流式细胞仪上海交通大学医学院医学检验系PPT课件
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流式细胞仪培训(ppt42张)
PMT用于检测较弱的SSC信号和荧光信号 ，光电二
极管用于检测较强的FSC信号
阈值
阈值：信号放大过程会产生不需要的脉冲信号，通常
来自于碎片。通过设定某一信号的最低强度值，可将 不需要的脉冲信号去除，这一设定值称为阈值。
荧光补偿
采用合适的方法校正荧光染料之间叠加所造成的误差
荧光补偿
补偿调整的实验过程
流式细胞仪的检测对象
藻类细胞
染色体
血细胞
原生动物细胞
任何存在于悬液中的直径为0.2-50微米的粒子或细胞都适用于流式分析
流式细胞仪工作原理示意图
流式的基本组 成： 1.流动室和 液流系统 2.光路系统 3.电系统
流式细胞仪可提供的信息
物理信息：通过散射光信号反映
相对细胞大小 相对细胞颗粒密度和内部复杂度
流式细胞仪原理与应用
陈玉婵
提
要
流式细胞仪简介 流式细胞仪工作原理 流式实验流程 流式细胞术的应用
流式细胞术的发展史
1930s~1950s:开始出现自动细胞分析技术（细 胞的计数，是通过光电仪记录流过一根毛细管 的细胞,用结合了荧光素的抗体去标记细胞内 的特定蛋白，应用分层鞘流原理，成功的设计 红细胞光学自动计数器。） 1960s晚期发展：荧光检测细胞计 、细胞分选 器检测细胞的荧光信号 、单克隆抗体技术 1973年，BD公司与美国斯坦福大学合作，研制 开发并生产了世界第一台商用流式细胞仪FACS I。
DNA含量分析-PI染色
细胞凋亡
细胞膜分析-PS外翻
PS（磷脂酰丝氨酸）正常暴露在胞膜的内表 面，凋亡时，PS外翻向细胞外表面。重组蛋白 Annexin-V可与PS结合
流式细胞仪ppt课件
DNA倍体
2N 2N 2N~4N 4N 4N
.
43
Normal Cell Cycle
M G2
G0
G1
s
C o u n t
DNA Analysis
G0G1
s G2M
0
200
400
600
800
1000
2N
4N
DNA content
.
44
.
45
DNA Analysis
300
225
150
Counts
75
.
18
3-D Histograms
.
19
免疫荧光分析
细胞表面的抗原(或细胞膜受体)与相关的 荧光抗体结合，形成带有荧光的抗原抗体复合 物。通过流式细胞仪测定其荧光量，即可得到 细胞群的不同抗原位点表达情况。
.
20
.
21
免疫荧光分析的意义：
流式细胞术与单克隆抗体结合，可对细 胞表面和细胞内抗原、癌基因蛋白及膜受体 进行定量检测，成为临床检验的一项重要指 标。流式免疫荧光技术不仅能将表达不同抗 原位点的细胞群区分开来，而且还能进一步 区分各细胞亚群。对于造血系统疾病、免疫 功能障碍及恶性肿瘤的诊断、治疗及预后评 估都起了重要作用。
.
3
FCM在生命科学中的应用,标志着细胞生物 学、肿瘤学、免疫学等进入了细胞和分子水平 的研究。为从微观认识细胞及横向比较特征提 供了精密、准确的方法和仪器.
.
