复方茵陈制剂对小鼠急性肝损伤保护作用的研究黄志坚,杨丽英,

复方茵陈制剂对小鼠急性肝损伤保护作用的研究黄志坚，杨丽英，陈强，李清禄，江和基（福建农林大学动物科学学院，福州，350002）摘要：研究复方茵陈制剂对小鼠体内急性CCL4肝损伤的保护作用及其作用机理。

按5.5g/kg,11 g/kg,16.5 g/kg复方茵陈制剂的剂量分别对小鼠连续给药4d，第3d颈部皮下注射0.5%的CCL4-花生油溶液（0.1ml/10g），分离血浆和肝脏,研究复方茵陈制剂对急性肝损伤的组织学变化及其对AKP、ALT、AST、SOD、GSH-Px的活力、MDA 的含量的影响。

注射CCL416h后,模型组小鼠的血浆AST、ALT比对照组分别提高211.6％和947.14%，差异极显著（P<0.01）；高、中、低剂量三组比模型组的血浆AST、ALT分别降低 28.23％，32.04％，49.23％和72.13％，42.98％，34.18％，差异极显著（P<0.01）；AKP除阳性药组与对照组比较有显著性差异外，其余组间均不存在显著性。

结果表明，模型组的SOD和GSH-P X比对照组含量分别降低48.49%和28.57%，MDA比对照组含量增加103.77%。

与模型组比较,中剂量组和高剂量组分别提高361.76%，197.06%和94.28%，85.71%,差异极显著（P<0.01），但低剂量组则无显著差异。

高剂量组的MDA与模型组比较，含量提高54.33%，显著差异（p<0.05），但中、低剂量组则无显著差异。

模型组肝脏系数比对照组降低15.68%，显著差异（P﹤0.05），但与模型组相比，给药组均无显著差异。

组织病理学显示，给药组小鼠肝细胞变性、坏死程度明显轻于造模组，其中以高剂量组的效果最好。

可见复方茵陈制剂对动物的肝损伤具有一定的保护作用。

肝脏是动物体体积最大的实质性腺体和重要的代谢器官，具有很多重要而复杂的生理机能。

肝损伤是肝病最常见的病理变化(包括脂肪肝、急性肝炎)，是导致肝硬化的重要原因。

由细菌、病毒或寄生虫原因引发的肝炎是引发肝损伤的主要原因，此外还有药物引起的中毒，营养结构的代谢不平衡、饲料发霉、以及环境因素引起也可损害肝组织。

近来养殖业中的动物肝病明显增多，如奶牛，黄牛可暴发乙型肝炎；鸡的乙型肝炎、盲肠肝炎、弧菌性肝炎，脂肪肝综合症、包涵体肝炎-心包积水综合症等；雏鸭病毒性肝炎，乙型肝炎；鹅的乙型肝炎、出血性坏死性肝炎；猪，羊，家兔的乙型肝炎等，严重威胁着养殖业主的经济利益和人们的健康，但目前仍缺乏行之有效的防治措施，故探讨养殖业动物肝病的发病机理及寻求有效的防治药物已成为当今国内外研究的热点课题。

本试验是以CCL4引起的急性肝损伤为肝炎模型，应用复方茵陈制剂，通过检测肝功能生化试验指标AST、ALT、AKP和抗氧化指标SOD、MDA、GSH-P X以及肝脏的组织病理学观察变化探讨作用机理，为复方茵陈制剂治疗肝损伤提供了药效学依据。

