免疫组化操作步骤

免疫组化步骤

免疫组化操作方法一、脱蜡1. 将组织切片至于玻片加上，65°C烘箱烘烤2-4小时，是石蜡完全熔融。

2. 将烘烤充分的切片迅速置入二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第二缸二甲苯中，浸泡10min；取出切片沥干，置入第三缸二甲苯中，浸泡10min。

3. 从二甲苯中取出切片，尽量沥干二甲苯，置入无水乙醇中，浸泡3min；取出，置入第二缸无水乙醇中，浸泡3min；取出切片，再依次置入90%、80%、70%酒精中梯度水化，各浸泡3min。

（切片脱蜡复水目前仪器自动完成）4.，PBS冲洗2-3次，每次3-5min，3% H2O2室温孵育20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

二、抗原修复（以EDTA(PH 8.0/9.0)为例，常用的还有枸橼酸)1. 用流水冲洗切片1-2min，洗净切片表面的酒精；取出切片，用蒸馏水润洗切片表面2-3次，每次3-5min。

2. 将切片置入已经在电饭煲（沸水浴）中预热充分的EDTA中，持续水浴煮沸20min，再将电饭煲切换至保温档保温10min。

（实际操作：微波炉高火8min*2）3. 取出修复盒，使其自然冷却至室温。

三、封闭1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的EDTA 3次，每次3min。

2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。

3. 将切片从玻片架上取出，用手甩去玻片上PBS缓冲液，并用吸水纸吸取组织外围的缓冲液（注意擦拭方式，以防抹掉玻片上的组织）。

4. 将切片置于湿盒上，滴加5%的BSA，37°C培养箱孵育30-40min（或4°C冰箱孵育过夜）。

四、一抗孵育1. 取出切片，将切片至于玻片架上，用蒸馏水润洗表面的BSA 3次，每次3min。

2. 用PH7.2的PBS缓冲液浸泡组织3次，每次3-5min。

（大多数时候步骤1. 2 不做，可直接擦拭干净BSA 滴加稀释好的一抗）3. 按照一定的稀释比例，用抗体稀释液稀释抗体。

免疫组化的操作流程

免疫组化的操作流程免疫组化是一种在细胞或组织中检测特定抗原或抗体的方法。

免疫组化广泛应用于医学诊断、生命科学研究和药物研发等领域。

下面是免疫组化的操作流程。

1.样本处理：首先，需要准备待检测的样本。

样本可以是组织片、细胞悬液或液体样本（如血清或尿液）。

对于组织样本，通常需要固定、切片和脱水等处理步骤，以保持细胞和组织的结构和形态。

2.抗原修复：组织样本中的抗原通常会在固定处理过程中被破坏或失活。

为了恢复抗原的免疫反应性，需要进行抗原修复步骤。

常用的抗原修复方法包括加热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复。

3.抗原检测：制备好的样本可以用于检测抗原。

抗原检测通常通过选择与目标抗原特异性结合的一组试剂，如特异性抗体或亲和素。

这些试剂将与待检测样本发生特异性结合，从而形成特定的抗原-抗体结合物。

4.一次抗体结合：首先，将样本与一次抗体结合。

一次抗体是与目标抗原结合的特异性抗体。

待检测样本与一次抗体一起孵育，使其与目标抗原发生特异性结合。

5.洗涤：为了去除未结合的一次抗体和其他非特异性结合物，需要进行洗涤步骤。

洗涤可以用缓冲液溶液进行多次重复，以确保样本的纯净性。

6.二次抗体结合：接下来，需要将与检测物发生特异性结合的二次抗体与样本反应。

二次抗体是与一次抗体特异性结合的抗体。

这些二次抗体通常与标记物结合，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等。

7.洗涤：与一次抗体结合后，需要再次进行洗涤步骤，以去除未结合的二次抗体和其他非特异性结合物。

8.标记物探测：二次抗体中的标记物将通过检测技术进行可视化。

最常用的检测技术是酶联免疫吸附实验（ELISA），其中酶标记物与底物反应产生可见的颜色变化。

其他常用的标记物包括荧光染料、生物素-链霉亲和素等。

9.观察和分析：最后，需要使用光学显微镜或显微镜等工具观察标记物，并进行结果分析。

可以根据标记物的位置、数量和强度等进行定量和定性的分析。

总之，免疫组化操作流程包括样本处理、抗原修复、抗原检测、一次抗体结合、洗涤、二次抗体结合、洗涤、标记物探测和观察分析等步骤。

免疫组化操作步骤(自编)

免疫组化操作步骤一免疫组化( LP 法)操作步骤：1．切片常规脱蜡至水。

如需抗原修复，可在此步后进行2。

缓冲液洗 3min/2 次。

3. 为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在 Hydrogen Peroxide Block 中孵育 10-15 分钟.4。

