流式细胞仪上海交通大学医学院医学检验系PPT课件

荧光信号 激光束
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流动室
Flow Cell
孔径50-200m 检测区离喷口200m 有分选功能
Laser
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液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。
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2、光学系统
激光、透镜组、光电倍增管等。 PM4 T
FITC
cis-Parinaric acid
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Excitation
300 nm 400 nm
500 nm
Emisson
600 nm
700 nm
DNA
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（ 二 ） 荧 光 补 偿
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻 荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”
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偿荧 光 补
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四 细胞分选原理
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单细胞照明：激光
488 nm laser
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单细胞检测：信号处理
488 nm laser
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二 散射光的测定
（一）前向散射光 (foword scatter)：FSC 信号的强弱与细胞的大小相关
（二）侧向散射光（side scatter)：SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关
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Forward Angle Light Scatter
Laser
FALS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
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90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
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前向散色光FSC
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侧向散色光SSC
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散射光的测定
利用前向角和 测向角散射光可 以把外周血白细 胞分成三群，淋 巴细胞、单核 细胞和粒细胞。
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三 荧光测量
荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 （一）光信号测量
线性放大器
对数放大器
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Common 350
457 488 514
Laser
300 nm 400 nm 500 nm
Lines
610 632
600 nm 700 nm
PE-TR Conj.
Texas Red
PI
Ethidium PE
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1 、点图
纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞
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双参数点图
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双参数点图
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2 、二维等高图
用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。
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3 、假三维等高图
纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参 数,Z轴为细Baidu Nhomakorabea数。
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Flow cell
Dichroic Filters
PMT
3
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
Laser
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E1 hv
E1
hv
hv
E1
hv hv
E0 吸收
E0 自发辐射
E0 受激辐射
当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚, 发生粒子数反分布.如有光束入射,入射光子与粒子发生 完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一 个光子.光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向 和恒定的位相关系,这种发射称受激发射.
流式细胞仪
丁磊 副教授
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流式细胞术(FCM)定义:
FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项 能快速、精确的对单个细胞理化特性进行
多参数定量分析和分选的技术。
Laser
FALS Sensor
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特点:
单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞
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一、 流式细胞仪的分析及分选原理 二、 数据的显示与分析 三、 流式细胞仪分析的技术要求 四、 流式细胞术应用
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流式细胞仪的分析及分选原理 一 工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度
自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。
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(一） 基本组成结构
1、液流系统 样品流和鞘流 2、光学系统 激光、透镜组、
光电倍增管等。 3、数据处理系统
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1样、品液流流和系鞘统流
Injector Tip
Sheath fluid
（一）分选的基本原理
488 nm laser
- Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
+
Single cells sorted into test tubes
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阴 性 选 择
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阳 性 选 择
磁 珠 分 离
MACS-Magnetic Cell Sorting
来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是 道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。 纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。
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X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.
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(二)双参数数据的显示
Two-Parameter Data Displays
细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细 胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间 的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参 数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。 在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表 第二个测量参数。
（二）分选的技术要求
1 、分选速度：几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率
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分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞
所占的百分比。
分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原
细胞样品中该亚群细胞数的百分比。
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数据的显示和分析
一、参数
前向散射光FS: 反映颗粒的大小 侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度 荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少
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二、数据的显示方式
（一） 单参数直方图显示 （二） 双参数显示 （三） 三参数显示
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(一) 单参数直方图的显示
Single-Parameter Histogram Displays 以分布直方图( distribution histogram )
(三) 三参数直方图
三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而 非细胞数。
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（四）流式细胞仪的多参数分析
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球透镜和柱面透镜 ：
光 束
20×200m 椭圆形光，短轴和细胞流平行，长 长轴与细胞流垂直。
成
形
与
细
胞
受
照
方
式
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光 束
这种椭圆形光斑的
成
检测区保证每个细
形
胞分别受到光照
与
且受检时受到一致
细
激发光焦斑 的光照 FCM的
胞 受
单细胞照明技术.
照
方
式
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（二） 基本工作原理
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单细胞流：流动室