)表达谱;
2.基因在转录水平的调控(可以通过genomewalkingPCR或通过已有的资源库寻找该基因的启动子等转录调控区域,通过单杂交或ChIP等技术,寻找该基因的转录调控蛋白)
3.细胞生化水平的功能研究(也就是蛋白蛋白作用复合体的寻找验证,具体方法有酵母双杂交,GSTpulldown,co-IP,BRET,FRET,BiFc等等,对该基因的表达产物做一个细胞信号转导通路的定位)
4.gain-of-function&loss-of-function:也就是分别在细胞和个体水平,做该基因的超表达和knockdown(或knockout),从表型分析该基因的功能.
功能研究应从完整的分子-细胞-个体三个层次研究,综合分析.
关于基因的表达和定位，可以这样去做：
1.mRNA水平检测基因表达：选择表达目的基因的组织/细胞（发育不同时期、机体不同部位、加处理因素...），提取RNA，反转录，做RT-PCR或realtimeRT-PCR，检测基因的表达情况/变化。
（或者以northernblot、Rnaseprotectionassay方法，检测基因的mRNA 表达情况/变化。
）
2.蛋白质水平检测基因表达：选择相应的组织/细胞，以Westernblot、免疫组化（OR免疫荧光)检测目的蛋白的表达。
3.检测目的蛋白的细胞定位：将目的基因克隆至带荧光标签（如GFP）的表达载体，在适合的模式细胞中表达，在活细胞中观察蛋白的细胞定位。
基因功能的研究方法讲解共90页
40、人类法律，事物有规律，这是不 容忽视 的。— —爱献 生
46、我们若已接受最坏的，就再没有什么损失。——卡耐基 47、书到用时方恨少、事非经过不知难。——陆游 48、书籍把我们引首，不会作诗也会吟。——孙洙 50、谁和我一样用功，谁就会和我一样成功。——莫扎特
基因功能的研究方法讲解
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
基因功能研究的方法_李新枝
·综述·基因功能研究的方法李新枝,蔡佩玲,牟林春(成都医学院基础医学院人体解剖学与组织胚胎学教研室,四川成都 610083)【中图分类号】 Q78 【文献标识码】 A 1985年在加利福尼亚大学Santa Cruz分校举行的一次会议上,有人第一次提出了共同努力测出人类基因组序列的可能性,虽然这个主意引起了许多人的兴趣,但几乎没有强的支持者[1]。
1986年,诺贝尔奖获得者Renato Dulbecco于《Science》上率先提出人类基因组计划(human geno me project,H GP),旨在阐明人类基因组的3×109个碱基对的序列,发现人类所有基因并阐明其在染色体上的位置,破译人类的全部遗传信息,使人类第一次在分子水平上全面认识自我[2]。
自1990年正式启动以来,随着人类基因组计划和其它模式生物基因组研究的顺利进行,生命科学研究已进入后基因组时代。
基因组学的研究也从结构基因组学转向功能基因组学的研究。
基因组序列测定的完成仅仅是基因组计划的第一步,更大的挑战在于如何确定基因的功能和弄清全部的遗传信息。
因而基因功能研究已成为生命科学领域中的重大课题,它将是21世纪生命科学研究的重要领域。
经典的扣除杂交(subtractive hybridization)、差示筛选(diferential screening)、cDNA替代差异分析(repre-sentative dife rential analy sis,RDA)以及m RNA差异显示(diferential display)等技术已广泛应用于差异表达基因的鉴定和克隆,但这些技术和策略对于从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究来说是远远不够的[3]。
于是,随着后基因组时代的到来,一些能够对大量基因进行全面、系统分析的新技术应运而生。
本文主要介绍近年来用于基因功能研究的较新方法。
1 微阵列分析[1]微阵列(micro array)是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差异表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项研究基因功能的新技术。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
最新基因功能的研究方法
相关性可从已知的同源基因推测新基因的功能。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上 可视为同源基因；
2. 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的 80%的相似性不能称为同源性。
3. 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序 列中所占的比例，而相似性除一致性aa外 还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的 比例总是高于一致性aa。
之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein
Linkage Map）
