釉原蛋白羧基末端肽加速细胞周期促进成釉细胞系ALC细胞增殖

釉原蛋白羧基末端肽加速细胞周期促进成釉细胞系ALC细胞
增殖
刘敏; 王睿捷; 宋丹阳; 杨随; 谭陶; 王磊; 王衣祥
【期刊名称】《《中国组织工程研究》》
【年(卷),期】2020(024)001
【总页数】7页(P99-105)
【关键词】釉原蛋白羧基末端肽; 釉原蛋白; 成釉细胞; 细胞增殖; 细胞周期; MAPK-ERK信号通路; 牙釉质发育
【作者】刘敏; 王睿捷; 宋丹阳; 杨随; 谭陶; 王磊; 王衣祥
【作者单位】北京大学口腔医院修复科北京市 100081; 北京大学首钢医学院口腔科北京市 100144; 北京大学口腔医院中心实验室北京市 100081
【正文语种】中文
【中图分类】R459.5; R394.2; R783
0 引言 Introduction
釉原蛋白是釉基质蛋白的重要成分之一，约占釉基质的95%，是牙釉质形成、成熟、矿化的主要基质[1]。

釉原蛋白是由釉原蛋白基因的可变剪接及转录后修饰形成的一种富含脯氨酸的多肽家族，由于存在可变剪接以及釉质发育过程中的酶解作用，釉原蛋白及其衍生肽组成了釉基质[2-3]。

釉原蛋白是极性分子，包含疏水的N-端和亲水的C-端，两个末端在物种间高度保守。

研究表明釉原蛋白除了在釉质
基质成熟和矿化中所起的直接作用外，釉原蛋白可变剪接体及其蛋白水解产物等成分也被认为具有信号传导作用[4]。

早期研究主要关注于釉原蛋白的可变剪接体作
为信号分子的特定作用，尤其关注于其在复杂的牙骨质形成过程的作用，能够促进牙骨质的形成和附着[5]。

基质金属蛋白酶20是在釉质发育特定阶段表达的酶，可以水解釉原蛋白产生C-
末端多肽[6-7]。

研究表明，釉原蛋白C-末端的11个氨基酸组成的多肽，即釉原
蛋白羧基末端肽(C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)是重要的
信号分子区段，能够对人成牙骨质细胞、骨髓间充质干细胞、MC3T3-E1(小鼠胚
胎成骨细胞前体细胞)的增殖或分化进行调控[6-9]。

AMG-CP对成釉细胞的作用尚未见报道。

该研究通过细胞增殖、细胞周期和通路阻断实验，研究AMG-CP对成釉细胞系ALC细胞增殖的影响及作用机制。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点2018年7月至2019年2月在北京大学口腔医院中心实验室完成。

1.3 材料
1.3.1 AMG-CP的合成序列及检测报告 AMG-CP的合成序列为Ac-STDKTKREEVD-NH2(相对分子质量为 1 347.64)，委托北京赛百盛生物科技有限公司合成。

合成的AMG-CP进行了液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析。

无菌去离子
水溶解多肽冻干粉，按实验所需浓度稀释分装。

1.3.2 实验细胞小鼠成釉细胞系ALC细胞(ameloblastlineage cells，ALC)由滨州医学院高玉光教授馈赠。

1.3.3 实验试剂及仪器 DMEM/F12培养基(Hyclone，美国)；胰蛋白酶(Gbico，
美国)；胎牛血清(AWB，乌拉圭)；青霉素/链霉素(Gbico，美国)；BAC试剂盒(康为世纪，北京)；U0126(Selleck，上海)；兔源p-ERK1/2单克隆抗体，total-
ERK1/2单克隆抗体和兔源GAPDH多克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；二氧化碳恒温培养箱(Thremo，美国)；医用净化工作台(Thremo，美国)；
纯水系统(Millipore，美国)；xCELLigence RTCA细胞分析系统检测系统(ACEA Biosciences，美国)；E-Plate L8电极板(ACEA Biosciences，美国)；Odyssey
双色红外荧光成像系统(Licor，美国)；Nanodrop 2000(Thermo Fisher，美国)；QuantStudio®3实时荧光定量PCR仪器(Thremo，美国)；荧光倒置显微镜(Leica，德国)。

1.4 实验方法
1.4.1 细胞系培养小鼠成釉细胞系ALC细胞用含体积分数为10%胎牛血清、100
U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，在37 ℃、体积分数为5%CO2、100%湿度条件下培养。