4
流式细胞仪的发展史
1930 年 Caspersson 和Thorell 开始致力于细胞的计数 1934 年 Moldaven 是世界上最早设想使细胞检测自动化的人他试图用光 电仪记录流过一根毛细管的细胞
流式细胞分析精品PPT课件
Keylab of Medicine School of Su
Zhou University
6
流式细胞仪发展的历史
• 起源: 1934年--- 细胞计数仪
• 雏形: 1949年--- Coulter 计数器
•
1959年--- B型Coulter计数器
•
1972年: BD(Becton-Dickinson)
• ④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
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5
• 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流
技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采 集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了 半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
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高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本 流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流 经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数 据。
低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次 通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细 胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用 于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的 培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器， 适用于更广泛更灵活的科学研究应用。
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●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
上海交通大学医学院-流式细胞仪
流式细胞仪上海交通大学医学院丁磊副教授特点:单细胞的流动的活细胞的定量的多参数的高统计学精度的分选细胞一、流式细胞仪的分析及分选原理二、数据的显示与分析三、流式细胞仪分析的技术要求四、流式细胞术应用流式细胞仪的分析及分选原理一工作原理：FCM是一种在计算机技术支持下的高度自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。
(一）基本组成结构1、液流系统样品流和鞘流2、光学系统激光、透镜组、光电倍增管等。
3、数据处理系统InjectorTip Sheathfluid液流驱动系统（示意图）流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即P=(1/2)ρV2 (忽略高度的变化)。
改变气压,就可获得不同的流速。
PMTPMT PMTFilters1234PMT球透镜和柱面透镜：20×200μm椭圆形光，短轴和细胞流平行，长光长轴与细胞流垂直。
Array束成形与细胞受照方式激发光焦斑这种椭圆形光斑的检测区保证每个细胞分别受到光照且受检时受到一致的光照单细胞照明技术（二）基本工作原理二散射光的测定（一）前向散射光(foword scatter)：FSC 信号的强弱与细胞的大小相关（二）侧向散射光（side scatter)：SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关前向散色光FSC侧向散色光SSC散射光的测定三荧光测量荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长（一）光信号测量线性放大器对数放大器（二）荧光补偿利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”偿+-Charged Plates Single cells sorted阳性选择MACS-Magnetic Cell Sorting 磁珠分离阴性选择（二）分选的技术要求1 、分选速度：几千个细胞/秒2 、分选纯度:99.5%左右3 、分选收获率:90-95%4 、分选得率分选纯度是指分离后的样品中该亚群细胞所占的百分比。
分选收获率是指分离后所得的细胞亚群数占原细胞样品中该亚群细胞数的百分比。
流式细胞仪 ppt课件
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常用荧光染料的特性
荧光染料 激发波长 (nm) 发射波长(nm) 用途
颜色
FITC
488
525
免疫荧光 绿色
PE(RD1) 488
575
免疫荧光 橙色
ECD
488
620
免疫荧光 橙红
PeCy5 488
675
免疫荧光 红
PI
488
620
DNA染色 橙红
PECy7 488
755
免疫荧光 深红
ppt课件
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流式细胞检测样本的制备： 细胞样本的处理： 组织样本的处理 流式细胞仪检测的信号： 散射光信号：前向角散射光（Forward scatter， FSC) 与细胞大小有关；侧向角散射(Side scatter ，SSC，又 称90°角散射光）与细胞精细结构和颗粒性质有关，对 胞膜、胞质、核膜变化更敏感。 荧光信号：特异性荧光信号是指将荧光素分子耦联到特 异性抗体或分子上，当其与细胞表面或者胞浆中的抗原 结合后，被特定波长激发光激发而产生的信号； 自发荧光：个别的细胞有着他们各自特异性水平的自发 荧光（荧光信号产生于他们自身）。
流式细胞仪 FLOWபைடு நூலகம்CYTOMETER
基本概念和原理
ppt课件
1
2003年推出世界上第一台单激光五色的流式细 胞仪FC500/MCL，2005年升级为FC500/MPL
Cytomics FC500
