番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染对番茄褪绿病毒传播的影响

番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染对番茄褪绿病毒传播的影响
作者：廖锦钰黄莉萍张战泓张德咏谭新球刘勇史晓斌
来源：《植物保护》2021年第03期
摘要：番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus（ToCV）是一种由烟粉虱Bemisia tabaci传播的正义单链RNA病毒，在田间常与番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）復合侵染而造成番茄生产上重大的经济损失。

为了明确ToCV与TYLCV的复合侵染对烟粉虱传播ToCV所造成的影响，本文采用RT-PCR以及qRT-PCR检测了复合侵染的番茄对烟粉虱获取和传播ToCV的影响。

研究表明，烟粉虱取食复合侵染的番茄后对ToCV的传播效率显著提高，仅25头烟粉虱的传毒率即可达到100%，ToCV在烟粉虱以及番茄体内的累积量均显著提高。

说明这种复合侵染促进了烟粉虱对ToCV的传播，在田间应当及时防控烟粉虱，警惕病毒与烟粉虱的蔓延。

关键词：番茄褪绿病毒; 番茄黄化曲叶病毒; 烟粉虱; 复合侵染
中图分类号：
S 436.412.11
文献标识码： A
DOI： 10.16688/j.zwbh.2020063
Influence of co-infection of Tomato chlorosis virus and Tomato yellow
leaf curl virus on the transmission of Tomato chlorosis virus
LIAO Jinyu1，2， HUANG Liping1，2， ZHANG Zhanhong3， ZHANG Deyong2， TAN Xinqiu2， LIU Yong2*， SHI Xiaobin1，2*
（1. Subcollege of Longping， Graduate School of Hunan University， Changsha 410128，China;
2. Hunan Plant Protection Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China;
3. Hunan Vegetable Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125，China）
Abstract
Tomato chlorosis virus （ToCV） is a positive single-stranded RNA virus transmitted by Bemisia tabaci， which is usually co-infected with Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV） in the field and causes significant economic losses in tomato production. In order to clarify the influence of co-infection of ToCV and TYLCV on the transmission of ToCV， RT-PCR and real-time quantitative PCR were used to detect the effect of co-infection on the virus acquisition and transmission of ToCV by B.tabaci. The results showed that the ToCV transmission efficiency was significantly improved after co-infection. Only 25 B.tabaci individuals could cause a 100% transmission rate， and the quantities of ToCV in B.tabaci and tomato were significantly increased. This co-infection promoted the spread of ToCV by B.tabaci. The whitefly should be prevented timely， and the spread of virus and whitefly should be highly regarded in the field.
Key words
Tomato chlorosis virus; Tomato yellow leaf curl virus; Bemisia tabaci; co-infection
番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus （ToCV），隶属于长线性病毒科Closteroviridae，毛形病毒属Crinivirus，是一种由烟粉虱Bemisia tabaci传播的半持久性RNA病毒，于2004年在我国台湾首次报道[1]。

番茄黄化曲叶病毒Tomato yellow leaf curl virus （TYLCV），隶属于双生病毒科Geminiviridae，菜豆金色花叶病毒属Begomovirus，是一种单链环状DNA植物病
毒，田间依靠烟粉虱以持久性非增殖方式传播，于2006年在我国上海首次报道[2]。

ToCV与TYLCV的发病时期和所需的环境条件大致相同，传播媒介相似，发病症状均表现为叶片黄化，其主要区别在于ToCV通常表现为老叶先发病，叶片脉间黄化褪绿，同时变厚变脆且边缘向内卷曲;而TYLCV通常表现为新叶先发病，叶缘逐渐黄化，同时变小皱缩且向上卷曲[34]。

此外，ToCV与TYLCV发病的潜伏期差异较大，ToCV的潜伏期较长，一般需要3～4周才能表现出症状，而TYLCV的潜伏期较短，一般7～10 d就开始表现发病症状[34]。

ToCV在田间极易与TYLCV复合侵染，TYLCV和ToCV的复合侵染于2014年首次在山东发现，随后在江苏和云南相继报道并且呈逐年上升趋势[57]。

据统计，从2013年至2017年，TYLCV的检出率在全国番茄病毒中排名第3，ToCV已经成为北京及山东地区侵染番茄的优势种[8]，TYLCV 与ToCV均能给番茄造成10%以上的减产幅度，严重时甚至绝收[4，910]，给我国番茄生产造成严重的经济损失。