缓冲液洗 5min/2 次。

5。

滴加 Ultra V Block ，在室温下孵育 5 分钟以封闭非特异性的背景染色。

(注：孵育不要超过 10 分钟,否则会导致特异性染色降低。

如果一抗的稀释液中含有 5 － 10％正常羊血清，这一步可以省略。

）6。

缓冲液洗 5min/2 次.7。

滴加一抗工作液 37 ℃孵育 1 － 2 小时。

（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8. 缓冲液洗 5min/2 次。

9 ．滴加 Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育 20 分钟.10 ．缓冲液洗 5min/2 次。

11 ．滴加 HRP Polymer( 酶标二抗） ,在室温下孵育 30 分钟.（注： HRP Polymer 对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。

）12 ．缓冲液洗 5min/2 次。

13 ．向 1ml DAB Plus Substrate ( 或 AEC Plus Substrate) 中滴加 1-2 滴 DAB Plus Chromogen （或 AEC Plus Chromogen ），混匀后滴加到切片上，孵育 3 － 15 分钟.（具体时间由染色深浅决定。

）14 ．自来水充分冲洗 , 复染，脱水，透明，封片。

二．免疫组化（三步法 ) 操作步骤：（ 1 ）、石蜡切片脱蜡至水。

（ 2 ）、 3％H 2 O 2 室温孵育 5—10 分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。