细胞汇合至80%时传代，取处于对数生长期的
细胞用于后续实验。

小鼠成釉细胞系ALC细胞的培养及鉴定细胞来源：由滨州医学院高玉光教授馈赠
基础培养基：DMEM/F12 培养液添加材料：体积分数为10%胎牛血清、100
U/mL 青霉素、100 mg/L链霉素培养时间：细胞复苏2 d 后开始换液，培养3 d 后传代细胞传代：细胞融合至80%用0.25%胰蛋白酶消化传至下1代，按照1 4 比例传代，使用3-6 代细胞进行实验细胞鉴定：STR 分型鉴定
1.4.2 实时定量检测细胞增殖曲线将ALC细胞按2×103/孔的密度接种于E-Plate L8电极板中，每孔200 μL，第2天加入终质量浓度为0，0.5，1，2 mg/L
AMG-CP[9]，连续6 d用xCELLigence RTCA 细胞分析系统实时定量分析AMG-CP对成釉细胞增殖的影响，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。

1.4.3 EdU检测细胞增殖取对数生长期的ALC细胞制备单细胞悬液，将直径为15 mm的无菌圆形玻片加入6孔板内，将细胞以2×105/孔的密度接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h；PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继
续培养48 h以同步化细胞至G0期，再换为正常含血清培养基，并按分组加入质量浓度为0，1，2 mg/L的AMG-CP 处理细胞12 ，16 ，20 h ；然后按照BeyoCilckTMEdU-488细胞增殖检测试剂盒使用说明书，对细胞进行EdU-488标记染色，荧光显微镜下观察，每组随机选择3个视野拍照，采用ImageJ半定量分析增殖细胞比例。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞周期将细胞以2×105/孔接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h；PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继续培养48 h 以同步化细胞至G0期，再换为正常含血清培养基，加入终质量浓度为0，1，2 mg/L的AMG-CP处理细胞12 h，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，1 000 r/min 离心5 min；体积分数为95%乙醇固定1 h；PBS 洗2 次，用含0.1%Triton-X-100 及50 mg/L RNaseA的PBS处理细胞30 min；离心，弃去PBS；加入适量PBS(0.5-1.0 mL)重悬细胞，300目细胞筛过滤；加入碘化丙啶染色，用流式细胞仪检测，记录细胞周期变化。

1.4.5 Real-time PCR 检测细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达将细胞以2×105/孔接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h；PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继续培养48 h以同步化细胞至G0期，再换为正常含血清培养基，并加入终质量浓度为0，1，2 mg/L的AMG-CP作用4 h；Trizol提取细胞总RNA，采用Nanodrop 2000测量吸光度
A260/A280，检测RNA样本浓度和纯度，取2 μg总RNA反转录合成cDNA，加入PCR仪中扩增。

结果采用实时荧光定量PCR分析程序分析，计算目的基因相对值=2-ΔΔCt。

引物序列见表1。

表1 Real-time PCR 相关基因引物序列Table 1 Gene primer sequences of real-time PCR基因引物序列CyclinD1 Forward primer 5'-GCG TAC CCT GAC ACC AAT CTC-3'Reverse primer 5'-ACT TGA AGT AAG ATA CGG AGG GC-
3'CDK4 Forward primer 5'-ATG GCT GCC ACT CGA TAT GAA-3'Reverse primer 5'-TGC TCC TCC ATT AGG AAC TCT C-3'MCM2 Forward primer 5'-ATC CAC CAC CGC TTC AAG AAC-3'Reverse primer 5'-TAC CAC CAA ACT CTC ACG GTT-3'MCM5 Forward primer 5'-GGG CAT TTT CTA CAG CGA CAG-3'Reverse primer 5'-GGG CAT TTT CTA CAG CGA CAG-3'GAPDH Forward Primer 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3'Reverse Primer 5'-TCC ACC ACC CTG TTG CTG T-3'
1.4.6 MAPK-ERK1/2通路抑制剂U0126处理后AMG-CP作用下实时定量检测细胞增殖曲线取对数生长期的ALC细胞，按2×103/孔的密度接种于E-Plate L8电极板中，每孔200 μL，孵育24 h，加入50 μmol/L MA PK-ERK1/2通路抑制剂
U0126预处理细胞1 h，随后用含1 mg/L AMG-CP的培养液培养3 d，利用xCELLigence RTCA细胞分析系统检实时定量检测ALC细胞增殖，至抑制组细胞
死亡时停止检测，绘制细胞增殖曲线。