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流式细胞术的基本概念
流式细胞术（Flow Cytometry, FCM）是一种可 以快速、准确、客观，能够同时检测快速直线流 动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性， 加以分析定量的技术，并且可以对特定群体加以 分选。其中用到的流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术 、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆 抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。在国外 又把流式细胞仪称为荧光激活细胞分选器（ Fluorescence-Activated Cell Sorting, FACS），所 以目前大多数流式细胞仪机型都以FACS命名。
《流式细胞仪》课件
便携式设备的应用
将流式细胞仪的设备体积继续缩小， 大量应用于生物界的基础研究以及 医学检测和移动采样等领域。
流式细胞仪的市场前景评估
1 市场规模
2 主要厂商
3 市场推动因素
流式细胞仪市场规模呈自上 世纪六十年代发明起逐年扩 大的趋势，预计到2027年达 到40亿美金。
Becton, Dickinson and Company、Beckman Coulter、 Merck Millipore等公司产品 市场占领率较高。
灯源
氙气灯、汞灯、钨丝灯等不同的光源都可以被用作流式细胞仪的光源，不同灯源在功率、波 长、寿命等方面存在差异。
探测器的选择
1
荧光检测器
是流式细胞仪检测系统的关键组成部分，不同的检测器可以检测不同的荧光参数， 如细胞大小、细胞形态、细胞核酸含量等。
2
散射检测器
散射检测器可检测颗粒的大小和光密度信息，如侧散射检测器用于检测细胞的大 小和形态，前散射检测器检测颗粒的光密度信息。
3 准确记录
记录样品来源、批号和实验日期等信息，并保证实验室干净卫生。
样本的处理与染色
细胞损伤
避免长时间的离心和过滤，防止 细胞的膜破坏和凋亡。
细胞处理
使用重组蛋白等方法对细胞进行 特定功能标记的处理。
荧光染色
使用专门的生物染料与细胞反应 后，在流动细胞仪中检测荧光信 号。
流式细胞仪的参数设置
软件设置
流式细胞仪最早由韦斯利·莱恩和墨菲博士等人于1965年开发。自此以后，它经历了巨大的 技术发展和应用范围的扩大。
用途
流式细胞仪可应用于人类疾病的研究、药物开发、医学诊断、基因工程、环境监测等领域。
流式细胞仪的原理
流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
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光学系统：主要由多组透镜、滤光片和分 光镜等光学元件组成，将不同波长的光信 号送入不同的探测器
滤片
1）长通滤片（long pass filter，LP ) 2）短通滤片（short pass filter，SP ) 3）带通滤片（band pass filter，BP）
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只允许特定波长以上的光通过 ，如LP500
带电细胞液滴通过静电场而 发生偏转，落入收集器中， 其他液体则被当作废液抽吸 掉，完成细胞分选的目的。
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（二）FCM分选技术要求
细胞分选对仪器的性能要求较高 分选是流式细胞仪的重要功能之一 分选功能的装置较为复杂
► 分选指标
分选速度
分选纯度 分选收获率
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分选速度
1
每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分 选速度至少达5000个/秒左右。
研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生 物及人工合成微球等
3
第一节 流式细胞术的分析及分选原理
液流 系统
光学 系统
流式 细胞仪
光学 原理
光电转 换原理
电子 系统
测试 原理
4
激光
光电 倍增管
放大电路
流式细胞仪是集
多种技术为一体的 新型高科技仪器
激光技术 单克隆抗体技术 细胞荧光化学技术 光电测量技术 电子物理技术 电子计算机技术
1、散射光信号：分为前向散射光（forward scatter，FSC）和侧向散射光（side scatter， SSC）。
散射光不依赖于任何细胞样品的制备技术， 被称为细胞的物理参数，反映的是细胞的大小 的内部结构。
2、荧光信号
27
前向散射光检测器
医学免疫学检验-流式细胞PPT课件
多为氩离子气体激光（488nm）， 用圆柱形透镜聚焦成高15um、宽 57um椭圆形光斑——检测区。长轴垂 直细胞流和激光束中心轴，短轴与细 胞轴一致并重叠。 保证每一细胞受到 一致的光照。单细胞照明技术。
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（三）细胞信号检测与分析和处理系统
细胞产生散射光和荧光信号360度发 射。分光镜和滤光片将不同波长的光 分开，光电倍增管及电子线路接收并 转化为电信号，模数转化器量化为数 字信号由计算机采集、分析、显示和 存储。单细胞检测技术。
第二十二章 流式细胞仪分析技术及
应用
第一课件网网站
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流式细胞术
(Flow Cytometry, FCM)
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第一节 流式细胞仪的原理 Principle of Flow Cytometer
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台式流式细胞仪
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台式流式细胞仪
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台式流式细胞仪
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落地式流式细胞仪
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一、工作原理