3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence
tags,OSTs）
确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题 就是探知其功能，这是基因组研究的一个难度 很大的领域。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） ➢ 概念：基因敲除除可中止某一基因的
表达外，还包括引入新基因及引入定 点突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因 敲除相应的突变基因。
➢ 基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。
基因功能的研究方法
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
生物学领域中的基因功能化和分析方法
生物学领域中的基因功能化和分析方法基因是生命体内非常重要的一部分。
它们携带着生物体遗传信息的基本单位，控制着个体的性状和特征。
在生物学领域中，基因功能化和分析方法一直都是关注的重点。
本文将从以下几个方面分析基因功能化和分析方法的相关内容。
一、基因功能化1. RNAiRNAi，即RNA介导的基因沉默，是一种生物过程，可以通过小RNA分子促进甲基化修饰和和组蛋白构象改变来对遗传信息进行调节。
在RNAi过程中，双链小RNA为RNA诱导复合物（RISC）提供靶标信息，并将其中一个链引导至靶标mRNA上，导致RNA酶的降解和抑制其翻译。
2. CRISPR-CasCRISPR-Cas技术是一种最新的基因编辑技术，能够精确地修改基因序列。
它可以剪切基因序列，插入或删除特定片段，以实现调整基因序列的目的。
这种技术可以在生命科学领域中广泛应用，为基因功能化提供了重要途径。
二、基因分析方法1. 基因组测序基因组测序是一种利用高通量测序技术对生物体基因组进行全面测序的方法。
它可以揭示基因组的结构和组成，检测基因突变和多态性等。
这种方法被广泛应用于研究基因对遗传性病理、药物治疗、基因家族和进化等方面的影响。
2. 基因芯片技术基因芯片技术是一种利用微阵列技术测定基因表达谱的方法。
这种方法可以分析差异表达基因和富集途径，揭示分子机制并鉴定生物标记物，对于基因功能的分析和理解提供了新的思路。
3. 质能谱表征质能谱表征是一种利用质谱仪和高能质子发射素谱(HEPS)技术对多聚核苷酸进行精确检测和鉴定。
多能谱表征被广泛应用于定性和定量生物分子，如研究蛋白质-蛋白质相互作用和质谱代谢组学等方面。
总之，基因功能化和分析方法的不断研究和发展，不仅可以对生物学和医学领域的研究提供帮助，同时也为了解生物学和人类疾病提供了更丰富的信息。
随着技术的不断提升和发展，我们对于基因的理解和应用也将越来越全面和深入。
10(1).基因功能的研究方法
胞。基因敲除的技术路线虽不复杂，但由于 高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列 自然发生同源重组的机率非常低，约为百万 分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来 是一件非常困难的工作。因此，同源重组的 筛选和检测就成了基因敲除技术所要解决的 关键问题。 目前已有多种筛选方法，其中1988年犹它大 学的Capecchi教授的研究组发展的"正负双向 选择系统"适用范围宽且效率较高。
2．转座子突变库构建
转座子标签法又称基因标签(gene tagging)， 通过构建插入突变库系统，分离与克隆功 能基因与调控顺序。这一策略主要依据以 下技术： 植物体细胞全能性； 已经建立了一套成熟的转基因系统，使外 源基因在转基因植株中成功表达。
植物中有许多转座子系统，它们的转座机 制已经清楚，通过转座子的随机插入可获 得大量的突变型，根据插入的转座子序列 合成探针，可分离被破坏的位点，并分析 它们的组成。 转座子可以发生回复突变，从插入的座位 脱离，使突变系重现野生型表型。
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重 组原理发展起来的一门新技术。80年代初， 胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的 成功奠定了基因敲除的技术基础。 • 1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源 重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。 • 到1987年，Thompsson首次建立了完整的 ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年 中，基因敲除技术得到了进一步的发展和 完善。
5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质 之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map）
基因功能研究
基因功能研究随着基因组学技术的迅速发展，基因功能研究日益成为生命科学领域的热门研究方向。