1材料与方法1.1材料1.1.1受试药物复方茵陈制剂，每g颗粒含0.564 g总药材（生药），本试验室自制。

试验时用蒸馏水配制成所需浓度的药液供试验动物灌胃用。

联苯双酯滴丸，北京协和药厂生产,每丸1.5mg，批号03120105.1.1.2试验动物昆明小鼠，体重18～22g，雌雄兼用，由福建医科大学试验动物中心提供。

1.1.3试验仪器和试剂紫外分光光度计、高速冷冻离心机等。

AST、ALT、AKP、SOD、MDA、GSH-PX、TP试剂盒均购自南京建成公司。

1.2方法1.2.1模型的制备和给药将小鼠60头随机分为6组，每组10只小鼠（称重）。

①为正常对照组（Ⅰ组，生理盐水，0.3ml/10g）②模型CCL4组（Ⅱ组，生理盐水，0.3ml/10g）③联苯双酯阳性对照（Ⅲ组，2mg/10g）④～⑥为复方茵陈颗粒制剂高、中、低剂量组（Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组，给药按临床成人50kg每日31g生药量的5倍、10倍、15倍折算为小鼠给药量分别为5.5g/kg体重，11 g/kg体重，16.5 g/kg体重）。

正式试验前，所有动物禁食不禁水12小时。

动物每天灌胃给药1次，连续4天，空白组和模型组灌服同等体积的生理盐水。

于给药第3天，除正常对照组外，其余五组颈部皮下注射0.5%的四氯化碳-花生油溶液（0.1ml/10g），注射后禁食不禁水，16小时后模型建立。

1.3检测指标1.3.1 肝功能AST、ALT、AKP检测16小时后立即眼眶采血，肝素抗凝，4000r/min离心10min，取上清液测定AST、ALT、AKP,取肝备检。

1.3.2 肝脏系数的计算剖取小鼠肝脏，用电子天平称重，计算肝脏系数。

肝脏系数=肝脏重量（mg）/体重（g）×100%。

1.3.3 SOD,MDA,GSH-P X的检测取剩下的肝组织进行肝匀浆。

生理盐水漂洗,在冰水浴中进行磨,4000r/min离心10min,取上清,按南京建成酶试剂盒说明，用分光光度计检测SOD、MDA和GSH-P X。

1.4 肝脏组织学检查剖取肝脏同一部位组织（左叶）＜2cm，10%福尔马林固定后。

经脱水和透明、浸蜡与包埋、切片、HE染色，在光镜下进行病理组织学观察。

1.5统计方法结果采用SPSS11.0统计软件,用方差检验比较组间和组内差异显著性。

2 结果2.1 复方茵陈制剂对急性肝损伤血浆酶指标的影响注射CCL416h后,II组小鼠的血浆AST、ALT比I组分别提高211.6％和947.14%，差异极显著（P<0.01），说明肝功能明显受损，造模成功。

用药Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组比模型组的血浆AST、ALT 分别降低 28.23％，32.04％，49.23％和72.13％，42.98％，34.18％，差异极显著（P<0.01）。

AKP 除阳性药（Ⅲ组）与I组比较有显著性差异外，其余组间均不存在显著性。

见表1。

表1 药物对肝损伤血浆ALT,AST和AKP的影响（n＝10，X ±SD）（卡门单位）ALT184±95.73#378±83.78#436±174.89#70±2.51*663±22.16*275±128.42#（卡门单位）50±44.58 29±19.12 49±24.57 27±13.041 37±23.68 51±20.42** AKP（金氏单位）注：与正常组比较，*p﹤0.01，**p﹤0.05；与模型组比较#p﹤0.01，##p﹤0.052.2肝匀浆SOD,MDA,GSH-P X含量和肝脏系数的变化(见表2)结果表明，II组的SOD和GSH-P X比I组含量分别降低48.49%和28.57%，MDA比I组含量增加103.77%。