（一） 液流系统
细胞样品和包裹在外的鞘液， 保证细胞逐个以相同的速度、相同 的轨迹检测区。单细胞流技术。
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（二）激发光与光速成形系统
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演讲完毕，谢谢观看！
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《流式细胞仪》幻灯片PPT
这些荧光信号的强度代表了所测细胞膜外表抗原的强度或其核内物质的 浓度，经光电倍增管接收后可转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续 的电信号转换为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信 号进展计算机处理，将分析结果显示在计算机屏幕上，液可以打印出来， 还可以数据文件的形式存储在硬盘上以备日后的查询或进一步分析。
电子系统负责光电转换和数据处理
1 散射光信号
侧向角散射光 〔SSC〕 Side Scatter：细胞粒度及细胞内相对复杂性
激
前向角散射光〔FSC〕
发 光
Forward Scatter：细胞相对大小及其外表积
光散射分析：从非均一的细胞群体中鉴别出某些亚群
流式细胞仪的信号分析
外周全血细胞散射光双参数点图 〔红细胞溶解后〕
新型流式细胞仪，特点：随着激光技术的
二、流式细胞仪的构造组成
Principles of Flow Cytometric analysis
➢ 液流系统 ➢ 光学系统 ➢ 电子系统 ➢ 分选系统
三、流式细胞仪的根本构造
液 流 系 统
液流系统的作用是依次传送待测样本中的细胞到激光照射区，其理想状态是 把细胞传送到激光束的中心。而且在特定时间内，应该只有一个细胞或粒子 通过激光束。
根据散射光信号 从人白细胞中鉴别出不同亚群：
白细胞
淋巴细胞 单核细胞 粒细胞
流式细胞仪的信号分析
2荧光信号
利用荧光标记的特异性单克隆抗体，做单/多色分析： 检测多种细胞外表标志，定量细胞抗原表达、细胞因子水平 为PCR、FISH 等分子技术分选出纯度高的特异细胞群
流式细胞仪的信号分析
荧光信号的分析
流式仪器一览
流式细胞仪一览
流式细胞仪分析技术应用ppt课件
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荧光抗体的选择
种属来源：人 •正常造血干细胞分选标记：Lin-CD34+CD38CD45RA-CD90+CD49f+Rholow •白血病干细胞的分选标记：CD34+CD38-CD71CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+ 种属来源：鼠 •F正lk2常- 或造者血干Li细n-S胞ca分-1选+c-标Ki记t+C: LDi1n5-S0c+aC-D1+4c8--Kit+CD34•SMcaL-1L--cA-KFi9t+ACMDL1白6/3血2+病CD干3细4+胞或的c-分K选it+G标r-记1-: Lin•BCR-ABL CML 白血病干细胞的分选标记: LinSca-1+c-Kit+
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
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第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
8
一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
6
（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
荧光抗体的选择
种属来源：人 •正常造血干细胞分选标记：Lin-CD34+CD38CD45RA-CD90+CD49f+Rholow •白血病干细胞的分选标记：CD34+CD38-CD71CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+ 种属来源：鼠 •F正lk2常- 或造者血干Li细n-S胞ca分-1选+c-标Ki记t+C: LDi1n5-S0c+aC-D1+4c8--Kit+CD34•SMcaL-1L--cA-KFi9t+ACMDL1白6/3血2+病CD干3细4+胞或的c-分K选it+G标r-记1-: Lin•BCR-ABL CML 白血病干细胞的分选标记: LinSca-1+c-Kit+
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
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第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
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一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
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（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
流式细胞仪原理ppt课件
300 nm 400 nm
500 nm
600 nm
700 nm
Excitation Emisson
流式细胞仪的组成
仪器硬件组成 计算机硬件系统 软件系统 应用
大型机——FACSVantage SE
多激光多波长 八荧光参数 高速分选 单细胞点对点分选
台式机——FACSCalibur
双激光 488nm 635nm
鞘液、洗液、PMA等：清洁无颗粒杂质
单细胞悬液的处理
荧光标记抗体的染色：使用特异的单克隆抗体
单色分析：直接标记、间接标记 双色分析：SimulSET IMK、HLA-B27 多色分析：TriTEST、MultiTEST、ProCOUNT
溶血：FACS Lysing Solution 细胞打孔：FACS Perm2 固定：1%多聚甲醛
荧光素吸收激光能量 荧光素将吸收能量释放，转换为
振动能和热能 释放较入射光波长更长的光量子
荧光素与特异抗体结合 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信
号越强
荧光信号
FALS Sensor
Freq
Fluorescence detector (PMT3, PMT4 etc.)