1.4.7 MAPK-ERK1/2通路抑制剂U0126处理后AMG-CP作用下Western blot 检测p-ERK1/2、total-ERK1/2的表达取对数生长期的ALC细胞，以2×105/孔
接种于6孔板内，每孔2 mL，孵育24 h，PBS冲洗1次，更换为无血清培养基
同步化48 h，更换为正常培养基，并加入50 μmol/L U0126预处理细胞1 h；随后用含1 mg/L AMG-CP的培养液培养细胞1 h，采用Western blot检测p-ERK1/2、total-ERK1/2和GAPDH的表达。

细胞用PBS洗3次，加入含有蛋白
酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解细胞，收集蛋白样品，BAC试剂盒测定蛋白浓度，取30 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过转膜系统转移至PVDF膜上，
用封闭液在室温下振荡孵育1 h，按照1∶1 500浓度依次孵育抗total-ERK1/2抗体、抗p-ERK1/2抗体，缓冲液洗涤膜3次，室温孵育荧光二抗，Odyssey双色
红外荧光成像系统检测结果。

1.5 主要观察指标①在不同质量浓度AMG-CP作用下ALC细胞增殖曲线及细胞
倍增时间；②在不同质量浓度AMG-CP作用下EdU荧光染色半定量分析增殖细
胞比例；③在不同质量浓度AMG-CP作用下不同细胞周期的ALC细胞数百分比；
④在不同质量浓度AMG-CP作用下细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK2、MCM2、MCM5 mRNA的表达水平；⑤MAPK-ERK1/2信号通路阻断后的ALC细胞增殖
曲线；⑥MAPK-ERK1/2 信号通路阻断后ALC 细胞的p-ERK1/2、total-ERK1/2
表达水平。

1.6 统计学分析相同实验每组重复3次，采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数
据统计图采用Graphpad Prim7进行绘图，进行方差分析(ANOVA)和Tukey多
重比较检验。

计量资料以±s表示，P≤0.05为差异有显著性意义。

2 结果 Results
2.1 人工合成AMG-CP鉴定液相色谱对合成产物进行分选得到目的产物。

质谱分析得到相对分子质量为1 347.64的目的多肽Ac-STDKTKREEVD-NH2，见表2
和图1，2。

表2 高效液相色谱分选釉原蛋白羧基末端肽的结果分析Table 2 Result analysis
of sorting C-terminus of the amelogenin peptide by high performance liquid chromatography序号时间(min) 产物量(%) 峰面积峰高峰宽1 8.967 1.601 14 662 1 470 0.000 2 9.473 98.17 899 202 39 348 21.461 3 9.987
0.221 9 2 033 565 0.000合计 100 915 897 41 383
2.2 AMG-CP对ALC细胞增殖的影响
2.2.1 AMG-CP作用于ALC细胞的增殖曲线及细胞倍增时间与对照组相比，0.5，1，2 mg/L AMG-CP实验组标准化细胞指数增大，并且随着AMG-CP质量浓度
的增加，标准化细胞指数增加越明显。

各组之间差异有显著性意义(P≤0.05)，见
图3。

细胞增殖倍增时间呈浓度梯度下降趋势，各组差异有显著性意义(P≤ 0.05)，
然而0.5，1 mg/L组的细胞倍增时间在数值上接近，其生物学意义不大，见图4。

2.2.2 EdU染色检测AMG-CP对ALC细胞增殖的影响AMG-CP作用20 h后，随着AMG-CP的质量浓度增加，明亮的绿色荧光逐渐增强，见图5。

12 h及16 h
的荧光标记结果类似，20 h最为显著，因此作为结果展示。

使用ImageJ软件对EdU染色结果做半定量分析，结果显示2 mg/L AMG-CP作用12，16，20 h都
有促进细胞增殖的作用，差异有显著性意义(P≤0.05)。

1 mg/L AMG-CP作用12，16 h促进细胞增殖的作用与对照组相比差异无显著性意义，在作用20 h后与对照组相比能促进细胞增殖，差异有显著性意义，见图6。