与II组比较, Ⅴ组、Ⅵ组分别提高361.76%，197.06%和94.28%，85.71%,差异极显著（P<0.01），但Ⅳ组则无显著差异。

Ⅵ组MDA与II组比较含量提高54.33%，有显著差异（p<0.05），但Ⅳ组、Ⅴ组则无显著差异。

II组肝脏系数比I组降低15.68%，有显著差异（P﹤0.05）,从另一个方面说明造模成功。

但与II组相比，Ⅳ组、Ⅴ组、Ⅵ组均无显著差异。

2.3 形态学变化（图）正常对照组细胞完整，镜下肝细胞索排列规则，肝小叶结构正常，未见肝细胞变性，坏死等病理变化。

模型组镜下见肝细胞不同程度的变性（以细胞浊肿为主），并有灶性坏死，汇管区伴中性粒细胞和单核细胞等炎性细胞的浸润。

给药低剂量组肝脏病变较模型组略轻，但差别不大；中剂量组肝细胞轻度浊肿；高剂量组肝脏病变明显减轻，无明显水样变性，肝细胞较正常。

联苯双酯组的肝脏损伤和病变程度也明显减轻，偶见轻度浊肿。

表2 药物对肝损伤肝匀浆SOD,MDA,GSH-P X含量和肝脏系数的影响（n＝10，X ±SD）MDA 1±0.79## 1.99±0.88 2.02±0.88 1.08±0.32 2.19±0.99*71±36.47#GSH-P X 肝脏系数68±14.94#47±5.6965±37.53#47±4.5757±15.9546±5.2949±20.4751±6.5635±11.1743±4.91**51±20.420**45±9.25注：与正常组比较，*p﹤0.01，**p﹤0.05；与模型组比较#p﹤0.01，##p﹤0.053讨论3.1肝损伤模型的的选择常用的肝脏动物疾病模型有化学药物中毒性肝炎模型（主要包括CCL4急、慢性肝损伤模型、D－氨基半乳糖胺急性肝损伤模型、硫代乙酰胺肝损伤模型、扑热息痛肝损伤模型、异硫氰酸苯酯和硝硫氰胺肝损伤模型）、免疫性肝损伤模型和其他肝损伤模型。

药物研究应根据功效主治，选择合适的模型，再配合作病理组织学检查，比较药物治疗后对肝细胞的保护作用。

复方茵陈制剂主要是保肝降酶药，可选择CCL4急、慢性肝损伤模型、D－氨基半乳糖胺急性肝损伤模型。

CCL4急性肝炎是化学药物中毒性肝炎模型，该模型成功率高，试验方法简便，价格低廉。

3.2 CCl4造成肝损伤的机理一般认为，CCl4损伤肝脏机理是 CCl4经肝细胞色素P450代谢激活后，生成三氯甲基（.CCl3）自由基，进一步代谢转化为氯仿及一氧化碳，同时在代谢过程中消耗NADPH 和氧。

CCl4 的毒性代谢产物（.CCl3自由基）可引起生物膜脂质过氧化，造成膜结构和功能损伤,蛋白质等物质合成代谢发生障碍。

有研究认为肝损伤与自由基及脂质过氧化有关。

近年来研究表明，肝损伤是多因素参与的复杂过程,自由基损伤和脂质过氧化在肝疾病中起着重要的作用。

3.3复方茵陈制剂对小鼠急性肝损伤保护作用在中医上，肝炎属中医学“黄疽”、“胁痛”、“积聚”、“瘟黄”等病的范畴。

其发病原因，多以感受湿热之邪。

病变多以脾胃、肝胆为重心，以湿邪困脾，湿蕴化热，湿热互结，气机不畅为主要病机特点，如果迁延不愈，邪气留连，正气亦多因之受损，就会形成脾胃、肝胆、心肾等多脏器的功能失调。

复方茵陈制剂，以茵陈为君，黄芩为臣，大黄为佐，甘草为使，配伍法度严谨。

其配方中的茵陈提取分离的水溶性成分茵陈多肽具有显著抗药物肝损伤作用；黄芩清热燥湿，并加强解毒功效；甘草缓急止痛，调胃和肝；大黄具有清除肝细胞的炎症和胆汁淤积，清除氧自由基，减轻脂质过氧化反应，保护的肝脏功能。

诸药互相配合，具有疏肝解郁，活血行气散结之功能。

肝脏含酶丰富，肝细胞坏死时，由于细胞膜通透性升高，导致细胞内酶释放引起血浆酶的声高。