（ 3 ）、蒸馏水冲洗， PBS 浸泡 5 分钟 x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。

（ 4 )、 5-10% 正常山羊血清（ PBS 稀释）封闭，室温孵育 10 分钟,倾去血清，勿洗。

免疫组化基本步骤

免疫组化基本步骤
免疫组化是一种在组织中检测特定蛋白质表达的方法，以下是免疫组化的基本步骤：
1. 取得组织样本：从活体或已固定的组织中，取出薄片状的组织样本。

可以使用福尔马林或其他固定剂来固定组织。

2. 去除蜡块：如果组织样本是固定在蜡块中，需要将薄片状的组织样本从蜡块中剥离。

可以使用刮片或其他工具进行此步骤。

3. 抗原恢复：组织样本经过固定处理后，抗原的结构可能会发生变化，影响抗原的免疫反应性。

因此，需要进行抗原恢复步骤。

抗原恢复的方法包括热处理、酶消化、酸碱处理等。

4. 抗体染色：选择适当的一抗体来检测目标抗原。

一抗可以是单克隆抗体或多克隆抗体，并且应该针对目标抗原具有高度的特异性。

一抗可以标记有荧光染料、酶、金标或其他物质。

5. 二抗染色：将与一抗起反应的二抗添加到组织样本中。

二抗可以与一抗结合并形成复合物，用于增强抗原的检测信号。

6. 可视化：根据二抗的标记物不同，可以使用荧光显微镜、酶标仪或其他工具来可视化抗原的表达情况。

荧光染料会发出荧光信号，而酶标记会产生染色反应。

7. 图像分析：对可视化的图像进行分析，可以使用计算机软件自动计算或手动计数标记的细胞或组织区域。

以上是免疫组化的基本步骤，但具体的操作方法可能会根据实验的具体要求而有所不同。

免疫组化操作步骤
免疫组化是一种常用的实验技术，用于检测和鉴定生物样本中的特定分子。

下面我会给出大致的免疫组化操作步骤，供你参考。

1.样本处理：将生物组织或细胞样本获取并处理成合适的形式，如切片或细胞悬液。

2.预处理：对于组织样本，可以使用甲醛等固定剂或冰冻保存。

对于细胞样本，也可以用1%的乙醇醋酸钠或甲醛冷冻保存。

3.抗原结构暴露：对于组织样本，可以使用抗原恢复液如缓冲盐水或热诱导抗原恢复等来暴露抗原结构。

对于细胞样本，可以用洗涤缓冲液洗涤，以去除细胞外蛋白质，并暴露出内部抗原。

4.阻断非特异性结合：使用非特异性结合物（如牛血清白蛋白、大肠杆菌蛋白等）进行阻断，以减少非特异性的背景信号。

5.抗体结合：加入目标抗体，与待测分子特异结合。

6.洗涤：洗涤掉未与抗体结合的废液，减少背景信号。

7.二抗结合：加入辣根过氧化物酶标记的二抗，与目标抗体结合，形成目标抗体-二抗复合物。

8.再次洗涤：冲洗掉未与二抗结合的废液，减少背景信号。

9.底物添加：加入染色底物，辣根过氧化物酶催化产生可见信号。

10.反应停止：停止底物活性，如加入酸性溶液。

11.显微镜观察：将样本放置在玻璃载玻片上，使用显微镜观察并记录结果。

12.图像分析：使用光学显微镜或荧光显微镜等设备获取图像，使用图像分析软件进行定量分析。

需要注意的是，实际操作中会根据具体的实验目的和技术要求进行适当的修改和调整。

免疫组化在科学研究和临床诊断中都有广泛应用，可以用于检测肿瘤标志物、病原体、免疫相关分子等，对于疾病诊断和治疗具有重要意义。

免疫组化操作步骤

免疫组化操作步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。

简化的免疫组化步骤

免疫组化
注意：全程不能干片。

1. 石蜡切片，二甲苯、梯度酒精脱蜡至水。

2. 3% H2O2去离子水室温孵育5-10min，以消除内源性过氧化物酶活性（有人也不消除，刚开始做，建议使用）。

PBS冲洗，5min×3 次。

根据需要选择抗原修复方式及强度。

热修复、酶修复或不修复。

3. 热修复抗原：将切片浸入到EDTA 修复液中，微波炉加热到沸腾后断电（不可持续沸腾），间隔10-15min 再修复1-2 次，冷却至室温。

4. 用PBS过度，擦干周围PBS，滴加5% BSA 封闭液37℃孵育30min，甩干，勿洗。

5. 滴加适当稀释的一抗（稀释参考说明书），37℃孵育2 小时或4℃过夜（过夜效果会更好一些）。

PBS 冲洗，5min×3 次。

6. 擦干周围PBS，滴加生物素标记山羊抗大鼠IgG（二抗），37℃孵育30min。

PBS 冲洗，5min×3 次。

7. 滴加SABC，37℃孵育30min。

PBS 冲洗，5min×3 次。

8. 显色：光镜下控制反应时间。

显色剂可选DAB。

自来水背面充分冲洗。

9. 苏木素复染，染色时间为0.5-2min。

梯度酒精脱水，二甲苯透明。

10. 选用中性树胶封片。

免疫组化超详细步骤

免疫组化超详细步骤免疫组化（immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测组织或细胞中特定蛋白质的方法。