基因功能研究旨在揭示基因在生物体内的功能及其对生物体生长发育和疾病发生发展的调控机制，为疾病诊断、治疗和基因工程等领域提供理论和实践基础。
基因是生物体遗传信息的基本单位，基因功能研究是对基因在个体和种群层面上的功能进行探究。
通过研究基因功能，可以深入了解生物体的发育、生殖、代谢和适应性等重要生命过程。
此外，基因功能研究还可以揭示基因与环境之间的相互作用，为环境适应性进化和物种起源提供解释。
在基因功能研究中，常用的方法包括基因敲除、基因过表达、基因突变和基因表达谱分析等。
其中，基因敲除是研究基因功能的重要手段之一。
通过敲除特定基因，可以观察到该基因在生物体发育和生理过程中的作用。
基因过表达则是将目标基因在生物体中过度表达，从而观察其对生物体的影响。
基因突变则是通过人为干预使基因发生突变，进而揭示基因在生物体中的功能。
基因表达谱分析则是通过高通量测序技术对基因表达进行全面分析，以了解基因在不同组织和不同发育阶段的表达模式。
基因功能研究的一个重要应用领域是疾病研究。
许多疾病与基因的异常功能有关，通过研究基因功能可以揭示疾病的发生机制。
例如，通过研究肿瘤相关基因的功能，可以了解肿瘤的发生、发展和转移过程，为肿瘤的治疗提供新的靶点。
此外，基因功能研究还可以用于研究遗传性疾病、神经系统疾病和免疫系统疾病等。
基因功能研究还为基因工程和生物技术的发展提供了重要支持。
通过深入了解基因的功能，可以开发出更有效的基因编辑和基因治疗技术，为人类疾病的治疗提供新的途径。
例如，通过基因敲除和基因过表达技术，可以改变作物的抗病性、耐逆性和产量等重要农艺性状，为农业生产提供新的解决方案。
此外，基因功能研究还可以应用于鉴别个体间的基因差异，为个性化医疗和精准医学提供理论基础。
基因功能研究是生命科学领域的重要研究方向。
通过揭示基因在生物体内的功能及其调控机制，可以深入了解生物体的生命过程和疾病发生发展的机制。
基因功能研究方法
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酵母双杂交系统
酵母双杂交系统是一种基于转录重建而建立的研究生物大分子相 互作用的简便而有效的研究方法。
双杂交技术的基础是在一些转录因子中发现的DNA结合结构与和 转录激活结构域，一个转录激活结构域联合一个DNA结合结构域有可 能在TATA框位置启动RNA聚合酶Ⅱ复合体的装配，引发转录过程。
优点： 可使导入基因的水平与内源基因相当,并且具有类似 于天然的剪接机理,适用于复杂的基因功能分析。
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YAC要具备的主要功能成份
1）着丝粒：mitosis姊妹染色单体和减I同源染色体分离之必需。 2）端粒：保护染色体末端免受核酸酶的侵袭。 3）自主复制序列（ARS）元件：是染色体自主复制的复制起点。 构建YAC需要4个短序列：2个端粒，着丝粒，ARS元件
主要方法有物理的、化学的和生物的方法。
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2.1 物理方法 1>. DNA直接注射法: 是目的基因导入的最简单方法, 但
注入量有限, 能够接触到的细胞有限,故获得的细胞转 化率很低, 多通过肿瘤局部多点注射给药。
2>. 颗粒轰击技术:将目的基因包被金属以后,利用高压 发射装置, 加速包裹目的基因的金属颗粒进入细胞,从 而提高肿瘤细胞的转化率。
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优点：此技术整合位点确定、精确，转移基因频率较 高，既可以用正常基因敲除突变的基因，以进行性状 的改良和遗传病的治疗；又可以用突变的基因敲除正 常的基因，以研究此基因在发育和调控方面的作用。
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目前利用基因敲除得到转基因动物的程序可简述如下: (1)克隆基因组中某一基因的全部或部分DNA序列, 用插入、
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确认DNA顺序中的基因序列后，下一个问题就是探知其功能，这是基
因组研究的一个难度很大的领域。 一些已完成测序的基因组顺序分析表明，我们所了解的基因组内容比 真实的情况少的多。如大肠杆菌与啤酒酵母，在未开始基因组测序前已 经完成了大量常规的遗传学分析，当时遗传学家认为这2种生物的大多 数基因已经通过突变鉴定，但实际上还有很多空白。 • 大肠杆菌编码蛋白质的4288个基因中，以往知道的只有1853个，仅占 43%。至于啤酒酵母，所知更少，仅为30%。
基因敲除是80年代后半期应用DNA同源重组原理发展起来的一门 新技术。80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成 功奠定了基因敲除的技术基础。 • 1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因 敲除的理论基础。 • 到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠 模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。