Fluorescence
流式细胞仪的电子系统
进行信号检测和分析 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时,
受到激发, 产生不同波长的、代表细胞内不同物 质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号， 可分析电压脉冲的高度、面积和宽度 电脉冲信号经A/D转换成数字信号 数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析
荧光信号
激发光源与荧光标记物
流式细胞术样本来源
细胞悬液：
分离PBMC、PRP等：操作复杂，分离、离心步骤导 致细胞特定群体丢失，并可能引入某些误差
流式细胞仪培训ppt课件
慢性活动性肝 炎、肝硬化
肿瘤
降低
降低 降低
正常或 增高 增高
降低 降低 降低 降低
.
用荧光标记抗体
抗体特异性地结合细 胞上对应的抗原
表达该抗原的细胞被 标记上荧光； 抗原表达多的细胞荧 光强度强
.
阳性细胞百分 比或浓度
靶蛋白浓度
淋巴细胞CD抗原的流式细胞检测
收集透镜
光信号收集
3
带通滤波片 光电倍增管
.
光信号
FSC SSC FL1 FL2 FL3
数据处理
电信号
对数 线性 线性 线性 对数
脉冲处理，模数转换 （面积，峰高，宽度）
记录数据，显示结果
.
流式细胞仪产生的信号 非荧光信号
颗粒度
细胞大小
.
荧光信号
FL1 – FITC,GFP…(PMT2) FL2 – PE (PMT3) FL3 – ECD,PI… (PMT4) FL4 – PC5,APC… (PMT5)
633nm空冷激光： APC、APC-CY7 、CY5
90-4水冷激光：UV（333-364nm） HOECHST 33342、DAPI …
.
三、流式细胞仪应用
.
流式细胞仪应用
Ø 淋巴细胞免疫功能测定 Ø 干细胞研究 Ø 细胞增殖与凋亡检测 Ø 细胞周期及倍体分析 Ø 细胞活性分析 Ø 细胞分选 Ø ……
Focused laser beam
流 动 室
.
流式细胞仪光路图
620BP FL3 (ECD)
575BP FL2 (PE)
525BP FL1 (FITC)
Air-cooled Argon Ion Laser
相关主题
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荧光信号 激光束
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流动室
Flow Cell
孔径50-200m 检测区离喷口200m 有分选功能
Laser
8
9
液流驱动系统（示意图）
流速与压力的关系服从Bernoulli方程，即 P=(1/2)V2 (忽略高度的变化)。改变气压,就可获得不同的流速。
10
2、光学系统
激光、透镜组、光电倍增管等。 PM4 T
43
1 、点图
纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量 参数,在图中每一个点代表一个细胞
44ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
双参数点图
45
双参数点图
46
2 、二维等高图
用等高线来表示细胞数，在一条等高线上细胞数相 同，不同的等高线上细胞数不同。
47
3 、假三维等高图
纵轴与横轴分别代表被测细胞的两个测量参 数,Z轴为细胞数。
48
12
球透镜和柱面透镜 ：
光 束
20×200m 椭圆形光，短轴和细胞流平行，长 长轴与细胞流垂直。
成
形
与
细
胞
受
照
方
式
13
光 束
这种椭圆形光斑的
成
检测区保证每个细
形
胞分别受到光照
与
且受检时受到一致
细
激发光焦斑 的光照 FCM的
胞 受
单细胞照明技术.
照
方
式
14
（二） 基本工作原理
15
单细胞流：流动室
来显示，横轴为该参数测量强度相对值，单位是 道数。强度分布可以是线性的，也可以是对数的。 纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。
38
X轴表示绿荧光信号(CD3)强弱,Y轴则反应细胞的数量.