该技术的原理基于抗体与其特异性抗原结合的特性。

下面将详细介绍免疫组化的步骤。

第一步，固定组织：将待检测的组织或细胞固定在载玻片上。

常用的固定剂包括甲醛和乙醛，可通过浸泡、喷洒或滴加等方式施加在组织上，使细胞和蛋白质保持其形态和结构。

第二步，脱水：将固定的组织经过一系列浓度逐渐升高的酒精溶剂中处理，以去除水分，使组织逐渐与酒精混合。

第三步，脱脂：将组织在适当的溶剂（如二甲苯或苯）中脱脂，以去除酒精和脂质。

第四步，石蜡浸渍：将脱脂的组织浸泡在液态石蜡中，使其渗透并替代脱脂剂和二甲苯，然后固化组织。

第五步，切片：使用微tome切割固化的样本，制备出薄片，常见的切片厚度为4-5μm。

第六步，脱离：将切好的薄片与载玻片分离，常用的方法是利用热水浸泡薄片，使其松散分离。

第七步，抗原修复：利用高温和压力的方法，如蒸汽煮沸或压力锅，对薄片上的蛋白质进行解散，以恢复其免疫活性。

第八步，阻断非特异性结合：使用一些蛋白质如牛血清蛋白、动物血清或其他蛋白质来包裹薄片上的非特异性结合位点，以减少假阳性反应。

第九步，抗体处理：将特异性抗体加到薄片上，与待检测的蛋白质结合。

抗体可以是原代抗体（直接与靶蛋白质结合）或二抗（与原代抗体结合）。

第十步，洗涤：用缓冲液洗去未结合的抗体，并去除阻断剂和非特异性结合物。

第十一步，检测：将检测试剂滴加到薄片上，以产生特定色素或荧光信号。

常用的检测方法包括酶标法（如辣根过氧化物酶法，HRP法）和荧光标记（如荧光素酶法，AP法）。

第十二步，显微镜检查：使用显微镜观察薄片上的染色结果，评估标记物的定位和表达情况。

通过上述步骤，免疫组化技术可以帮助研究人员检测并定位组织或细胞中感兴趣的蛋白质。

其广泛应用于生物医学研究、临床诊断以及药物研发等领域，为揭示疾病的分子机制和开发新的治疗手段提供了重要的工具。

免疫组化步骤

免疫组化步骤1、烤片：放于60℃烘箱内，20—25min;2、脱蜡：二甲苯I、II、III，3次，5min/次；注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；3、复水：100%酒精-——100％酒精——-95%酒精--—90%酒精—-—80％酒精--—70％酒精-——50%酒精，5min/次；4、ddH2O洗2次,5min/次；5、抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新MVS—0100），125℃，5min；注:1x修复液:198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x，混匀；抗原修复高压锅的使用：确定垫圈和导热片的放入，加入700ml ddH2O，放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close"对准白点,“open”所指处与边缘无缝隙,设置程序，开始；结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；6、修复结束后冷却至室温（30min），1xPBS洗2次,5min/次；7、去除H202酶：3％H202,15min；注意遮光；注：用1xPBS稀释30% H202至3% H202（如5ml 30% H202+45ml02)50ml 3%H8、PBS 2次，PBST 1次，5min/次;9、封闭(blocking)：先将片子擦干，注意保持组织部分的湿润，再用专用记号笔沿距离组织3mm处画圈，然后加入封闭液，室温1h，湿盒;封闭液不要过多,以免溢出；注：封闭液：1xPBS，0.3％Triton X-100，10% goat serum(如:870ulPBS+30ul 10% Triton X—100+100ulserum 1ml封闭液）;10、孵一抗:用封闭液稀释一抗，不同的抗体稀释的倍数不同，4℃，过夜（有的抗体是室温1h)，湿盒。

对照组加不含抗体的封闭液；注：拿到4℃冰箱时动作延缓慢，小心不要使一抗跑出圈外；加一抗前可以重新画圈，以免一抗外流；常用抗体的稀释比例：GFAP-—1：200，Ki67-—1：200，CD31-—1：20～1：40,Flag——1:200,Nestin——1：200,III-Tubulin——1：100011、室温,30min；(从冰箱拿出时动作也要缓慢）12、PBST洗3次，5min/次；注：PBST：1L 1xPBS+10ml 10％Triton X-1000 ；13、①加荧光标记的二抗(封闭液稀释抗体1:1000），1h,室温，湿盒;②加HRP标记的二抗(封闭液稀释抗体1：10000），室温30min；注：加二抗前可以重新画圈，以防二抗外流；14、PBST洗3次，5min/次；15、若①复染:DAPI染色,避光，5min;若②TSA放大3～10min，PBST洗3次，5min/次，再复染DAPI；注:DAPI:50uM DAPI用1xPBS稀释1000倍16、封片:直接向组织滴加抗荧光淬灭剂,注意不要产生气泡，盖盖玻片时也要注意不要产生气泡，避光4～5min后即可拍片。

免疫组化法实验操作步骤

免疫组化法实验操作步骤步骤一：取材固定1.将需要处理的组织或细胞样本，如切片或离心沉淀等，放置在含有适当浓度的固定试剂（如4%的中性缓冲甲醛）中，使其固定。

2.这一步的目的是保持蛋白质的结构和形态，使其对后续步骤的抗体反应更加稳定。

步骤二：脱水和包埋1.将样本从固定试剂中洗涤，并逐渐转移到乙醇溶液中，以脱水。

2.将样本转移到适当浓度的透明剂（如甲基丙烯酸甲酯）中，使其透明化。

3.最后，将样本包埋在合适的固化剂（如尼龙、蜡、树脂等）中，以便后续的切片操作。

步骤三：切片和烘干1.使用组织切片机将样本以适当的厚度切成切片。

2.将切片放置在加热平台上，烘干以去除切片中的水分。

步骤四：抗体处理1.使用适当的抗体稀释液将抗体与切片接触。

抗体可为一抗或二抗，具体选择取决于实验需求。

2.将切片放置在含有抗体的湿润孵育盒中，使其与抗体反应。

孵育温度和时间取决于抗体的要求，一般在4℃下孵育过夜。

步骤五：洗涤1.将切片取出，并置于洗涤缓冲液中，用于去除未结合的抗体。

2.反复洗涤3-4次，每次至少5分钟，确保切片完全清洗。

步骤六：标记1.添加适当浓度的二抗，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，与已经结合的一抗反应。