2.3 AMG-CP 对ALC细胞周期的影响
2.3.1 流式细胞仪检测处于不同细胞周期的ALC细胞百分比 0，1，2 mg/L AMG-CP作用12 h后，处于G1期的细胞比例降低，且随质量浓度的增加而降低；处于S期的细胞比例上升，且随质量浓度的增加而增加，与对照组相比差异有显著性意义(P≤0.05)。

实验组和对照组G1/G2细胞比例差异无显著性意义，见表3，图7。

2.3.2 AMG-CP作用下ALC细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达 1，2 mg/L AMG-CP作用4 h后，CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达均较对照组(0 mg/L)有显著增高，差异有显著性意义
(P≤0.05)，但1 mg/L与2 mg/L组之间差异无显著性意义，见图8。

表3 不同质量浓度釉原蛋白羧基末端肽(AMG-CP)作用12 h 后细胞周期各时期的ALC 细胞百分比(±s，n=3，%)Table 3 Percentage of ALC cells at different stages of the cell cycle at 12 hours after treatment with C-terminus of the amelogenin peptide表注：两两组间比较，差异均有显著性意义(aP≤0.05)组别
G1 S G1/G2 0 mg/L AMG-CP 66.18±0.323a 30.87±0.987a 1.917±0.097 1
mg/L AMG-CP 51.28±0.479a 39.37±0.283a 2.082±0.183 2 mg/L AMG-CP 42.63±0.097a 50.22±0.675a 1.975±0.007
2.4 AMG-CP作用下ALC细胞MAPK-ERK1/2信号通路中p-ERK1/2、total-ERK1/2的表达 1 mg/L AMG-CP激活ALC细胞中ERK1/2磷酸化(P≤0.05)，对total-ERK1/2蛋白没有影响，见图9。

2.5 AMG-CP对ALC细胞中p-ERK1/2表达作用被阻断剂U0126阻断
2.5.1 U0126 阻断细胞MAPK-ERK1/2 信号通路后，AMG-CP对ALC细胞增殖的实时动态检测结果 MAPK抑制剂U0126处理后细胞增殖受抑制，作用20 h后生长曲线出现转折点，细胞数量下降。

当50 μmol/L U0126抑制剂与1 mg/L AMG-CP同时作用时，细胞增殖的总体趋势是抑制的，在细胞数量增加阶段，50 μmol/L U0126抑制剂+1 mg/L AMG-CP组与50 μmol/L U0126抑制剂组比较差异无显著性意义，在细胞数量下降阶段，50 μmol/L U0126抑制剂+1 mg/L AMG-CP组与50 μmol/L U0126抑制剂组比较差异有显著性意义(P≤0.05)，见图10。

2.5.2 U0126 阻断细胞MAPK-ERK1/2 信号通路后，AMG-CP对ALC细胞中p-ERK1/2、total-ERK1/2表达的影响通过ERK抑制剂U0126阻断MAPK-ERK信号通路情况下，ALC细胞磷酸化ERK1/2的表达难以检测出来，对total-ERK1/2蛋白没有影响，这与细胞增殖实验结果相符合，见图11。

AMG-CP可以通过激活MAPK-ERK信号通路，使ERK1/2磷酸化，从而促进ALC细胞增殖。

3 讨论 Discussion
早期研究发现牙釉质基质衍生物能够促进牙周纤维、根面牙骨质、牙槽骨再生。

研究者在探索牙釉质基质衍生物作用机制的过程中，逐步明确其主要成分是釉原蛋白(约占95%)，并对于多种细胞的增殖分化具有促进作用[10-14]。

AMG-CP可以作用于人骨髓间充质干细胞上的釉原蛋白受体，激活MAPK-ERK信号通路，促进骨髓间充质干细胞增殖[7，15]。

釉原蛋白来源于成釉细胞，但是AMG-CP对于成釉细胞的作用如何尚未见报道。

该研究通过采用xCELLigence RTCA细胞分析系统检测AMG-CP作用于成釉细胞系ALC细胞的增殖曲线[16]，研究结果表明AMG-CP对成釉细胞系的增殖具有促进作用，并且具有浓度梯度依赖性。

该实验结果和AMG-CP作用于人成牙骨质细胞[6]、骨髓间充质干细胞的增殖效应一致[7]。

AMG-CP促进细胞增殖，细胞群体倍增时间降低，本质上是细胞有丝分裂周期加速。

EdU染色增加意味着DNA的合成增加，AMG-CP促进了这一过程。

流式细胞术检测在不同质量浓度AMG-CP
作用下细胞周期的变化，结果表明AMG-CP作用12 h后，处于G1期的细胞比
例降低，且随质量浓度的增加而降低；处于S期的细胞比例上升，且随质量浓度
的增加而增加，与对照组相比差异有显著性意义(P≤ 0.05)，与EdU染色结果一致，说明AMG-CP促进ALC细胞从G1期向S期转化。

