一株产内切菊粉酶菌株培养条件的响应面优化_苟亚峰_王丹_孙丹_张岩_葛娟_高剑峰

1.5 数据处理 单因素实验数据采用 excel2003 进行处理；Plackett-Burman 实验设计与内切菊粉酶酶活 数据分析，采用 Design-Expert 软件进行方差分析，建立回归方程；采用 Design-Expert 软件对 Central Composite Design 实验内切菊粉酶酶活数据进行方差分析及多元回归拟合。
表 1 Plackett-Burman 实验因子水平及编码 Table 1 Factors and levels in Plackett-Burman design 变量 X1 X2 X3 X5 X6 X7 X9 X10 X4，X8，X11 因素 菊粉（g/L） pH 酵母膏（g/L） 发酵时间（h） 蛋白胨（g/L） 发酵温度（℃） 装液量（mL） 接种量（%） 虚拟变量 低水平（-1） 40.0 5.5 5.0 48 10.0 27 40 4 -1 高水平（1） 60.0 7.5 7.5 72 15.0 29 60 6 1
1.4.3 最陡爬坡实验 根据 PB 实验分析结果确定最陡爬坡实验爬坡方向和步长，按一定的梯 度增加菊粉和蛋白胨在培养基中的浓度，并按一定的梯度减少装液量，其余 5 个因素均取初 始浓度，检测最终发酵液中内切菊粉酶酶活，从而确定菊粉、蛋白胨浓度和装液量三个因素 的最适浓度范围。 1.4.4 Central Composite Design 实验设计 Central Composite Design 实验设计适用于 2~5 个因 素的优化实验。 以 PB 实验筛选得到的对最终发酵液中内切菊粉酶酶活影响显著的因素作为设 计因素，以最陡爬坡实验得出的浓度作为中心点，以内切菊粉酶酶活为响应值，通过响应面 分析对产酶条件进行优化。实验因素与水平设计如表 2 所示。
于从众多考察因素中快速有效地筛选出最重要的几个因素，试图用最少实验次数达到使因素 的主效应得到尽可能精确的估计。对于 N 次实验至多可研究(N-1)个因素，其中(N-4)个实际因 素，3 个虚拟变量用以误差估计[23]。 选用 N=12 的 Plackett-Burman 实验设计，对菊粉浓度、初始 pH 值、蛋白胨浓度、酵母膏 浓度、发酵时间、发酵温度、装液量和接种量 8 个影响内切菊粉酶活力的相关因素进行实验 研究。每个因素取两个水平：低水平“-1”和高水平“1” ， “1”为“-1”的 1.25~1.5 倍，一般 实验均选取 1.5 倍，另设三个空白项对应表中的 X4、X8 和 X11，用以考察实验误差。响应值为 内切菊粉酶酶活。自变量、编码和水平因素见表 1。
表 2 Central Composite Design 实验因素水平及编码 Table 2 Factors and levels in Central Composite Design 水平 因素 -1.68 A 菊粉（g/L） B 蛋白胨（g/L） C 装液量（mL） 53.2 9.9 33.18 -1 60.0 15.0 40 0 70.0 22.5 50 1 80.0 30.0 60 1.68 86.8 35.1 66.82
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将复筛得到的菌株按 5%( 体积分数 ) 接种量接入装量 50mL 发酵培养基的
250mL 的三角瓶中，28℃，180r/min 摇床培养 60h 后，12000r/min、4℃离心 10min 取上清液
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一株产内切菊粉酶菌株培养条件的响应面优化
苟亚峰，王丹，孙丹，张岩，葛娟，高剑峰 （石河子大学生命科学学院 新疆 石河子 832000） 摘 要：从新疆石河子盐碱地菊芋生长根际土壤中，分离筛选得到 10 株具有内切菊粉酶活力 的菌株，复筛得到 1 株高产内切菊粉酶活力菌株，将其命名为 G-60。在单因素实验的基础上， 采用 Plackett-Burman 实验法对 8 个因素进行了显著因素的筛选，结果表明，菊粉浓度、蛋白 胨浓度和装液量对内切菊粉酶酶活影响显著；通过最陡爬坡实验及 Central Composite Design 设计进一步优化，得到最佳发酵产酶条件为：菊粉浓度 66.5g/L、蛋白胨浓度 29.1g/L、装液量 49.38mL，内切菊粉酶活力达 24.62U/mL，与优化前相比提高了 1.55 倍。 关键词：菌株 G-60，内切菊粉酶，响应面法
收稿日期：2013-02-24

通讯作者
作者简介：苟亚峰（1986-） ，男，硕士研究生，研究方向：可再生能源。 基金项目：生物反应器工程国家重点实验室 2011 年度开放课题基金项目(SKLBE-KF-019)
2l 世纪重要的课题，随着人们生活水平的提高，保健食品的需求量日益增加，这将为功能性 低聚糖的研究和开发创造良好的机遇 [12]，同时又为农副产品等自然资源的综合利用提供了一 个很好的发展途径，前景十分广阔[4-5]。 本实验从新疆石河子盐碱地菊芋生长的根际土壤中经过初筛、分离纯化和复筛后得到 1 株具有高产内切菊粉酶活力的菌株(G-60)，在单因素实验基础上，采用 PB 实验设计方法考察 8 个发酵因素，筛选得出 3 个关键因素，再利用最陡爬坡实验及 Central Composite Design 响应 面设计[13-17]确定主要影响因素的最佳浓度，以提高内切菊粉酶酶活。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 菊粉 西安斯诺特生物技术有限公司；菌株选育培养基：初筛培养基（菊粉 40.0g/L，蛋 白胨 10.0g/L，Na2HPO4 10.0g/L，NH4Cl 20.0g/L 琼脂 15.0g/L，初始 pH7.2） 、发酵培养基（菊 粉 40.0g/L，酵母膏 7.0g/L，蛋白胨 10.0g/L，Na2HPO4 10.0g/L，NH4Cl 20.0g/L） 、PDA 培养基 （马铃薯（去皮，切碎）200.0g/L，葡萄糖 20.0g/L，琼脂 20.0g/L，pH 值自然[18]） 、斜面培养 基（查氏培养基[19]） 。 