2.孵育切片与二抗共反应，孵育温度和时间根据试剂的要求进行。

步骤七：显色和染色1.使用合适的显色剂将切片进行显色。

常见的显色剂有DAB（二氨基联苯氧化物）和VIP（有机磷染料）等。

2.彩色染色可根据实验需求进行，可以使用核染料如伊红、快速伊红等对细胞核进行染色。

步骤八：石蜡去除和封片1.将切片浸入去石蜡溶液中，去除石蜡。

2.使用适当稀释的巴豆胶溶液将切片封闭，确保切片在显微镜下观察时保持湿润。

步骤九：显微镜观察1.将封片放置在显微镜载物台上，使用适当放大倍率的显微镜观察切片。

2.观察切片的染色情况、抗体标记的结果等，记录并进行分析。

这些是一般的免疫组化法实验操作步骤，根据具体实验需求和试剂要求，可能会有一些细微的差异和额外的步骤。

免疫组化超详细步骤

免疫组化超详细步骤免疫组化是一种常用的实验方法，用于检测细胞或者组织中特定的分子，如蛋白质、核酸和糖等。

下面是免疫组化的详细步骤：1.样本准备：a.细胞或组织准备：首先需要获取细胞或组织样本，可以通过培养细胞或直接取得组织切片。

b.保存和处理：细胞或组织样本需要保存在合适的液体中，如福尔马林或液氮，以保证样本的完整性和保存时间。

c.切片：对于组织样本，需要将其切割成薄片，常用的方法是冰冻切片或石蜡包埋切片。

2.抗原的暴露：a.反应原位：对于固定的细胞或组织样本，可以直接进行免疫组化实验。

b.透化处理：对于未固定的细胞或组织样本，需要进行透化处理，以使抗体能够穿透细胞膜或组织间隙。

3.抗原检测步骤：a.抗原恢复：有时，抗原可能会受到固定或透化处理的损伤，需要进行抗原恢复步骤。

常见的方法有热处理、酶消化和抗体消除等。

b.阻断非特异性结合：为了减少非特异性结合，需要对样本进行阻断处理，可以使用一些蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或鱼胶。

4.抗体标记检测：a.一抗：选择特异对应抗原的一抗（原抗体），将其加入到样本中，与样本中的特定抗原结合。

b.二抗：将含有特异对一抗的二抗（辅助抗体）标记的溶液加入到样本中，与一抗结合。

二抗通常会与荧光染料、酶或金颗粒等标记结合。

5.洗涤：a.用缓冲液洗涤样本，以去除未结合的抗体和其他非特异性的结合物。

6.反应可视化：a.荧光标记：对于荧光染料标记的样本，可以通过荧光显微镜观察到标记物的信号。

b.酶标记：对于酶标记的样本，需要使用合适的基质使酶产生染色反应，并通过显微镜观察到染色的结果。

7.整理和分析：a.包装：用透明性的封片将样本封装，以便保存并观察。

b.分析：使用显微镜分析样本的结果，例如观察染色的细胞或组织的形态、信号定位等。

免疫组化超详细步骤

免疫组化超详细步骤免疫组化是用抗体识别特定蛋白质来检测组织和细胞中的蛋白质表达。

其可广泛应用于病理学、生理学和生物学等领域中。

下面将详细介绍免疫组化的步骤。

1. 组织处理首先，需要采集样本组织，常见的样本来源包括活体组织、固定组织和石蜡包埋切片。

不同的组织来源需要采用不同的处理方法。

对于新鲜的活体组织，可以通过切片、离心、冷冻等手段进行处理。

而对于已固定的组织，需要进行脱水、清洗、去蜡等前处理步骤。

同时，还需要注意保护蛋白质的完整性，以免影响后续细胞学的表达情况。

2. 抗原修复样本经过前处理后，可能会发生抗原损失或失活现象。

为了提高蛋白质的表达和稳定性，需要进行抗原修复处理。

一般采用的方法包括微波处理、煮沸处理、酶切处理等。

3. 样本烘干对于已经进行过前处理和抗原修复的样本，需要进行烘干处理，以免影响后续染色结果。

常见的方法包括空气干燥、乙醇除水、真空蒸发等。

4. 抗体选择根据实验需求，选择合适的一抗和二抗。

一抗是特异性识别目标抗原的抗体，一般是单克隆或多克隆的小鼠、兔、鸡等动物来源。

二抗是与一抗特异亚型相对应的抗体，主要用于增强信号。

二抗一般来自于不同阳性动物中。

5. 抗体稀释选定好的一抗和二抗，需要进行适当的稀释。

稀释倍数应根据抗体的浓度来控制，以获得最佳的信号与噪声比。

6. 组织切片将已处理好的组织切片成合适的大小，并摆放到载玻片上。

可以选用切片机、剪刀、切片钳等工具进行处理。

7. 抗体染色将稀释好的一抗液滴加到组织切片上，尽量润滑整个切片表面。

然后将切片在湿润的环境中孵育2-6小时，让一抗充分和目标蛋白质结合。

之后，将二抗液滴加到组织切片上，孵育30-60分钟。

通过荧光、酶标记、颜色标记等方式进行检测。

8. 洗涤处理组织切片在染色过程中会出现背景颜色可能会较强，影响实验结果的情况。

为了去除这些杂质，需要对切片进行洗涤处理。

一般采用的方法为不同性质的缓冲液进行多次反复的洗涤处理。

9. 封片组织切片染色完毕后，需要经过封片过程。

免疫组化相关步骤

免疫组化相关步骤免疫组化是一种常用的组织学检测方法，通过使用特异性抗体标记目标蛋白的方法，来检测该蛋白在组织中的存在和分布情况。

以下是免疫组化的一般步骤：第一步：固定组织样本首先，将需要检测的组织样本进行固定处理，通常使用的固定剂是10%中性缓冲福尔马林（neutral buffered formalin，NBF）。