所谓定位克隆就是根据与突变位点连锁的分子标记，然后通过物理 图寻找靶位点。 上述传统遗传学分析的原理同样可用来设计从基因到表型的研究。 如果我们能找到某种方法，根据待测基因的顺序使生物体内该基因 失活，亦可鉴别由此产生的表型变异。
1.1 基因敲除（Gene knock-out） 概念：基因敲除除可中止某一基因的 表达外，还包括引入新基因及引入定点 突变。 即可以是用突变基因或其它基因敲除 相应的正常基因，也可以用正常基因敲 除相应的突变基因。
二、实验确认基因功能
同源性分析并非万灵药方，对许多新基因的功能 分析还必需依赖其他的实验手段进行补充，并将 同源性研究的结果进一步外延。 • 如何确定一个基因的功能是基因组计划中最困难 的问题之一。 • 大多数分子生物学家认为现有的技术与策略对于 从基因组测序所获得的大量未知基因的功能研究 是远远不够的。 基因的功能是一个过程，是从基因到表型的一系 列反应。 • 传统的遗传分析是从表型出发最终到达基因； • 现在的基因功能研究是从基因出发直接推导表型。 因此必须寻找一系列的实验方法来鉴别与目标基 因相关的表型。
有时在2个无明显亲缘关系的基因之间会出现局部相似的区段。这种 情况表明，2个无亲缘关系的蛋白质可能具有相似的功能，相似的顺 序是功能的核心区域。 虽然基因本身无共同的祖先，但其功能域却有共同的起源。它们都 是古老祖先的后裔，在进化中一方面发生独立突变，另一方面又因基 因组重排成为新基因的组成部分。例如信号传导蛋白，这类蛋白质一 般都有2个基本的功能域，即接受信号的功能域和传达信号的激酶域。
3．内含子归巢突变 4．基因的超表达用于功能检测 5. 反义RNA
5.1 反义RNA的分类和作用机制 5.2 ticRNA( transcription inhibitory complementary RNA ) 5.3 反义RNA的功能
5.3.1 调控细菌基因的表达
5.3.2 噬菌体溶菌/溶源状态的控制 5.3.3 IS10转位作用的抑制
1．基因失活是功能分析的主要手段
传统的遗传分析主要借助突变型研究表型变异的遗传基础，利用 紫外线诱导及化学试剂处理可使生物群体产生突变个体，也可从 自然的群体中发现突变体。 经遗传分析将突变基因定位，然后观察这一突变体是否与改变的 表型对应。在此基础上采用分子生物学方法进一步分离与克隆目 标基因。
根据同源性预测基因时必需注意以下几点：
1. 2. 3. 一般认为aa的一致性或相似性在25%以上可视为同源基因； 同源性与相似性的含义不同，如aa顺序的80%的相似性不能称为 同源性。 一致性常指同一位置同一aa在整个多肽序列中所占的比例，而 相似性除一致性aa外还包括可取代aa的成员，因此相似性aa的比 例总是高于一致性aa。
5.4 人工合成构建反义RNA 5.5 使反义RNA分子稳定的方法
三、其他的基因功能研究方法 １．噬菌体展示(phage display) ２．酵母双杂交 (yeast two-hybridization)
2.1 概念 2.2 实验步骤 2.3 利用酵母双杂交发现新的蛋白质和蛋白质的新功能 2.4 利用酵母双杂交在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用 2.5 利用酵母双杂交筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质 之间相互作用的影响 2.6 利用酵母双杂交建立基因组蛋白连锁图(Genome Protein Linkage Map） 3. 开放读框顺序标签(open-reading-frame sequence tags,OSTs）
同源性分析可以给出整个基因或 某一区段功能的信息
同源查询除了直接比较DNA顺序外，还可将DNA 顺序翻译为aa顺序。由于组成蛋白质的aa有20多种， 而DNA核苷酸只有4种，因此aa顺序的差异要比核 苷酸的差异大的多。 以aa顺序进行同源性比较的结果更为准确，也更 加可行。已有许多软件可用于这项分析，常用的是 BLAST。研究者只要将资料以正确格式的电子邮 件发送到DNA资料库BLAST服务站，很快就会得 到回音。
第十章.基因功能的研究方法 （一）
一、计算机预测基因功能 二、实验确认基因功能 1．基因失活是功能分析的主要手段
1.1 基因敲除（Gene knock-out）
1.2 基因敲除的技术路线 1.3 基因敲除的主要应用领域及国内外研究进展 1.4 基因失活的表型效应有时不易分辨
2．转座子突变库的构建
2.1 插入序列 2.2 实验步骤
一、计算机预共同的祖 先基因，他们之间有许多相似的顺序。 同源基因可以分为2类：
种间同源基因或直系基因(orthologous gene) 这是指 不同物种之间的同源基因，它们来自物种分隔之前 的同一祖先。 种内同源基因或平行基因(paralogous gene) 同一种 生物内部的同源基因，它们常常是多基因家族的不 同成员，其共同的祖先基因可能存在于物种形成之 后，也可能出现于物种形成之前。 同源基因一般不会有完全一致的核苷酸顺序，因为 这两个基因在出现后独立的发生随机突变，但它们 有相似的顺序组成，大部分未突变的核苷酸位置是 相同的。 • 当一个新的基因序列被确认后，根据同源性可从数 据库中查找已知顺序的同源基因。根据进化的相关 性可从已知的同源基因推测新基因的功能。