以上培养基在配置完成后，均需 121℃高压灭菌 20min；3,5-二硝基水 杨酸等所有试剂及药品均为分析纯。 HANNA pH211 型 PH 计 器厂；SPX-80 生化培养箱 医疗器械仪器厂。 1.2 产内切菊粉酶菌株的筛选 从新疆石河子盐碱地菊芋生长的根际土壤中分组取土壤置于无菌水中， 180r/min 摇床振荡 分散。取样液 1mL 按 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 稀释后，涂布于初筛选培养基，28℃ 培养 3~5d。挑取单菌落，平板划线方法纯化培养，移入斜面保藏。 将纯化后菌种接种于 PDA 培养基上培养 5~7d， 待孢子成熟后刮取适量孢子与无菌水制成 孢子悬液。250mL 三角瓶中发酵培养基装量 50mL，加入上述孢子悬液 1mL，28℃，180r/min 振荡培养 3~5d，然后进行复筛。 1.3 内切菊粉酶活力测定 1.3.1 酶液制备 即为酶液。 1.3.2 内切酶酶活测定方法 采用 3,5-二硝基水杨酸法 （DNS 比色法） ： 取 1mL 酶液， 加入 4mL 1.5%的菊粉溶液（pH 值为 5.0，0.lmol/L 醋酸缓冲液配制） ，55℃水浴中保温 10min。取反应 液 0.5mL 加入 0.5mL DNS 混匀，沸水浴反应 5min，迅速冷却并稀释至 5mL(在完全相同的条 件下以灭活的酶液作为对照)，在波长 540nm 处测定其吸光度值，根据葡萄糖标准曲线计算样 品中还原糖含量[20-22]。 菊粉酶活力单位定义：在上述条件下，每分钟生成 1μmol 还原糖所需的酶量为一个酶活 单位（U） 。 1.4 实验设计 1.4.1 单因素实验设计 分别以菊粉、蛋白胨浓度、初始 pH 和装液量为单因素进行实验，根据 实验结果确定 Plackett-Burman 实验设计变量范围。 1.4.2 Plackett-Burman 实验设计 Plackett-Burman 设计法是一种两水平的实验设计方法，适用
Optimize medium components for an endoinulinase strain by response surface meth Nhomakorabeadology
GOU Ya-feng WANG Dan SUN Dan ZHANG Yan GE Juan GAO Jian-feng (College of Life Science,Shihezi University,Shihezi 832003,Xinjiang,China) Abstract：The strain with high endoinulinase productivity was screened, named G-60 which was collected from the root soil of Jerusalem artichoke in Shihezi city of Xinjiang province. A Plackett-Burman design was used to evaluate the influence of eight factors, The results showed that inulin added amount , content of the peptone and the Liquid medium volume played an important role in influencing the endoinulinase activity, Then the path of steepest ascent and the Central Composite Design were suitable for further optimization, the optimal concentration of the variables were determined as: Inulin 66.5g/L, Peptone 29.1g/L, and liquid medium volume 49.38mL, under this condition, the endoinulinase activity was increased to 24.62U/mL, which was improved by 1.55 times than before optimization. Key words：strains G-60; Endoinulinase; Response Surface Methodology 中图分类号：Q939.99 文献标志码：A 文章编号： 菊芋(Jerusalem artichoke)原产于北美，后经欧洲传入亚洲，在我国广泛种植。菊芋适应性 强，特别适合在沙漠、滩涂、盐碱荒地等非农业耕地种植[1]，且产量高，价格低廉。菊芋块茎 中含糖量高，可达其干重的 60%~70%，菊芋中的储存性多糖是以菊粉(inulin)形式存在的，菊 粉又名菊糖，由 D-果糖残基经 β(l-2)糖苷键脱水缩合而成，直链结构，末端连接一个葡萄糖分 子。菊粉的分子式表示为 GFn[2]。 菊粉酶(Inulinase)是能够水解 β-2,1-D-果聚糖果糖苷键的一类水解酶[3]名为 β-2,1-D-果聚糖 酶(EC3.2.1)。 菊粉酶的来源广泛， 自然界中的植物和动物消化道中的许多微生物都可以产生菊 粉酶[4-5]。由于微生物生长繁殖快，生活周期短，酶产量高，并且能够水解大量存在于菊芋等 植物块茎中的菊粉，用于生产果糖浆、低聚果糖、燃料酒精等[6-8]，具有十分重要的生产价值 和广阔的利用前景，内切型菊粉酶随机作用于菊糖中间，水解产物主要是低聚果糖[9]。由于低 聚糖具有防龋齿[10]、降血脂、抗肿瘤等功能，而且还具备独特的能促进肠道中有益菌群双歧 杆菌增殖的生理活性，因此倍受食品科技界的重视 [11]。功能性低聚糖的研究和开发被认为是