组织固定可以保持细胞和组织的形态结构，防止其在处理过程中的破坏。

第二步：脱水和石蜡浸渍固定后的组织样本需要经过脱水和石蜡浸渍处理，以便能够在切片时保持其形态。

首先使用不同浓度的乙醇进行脱水处理，然后将组织样本置于融化的石蜡中，使其充分浸渍。

脱水和石蜡浸渍的目的是将组织中的水分替换成石蜡，以便在切片时能够获得高质量的组织切片。

第三步：制备组织切片在将组织样本进行脱水和石蜡浸渍后，使用组织切片机将组织样本切成薄片。

通常使用的厚度为4-6微米的切片。

制备组织切片时需要注意保持切片的完整性和减少组织切片之间的花样。

第四步：脱蜡和再脱水经过组织切片制备后，需要进行脱蜡和再脱水处理，以便后续的免疫染色。

脱蜡处理通常使用木油（xylene）或等效溶剂来去除石蜡，并进行再脱水步骤以去除木油。

第五步：抗原修复抗原修复是免疫组化中非常重要的一步。

组织固定和石蜡包埋可以对目标蛋白的抗原性造成一定的损害，抗原修复通过将切片置于酶解剂（如胰蛋白酶）或缓冲盐溶液中加热，修复抗原，使其更易于抗体识别。

第六步：阻断非特异性结合第七步：抗体孵育在进行免疫染色之前，需要将特异性抗体添加到切片上，与目标蛋白结合。

免疫组化可以使用多种抗体，包括一抗（primary antibody）和二抗（secondary antibody）。

一抗是与目标蛋白直接结合的抗体，而二抗则与一抗结合，其本身标记有酶标记物，如辣根过氧化物酶，或荧光标记物。

第八步：信号可视化和显色完成抗体孵育后，需要使用适当的显色试剂将抗体信号可视化。

显色试剂可以是一些酶标颜色反应法，例如使用DAB（3,3'-联氨基苯并噻唑啉-4,5′-二羧酸）进行显色；或者是荧光探测试剂，通过激光共聚焦显微镜或荧光显微镜来观察。

免疫组化步骤范文

免疫组化步骤范文免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种通过使用抗体来检测和定位特定抗原在组织样本中的表达的技术。