Cyclin D1、CDK2在G1期
向S期转化的阶段发挥作用，MCM2、MCM5是合成期染色体复制关键启动子。

Real-time PCR检测AMG-CP作用ALC细胞后Cyclin D1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA表达上升。

实验结果说明AMG-CP促进ALC细胞G1/S期的转化，同时促进S期细胞合成。

MAPK-ERK信号通路是多数生长因子、细胞因子调控靶点细胞增殖的重要途径。

已有研究表明ERK是介导CyclinD1与CyclinE表达所必需的重要通道，CyclinD1的转录依赖于ERK1/2的持续激活和核内的阻滞[17]。

CyclinD1和
CKD4形成活化的激酶复合物，可激活相关基因的表达，使细胞周期由G1期向S 期转变。

已有研究表明AMG-CP是通过激活ERK通路对于成牙骨质细胞、骨髓间充质干细胞发挥增殖作用[7]。

Western blot检测发现，AMG-CP能够促进MAKP-ERK1/2、p-ERK1/2 表达量升高。

ERK1/2 信号通路抑制剂阻断MAKP-ERK1/2后，即使在AMG-CP作用下，细胞增殖也受到了抑制，ERK1/2的磷酸
化也无法激活。

由此可知AMG-CP也是通过激活ERK1/2信号通路促进ALC细胞增殖。

基质金属蛋白酶20将釉原蛋白从C末端的S163-P164之间水解，产生23 kD的肽片段及釉原蛋白C末端11个氨基酸组成的小肽片段[3，18]。

全长釉原蛋白的C末端在物种间是高度保守的序列[19-21]，近年多项研究逐渐探究表明釉原蛋白C末端表现出一些可代表全长釉原蛋白的信号功能。

有研究者发现，富含亮氨酸的釉原蛋白LRAP的C末端与全长釉原蛋白C末端相同，LRAP及其C末端肽对成骨具有促进作用[22]。

因此提示釉原蛋白的C末端对成骨矿化具有调控作用。

通过比较重组人全长釉原蛋白(rh174)、不含AMG-CP的釉原蛋白片段(rh163)、不含N-末端的釉原蛋白片段(rh128)、AMG-CP，发现rh174、rh128、AMG-CP 能够通过MAPK-ERK1/2信号通路促进人成牙骨质细胞增殖，因此推测AMG-CP 可能是釉原蛋白调控细胞增殖的主要活性位点[6]。

该研究也证明了AMG-CP可以作用于成釉细胞ALC细胞增殖，并且也是通过激活MAPK-ERK1/2信号通路实现的。

此外，釉原蛋白的C末端肽对促进细胞矿化的作用在不同细胞中表现不一样。

rh174、rh128、AMG-CP能够影响成牙骨质细胞的矿化功能，上调碱性磷酸酶活性，增加矿化结节形成。

AMG-CP能够促进MC3T3-E1细胞增殖，不能改变ALP 和BSP基因水平和蛋白水平的表达，不能促进其体外矿化形成。

因此，釉原蛋白调控多种细胞增殖分化的功能性位点位于其C末端。

在成釉细胞中的矿化表现还需进一步探索。

基于该研究结果可以认为：AMG-CP对成釉细胞系ALC细胞的增殖有促进作用。

结合以往研究中AMG-CP对于组织工程学种子细胞(如骨髓间充质干细胞、牙周膜成纤维细胞、成牙骨细胞等)具有相应的生物学效应。

因此，AMG-CP可能对探索其作为生物活性分子用于促进牙釉质形成的组织工程研究具有潜在应用价值。

图1 高效液相色谱法分选釉原蛋白羧基末端肽Figure 1 Separation of C-terminus of the amelogenin peptide by high performance liquid
chromatography
图2 合成釉原蛋白羧基末端肽的质谱分析结果Figure 2 Mass spectrometry of C-terminus of the amelogenin peptide图注：箭头标志处为目的多肽波形
图3 xCELLigence RTCA 细胞分析系统检测不同质量浓度釉原蛋白羧基末端肽作用于ALC 细胞的增殖曲线Figure 3 Proliferation curves of ALC cells treated with C-terminus of the amelogenin peptide at different concentrations detected by xCELLigence RTCA cell analysis system图注：使用细胞指数(Cell Index)表示细胞阻抗。