39
40
41
42
(二)双参数数据的显示
Two-Parameter Data Displays
细胞双参数测定不仅能提供二个参数各自与细 胞数量的关系，更重要的是获得了这二个参数之间 的相关关系，其中包含了更多的生物学信息。双参 数数据显示最常用的是二维的散点图( Dot Plot )。 在二维图上，横轴代表第一个测量参数，纵轴代表 第二个测量参数。
(三) 三参数直方图
三维坐标匀为参数（散射光或荧光）而 非细胞数。
49
（四）流式细胞仪的多参数分析
Laser
FALS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
20
90 Degree Light Scatter
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
细胞对光的散色现象与细胞样品制备无关.
21
前向散色光FSC
22
侧向散色光SSC
23
散射光的测定
利用前向角和 测向角散射光可 以把外周血白细 胞分成三群，淋 巴细胞、单核 细胞和粒细胞。
（一）分选的基本原理
488 nm laser
- Charged Plates
FALS Sensor Fluorescence detector
+
Single cells sorted into test tubes
31
阴 性 选 择
32
阳 性 选 择
磁 珠 分 离
MACS-Magnetic Cell Sorting
24
三 荧光测量
荧光检测器检测特定荧光的特定发射波长 （一）光信号测量
线性放大器
对数放大器
25
Common 350
457 488 514
Laser
300 nm 400 nm 500 nm
Lines
610 632
600 nm 700 nm
PE-TR Conj.
Texas Red
PI
Ethidium PE
（二）分选的技术要求
1 、分选速度：几千个细胞/秒 2 、分选纯度:99.5%左右 3 、分选收获率:90-95% 4 、分选得率
33
分选纯度 是指分离后的样品中该亚群细胞
所占的百分比。
分选收获率 是指分离后所得的细胞亚群数占原
细胞样品中该亚群细胞数的百分比。
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数据的显示和分析
一、参数
4
流式细胞仪的分析及分选原理 一 工作原理： FCM是一种在计算机技术支持下的高度
自动化的细胞显微荧光脉冲分光光度仪。
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(一） 基本组成结构
1、液流系统 样品流和鞘流 2、光学系统 激光、透镜组、
光电倍增管等。 3、数据处理系统
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1样、品液流流和系鞘统流
Injector Tip
Sheath fluid
FITC
cis-Parinaric acid
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Excitation
300 nm 400 nm
500 nm
Emisson
600 nm
700 nm
DNA
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（ 二 ） 荧 光 补 偿
利用电子技术或计算机软件等方法将串入相邻 荧光通道的信号加以扣除的技术称“荧光补偿”
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偿荧 光 补
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四 细胞分选原理
前向散射光FS: 反映颗粒的大小 侧向散射光SS: 细胞内部结构复杂程度 荧光FL: 细胞被染上荧光部分数量的多少
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二、数据的显示方式
（一） 单参数直方图显示 （二） 双参数显示 （三） 三参数显示
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(一) 单参数直方图的显示
Single-Parameter Histogram Displays 以分布直方图( distribution histogram )
Flow cell
Dichroic Filters
PMT
3
PMT
1
PMT
2
Bandpass Filters
Laser
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E1 hv
E1
hv
hv
E1
hv hv
E0 吸收
E0 自发辐射
E0 受激辐射
当物质受到强烈激励,使某一能级的粒子数大量积聚, 发生粒子数反分布.如有光束入射,入射光子与粒子发生 完全弹性碰撞,使粒子从激发态跃迁到基态同时发生一 个光子.光子的能量与入射光子能量相同,有一致的方向 和恒定的位相关系,这种发射称受激发射.
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单细胞照明：激光
488 nm laser
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单细胞检测：信号处理
488 nm laser
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二 散射光的测定
（一）前向散射光 (foword scatter)：FSC 信号的强弱与细胞的大小相关
（二）侧向散射光（side scatter)：SSC 信号的强弱与细胞内的颗粒多少相关
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Forward Angle Light Scatter
流式细胞仪
丁磊 副教授
1
流式细胞术(FCM)定义:
FCM是以流式细胞仪为检测手段的一项 能快速、精确的对单个细胞理化特性进行
多参数定量分析和分选的技术。
Laser
FALS Sensor
2
特点:
单细胞的流动的 活细胞的 定量的 多参数的 高统计学精度的 分选细胞
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一、 流式细胞仪的分析及分选原理 二、 数据的显示与分析 三、 流式细胞仪分析的技术要求 四、 流式细胞术应用