它是病理学和分子生物学中非常常用的技术之一，广泛应用于疾病的诊断、治疗和研究。

1.取样和制片：首先从活体组织中取得样品，这可以通过标本切片、穿刺活检或手术切取的方式来获取。

然后，将样本固定在福尔马林等适当稳定固定剂中，以保持组织的形态结构和抗原的完整性。

接下来，将固定的组织块进行脱水和包埋，制作成薄片，以便于后续的染色和分析。

2.抗原恢复：对于一些抗原，固定和包埋过程可能会导致其空间和/或结构性改变，并使其与抗体的结合受到抑制。

因此，在进行染色之前，需要通过抗原恢复步骤来恢复抗原的原始状态。

这通常包括对组织样本进行煮沸处理或酶解等热或化学诱导方法，以打开抗体与抗原结合的位点。

3.抗体染色：在免疫组化中，抗体是关键的组分。

通常，会使用特异性的初级抗体与目标抗原结合。

该初级抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

这些抗体通常是经过酵素、荧光或放射性标记的，以便于可视化抗原的位置和定位。

4.第二抗体标记：在免疫染色中，为了提高信号的强度，需要使用能够与初级抗体结合的第二抗体。

这个第二抗体通常是与荧光物质、酵素或金颗粒等标记物结合的。

这样，在光学或电子显微镜下可以更容易地观察到抗原的位置。

5.可视化：通过对样本进行可视化，可以观察到抗体与抗原的结合情况。

染色的结果可以是可见的颜色、荧光等。

在可见染色中，通常使用染色剂，如二氧化硅染剂、二氮化钼染剂等。

对于荧光标记的样本，可以使用相应的激光或滤光片来观察荧光信号。

最后，在显微镜下观察和记录染色结果。

6.结果分析：在免疫组化结果分析中，需要对染色的结果进行定性和定量的评估。

这可以包括测定抗原的表达强度、局部化和分布等。

可以使用计算机软件和图像分析算法来辅助结果的定量和分析。

总的来说，免疫组化是一种可以检测和定位特定抗原在组织中表达水平的重要技术。

免疫组化操作流程及注意事项

免疫组化操作流程及注意事项免疫组化是一种常用的生物技术方法，在医学、药物研发、疾病诊断等领域有着广泛的应用。

在进行免疫组化实验时，需要遵循一定的操作流程和注意事项，以确保实验结果的准确性和可靠性。

一、实验前准备1.检查仪器和试剂：在进行实验前，需要检查使用的仪器和试剂是否正常工作，以避免实验出现错误。

2.样本处理：选择合适的样本来源，并根据实验要求进行样本处理和处理，如组织切片、蛋白抽提等操作。

3.实验区域准备：为了避免实验中的交叉污染，需要保持实验区域的清洁和干净，避免灰尘、细菌等干扰实验结果。

二、抗体处理1.抗体选择：根据实验需要选择合适的抗体，包括一抗和二抗，并进行正确的防止步骤。

2.抗体稀释：需要根据实验所需稀释抗体浓度，以确保实验中的可靠性和准确性。

3.透析：透析是为了去除抗体中的杂质和保持抗体的活性，可以使用多种透析方法，如葡萄糖、盐溶液透析等。

三、标记和显色1.标记：将选择好的一抗和二抗进行标记，例如利用荧光标记、酵素标记等。

2.显色：根据实验需要，将标记好的抗体显色，可以使用多种方法，如荧光染色、染色素染色、酶标记染色等。

四、防止步骤1.防止非特异性结合：在实验过程中需要使用防止多余的非特异性结合，如使用BSA、牛奶等进行防止。

2.防止地基自身活性：在实验中需要使用防止地基自身活性的方法，如将地基胶体蛋白进行处理。

3.防止非特异性染色：在实验中需要使用防止非特异性染色的方法，如对实验组和对照组进行多次染色。

五、实验数据分析1.图像采集：采用高清数码系统进行图像采集。

2.数据分析：使用统计软件进行实验数据的处理，进行可靠性检测、误差范围的确定、结果的图表化呈现等等。

以上就是免疫组化操作流程及注意事项的一些基本介绍，虽然操作流程较为复杂，但是只有遵循操作流程和注意事项，才能够稳定的获得实验结果并进行进一步的研究分析。

免疫组化步骤及原理

免疫组化步骤及原理免疫组化是一种用于检测和定位特定细胞组织中特定分子的技术。

它可以帮助我们研究细胞的结构和功能，并在疾病诊断和治疗中发挥重要作用。

以下是免疫组化的步骤及其原理。

步骤一：标本固定免疫组化的第一步是将待检测组织样本固定在载玻片或其他固定载物上。

常用的固定剂包括福尔马林（formalin）和牛血清白蛋白（BSA）。

固定的目的是保持组织的形态结构并防止其腐解。

步骤二：脱水和去蜡接下来，固定的组织样本通常需要通过一系列酒精浓度逐渐脱水，然后使用组织蜡进行浸泡固化。

蜡浸泡的目的是保护组织细胞结构，并便于切片及后续的免疫标记。

步骤三：抗原暴露在进行免疫组化之前，需要通过抗原暴露步骤使组织样本中的目标分子或抗原暴露出来，便于其和抗体的结合。

这可以通过热处理（如加热松弛），酶解（如胰蛋白酶消化）或抗原修复剂（如热带缓冲液或消化酶）进行。

步骤四：非特异性结合位点的阻断为了阻断非特异性结合位点，需要在进行免疫反应之前进行非特异性抗体预处理。

这可以通过与蛋白质或动物血清结合的非免疫球蛋白（如Bovine Serum Albumin，BSA）或鱼胶（Fish Gelatin）来实现。

这样，可以降低背景信号并提高特异性。

步骤五：抗体结合在免疫组化过程中，使用特异性抗体与待检测的目标分子结合形成免疫复合物。

这些抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。

单克隆抗体是由同一B细胞产生的一类抗体，具有高度特异性，并且可以与特定的抗原结合。

多克隆抗体则由多个B细胞产生，可以结合目标分子的多个表位。

步骤六：荧光或酶标记的二抗结合为了检测抗体和目标分子的结合，可以使用荧光染料或酶标记的二抗。

荧光染料（如FITC，Cy3，Cy5等）可以在荧光显微镜下观察到相应的光信号。

酶标记的二抗通常使用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）来标记，这些酶可以催化或参与染色反应，并在光镜下呈现颜色。