标准化细胞指数(Nomralized Cell Index)定义为感兴趣的时间点的细胞指数与某一特定时间点的细胞指数的比值，反应细胞数量作出细胞增殖曲线图。

将釉原蛋白羧基末端肽处理细胞的时间点作为标准化细胞指数参考点。

2 mg/L 组(蓝色)标准化细胞指数大于1 mg/L 组(粉色)，1 mg/L 组大于0.5
mg/L 组(绿色)，0.5 mg/L 组大于对照组(红色)，实验各组之间两两比较，差异有显著性意义(aP≤0.05)
图4 不同质量浓度釉原蛋白羧基末端肽对ALC 细胞倍增时间的影响Figure 4 The effect of C-terminus of the amelogenin peptide at different concentrations on population doubling time of ALC cells
图5 釉原蛋白羧基末端肽作用20 h 后EdU 染色结果(×100)Figure 5 Detection of cell proliferation by EdU staining 20 hours after treatment with C-terminus of the amelogenin peptide(×100)图注：图中A-C 为荧光倒置显微镜下ALC 细胞；D-F为Hoechst 染色使细胞核产生蓝色荧光；G-I 为EDU染色使增殖的细胞产生绿色荧光
图6 釉原蛋白羧基末端肽作用于ALC 细胞后EdU染色检测细胞增殖的半定量分析结果Figure 6 Semi-quantitative analysis of cell proliferation by EdU staining after treatment with C-terminus of the amelogenin peptide图注：
0.01＜aP≤0.05，0.000 2＜bP≤0.001 ，0.000 1＜cP≤0.000 2，dP≤0.000 1
图7 不同质量浓度釉原蛋白羧基末端肽作用12 h 后ALC 细胞周期流式细胞术检
测结果Figure 7 Flow cytometry detection of ALC cell cycle treated with different concentrations of C-terminus of the amelogenin peptide for 12 hours图注：蓝色表示G1 期，粉色表示S 期，蓝色方格表示G2 期
图8 不同浓度釉原蛋白羧基末端肽作用4 h 后ALC 细胞周期相关基因mRNA 表
达水平Figure 8 Expression of cell cycle-related genes in ALC cells treated with different concentrations of C-terminus of the amelogenin peptide for 4 hours图注：aP≤0.05
图9 釉原蛋白羧基末端肽对p-ERK1/2、total-ERK1/2 蛋白表达水平的影响Figure 9 Effect of C-terminus of the amelogenin peptide on phosphorylated ERK1/2 and total ERK1/2 levels
图10 MAPK 抑制剂U0126 阻断MAPK-ERK 信号通路后ALC 细胞增殖曲线Figure 10 Proliferation curves of ALC cells after U0126 inhibition of MAPK-ERK signaling pathway图注：将U0126 处理细胞的时间作为标准化细胞指数参考点，aP≤0.05
图11 釉原蛋白羧基末端肽及U0126 对p-ERK1/2、total-ERK1/2 蛋白表达水平
的影响Figure 11 Effect of C-terminus of the amelogenin peptide and
U0126 on phosphorylated ERK1/2 and total ERK1/2 levels
致谢：衷心感谢北京大学口腔医院中心实验室以及王磊副教授、王衣祥研究员、宋业青老师、孙仕晨师兄在实验过程中所给予的帮助。

作者贡献：实验设计、实施为刘敏，实验评估为王磊、王衣祥，资料收集为王睿捷、宋丹阳、杨随。

经费支持：该文章接受了“国家自然科学基金面上项目(81470770)”“北京市自
然科学基金(7172240，7182181)”的资助。

所有作者声明，经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。

利益冲突：文章的全部作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。

机构伦理问题：研究用细胞的实验方案符合相关伦理学要求。

写作指南：该研究遵守国际医学期刊编辑委员会《学术研究实验与报告和医学期刊编辑与发表的推荐规范》。

文章查重：文章出版前已经过专业反剽窃文献检测系统进行3 次查重。

文章外审：文章经小同行外审专家双盲外审，同行评议认为文章符合期刊发稿宗旨。

生物统计学声明：文章统计学方法已经通过北京大学口腔医院生物统计学专家审核。

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