步骤七：显色和观察显色的方法根据使用的标记物不同而有所不同。

免疫组化实验具体步骤及说明

免疫组化实验具体步骤及说明免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种用于检测组织部分或特定分子的表达、定位和定量的技术。

它基于抗原抗体相互作用的原理，通过特异性的抗体与目标分子结合形成复合物，再通过染色反应显示出目标分子的位置和数量。

IHC广泛应用于癌症诊断、疾病研究和药物开发等领域。

以下是免疫组化实验的具体步骤及说明：1.标本制备：首先，取得切片的组织标本，通常是经过固定和包埋的组织。

然后，将组织切片取下玻片，用去离子水处理。

最后，将切片分别置于乙醇溶液中进行脱水，再用苯酚或其他抗氧化剂处理，以保护切片的蛋白质结构。

2.去蜡：将切片置于细胞清洗液中，用搅拌器在室温下搅拌，去除蜡层。

然后，分别使用乙醇降级脱水和再次用去离子水处理，以去除残留的蜡。

3.抗原检出：使用特定的抗体来检测目标分子。

首先，在切片中添加抗原修复溶液，进行退火和抗原修复，以恢复抗原的免疫原性。

然后，用PBS洗涤切片，去除剩余的抗原修复液，并将切片与蛋白质阻断剂孵育，以防止非特异性结合。

最后，将切片与特异性的初级抗体孵育，以形成抗原-抗体复合物。

4.特异性结合检测：添加特异性的二级抗体，如辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗鼠IgG，与初级抗体特异性结合。

此外，还可以使用荧光标记的二级抗体，以便通过显微镜直接检测目标蛋白质的荧光信号。

完成二级抗体与抗原复合物的结合后，用PBS洗涤切片。

5.信号放大与检测：对于HRP标记的二级抗体，使用辣根过氧化物酶底物，如DAB（二氨基苯类胺）或TMB（3,3',5,5'-四甲基联苯胺）。

这些底物在酶作用下会形成可见的棕色沉积物。

对于荧光标记的二级抗体，在显微镜下直接检测荧光信号。

6.染色和显微镜观察：将切片用PBS洗涤，然后用余晖蓝染色溶液浸泡，以增强显微镜下观察的对比度。

最后，用水轻轻冲洗切片，除去多余的染色剂。

用显微镜观察切片，评估目标蛋白质的表达和定位。

免疫组化实验步骤及配方

免疫组化实验步骤及配方免疫组化实验是一种用于检测和定位特定蛋白质在细胞、组织或器官中表达的技术。

免疫组化实验包括一系列步骤，如抗原修复、非特异性结合抑制、免疫原和次级抗体处理、显色/荧光染色等。

下面将详细介绍免疫组化实验的步骤及配方。

1.抗原修复：抗原修复是为了恢复因组织固定而引起的抗原性损失。

一般使用高温或酶解方法进行抗原修复。

-高温方法：将组织切片置于高温缓冲液中加热，一般在95°C下加热15-20分钟。

-酶解方法：如胰酶消化、蛋白酶消化等。

例如，可以使用0.1%胰酶在37°C下进行酶解。

2.非特异性结合抑制：非特异性结合抑制是为了防止免疫试剂（如次级抗体）与非特异性蛋白结合，从而降低假阳性结果。

一般使用正常动物血清或胶体等进行非特异性结合抑制。

-正常动物血清：根据动物源种类（如小鼠、兔子等）选择相应的正常动物血清。

-胶体：如牛血清蛋白、牛血清白蛋白等。

可以在最终稀释液中加入1-2%的胶体。

3.免疫原处理：免疫原处理是为了增强目标抗原与抗体的结合效率，一般通过与次级抗体或酵素结合。

根据具体实验需求，可以选择荧光标记、酶标记或金标记等不同的方式进行免疫原处理。

-荧光标记：如荧光素等。

-酶标记：如辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。

-金标记：如胶体金、纳米金等。

4.次级抗体处理：次级抗体处理是为了增强免疫原与目标抗原之间的结合效应。

一般使用来自其他物种的抗体作为次级抗体。

根据不同实验需求，可以选择与荧光标记、酶标记或金标记结合的次级抗体。

-荧光标记：如青蒿素标记的抗兔荧光标记抗体等。

-酶标记：如HRP标记抗体、AP标记抗体等。

-金标记：如碳标记抗体、金标记抗体等。

5.显色/荧光染色：显色/荧光染色是为了可视化目标抗原的分布和定位。

根据不同的免疫标记试剂，可以选择适当的染色方法。

-显色：如DAB（3,3'-二氨基联苯）染色。

-荧光染色：根据使用的荧光标记试剂选择相应的染色方法，如DAPI 染色、FITC染色等。