病毒的复合侵染往往会产生协生作用，对寄主植物造成不可估量的伤害。

已有大量研究表明，病毒的复合侵染会提高病毒的致病性，造成更为严重的发病症状，从而加速寄主植物死亡[1113]。

复合侵染还能增加病毒发生基因重组的几率，进而产生具有更强致病力和更广寄主范围的新病毒[1416]。

目前对于ToCV与TYLCV复合侵染的研究主要以分子鉴定以及病害流行为主，二者复合侵染后对寄主植物的影响以及其与介体昆虫相互作用的研究较少，本文重点研究了TYLCV和ToCV复合侵染番茄对烟粉虱的获毒能力和传毒率以及ToCV在烟粉虱和番茄体内累积量的影响，从而明确复合侵染是否影响烟粉虱对ToCV的传播，为研究TYLCV和ToCV复合侵染后二者的协生作用及其分子机制奠定基础，也为ToCV及TYLCV的防控策略提供新思路。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供试毒源：ToCV单独侵染、ToCV与TYLCV复合侵染的番茄采自山东寿光，并且经过PCR以及小RNA测序检测无其他病毒复合侵染。

将毒株移栽至湖南省农业科学院植物保护研究所温室，在不同隔间中单独培养，分别采用虫传的方法获取毒株：取健康Q型烟粉虱用带毒番茄喂饲48 h以获得携带ToCV和携带ToCV与TYLCV的烟粉虱，经随机取样检测确认带毒后，用微虫笼转移带毒烟粉虱至3～4片真叶期的健康番茄上，每株番茄接种50头，取食48 h后移除烟粉虱，30 d后取番茄植株最上部的叶片，采用1.2中RT-PCR法检测传毒是否成功。

每月定期虫传，以保证毒株的供应。

供试植株：番茄品种为‘中杂9号’（Lycopersicon esculentum ‘Zhongza 9’），于温室内培育，（26±1）℃、RH（70±5）%、光周期L∥D=16 h∥8 h，未接触任何农药和昆虫。

供试昆虫：Q型烟粉虱，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所张友军研究员课题组馈赠，饲喂于番茄植株上，之后放在养虫笼内用无虫番茄继代饲养，每隔两个月进行生物型鉴定[17]。

1.2 番茄与烟粉虱带毒情况检测
1.2.1 番茄中ToCV的鉴定
采用RT-PCR法检测番茄ToCV的感染情况，采用华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒按照说明书步骤提取番茄总RNA。

cDNA合成使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司Hiscript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper），按照说明书步骤合成cDNA用作RT-PCR 模板。

以表1中ToCV-3F/ToCV-3R为特异性引物，使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus）试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，目的条带经纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.2 番茄中TYLCV的鉴定
采用PCR法检测番茄TYLCV的感染情况。

用CTAB法提取番茄总DNA。

以表1中TYLCV-F/TYLCV-R为特异性引物，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，目的条带经纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.3 烟粉虱中ToCV的鉴定
烟粉虱RNA提取采用TRIzol （Invitrogen公司）法，将烟粉虱样品置于RNase free 的1.5 mL 离心管中，用液氮冷冻后研磨，参照说明书提取总RNA，后续鉴定步骤参照1.2.1。

1.3 番茄褪绿病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR体系建立
本试验采用高利利建立的番茄褪綠病毒SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 体系[18]，基于ToCV RNA2链的HSP70基因保守区设计引物ToCV-qF和ToCV-qR（表1），目的片段长度为190 bp，经验证该引物特异性及扩增效率良好。

1.3.1 ToCV基因片段克隆与鉴定
以ToCV的反转录cDNA为模板，以ToCV-qF和ToCV-qR为引物，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）试剂盒进行PCR扩增，得到190 bp目的条带，使用Gel Extration Kit回收试剂盒（OMEGA生物公司）纯化回收目的片段，连接至pMD18-T Vector （TaKaRa），并转化感受态细胞TreliefTM5α Chemically Competent Cell（北京擎科生物有限公司），37℃过夜培养后，以ToCV-qF和ToCV-qR为引物进行菌落PCR检测，将阳性克隆送至上海生物工程有限公司测序。

1.3.2 ToCV质粒标准品的制备
选择测序序列完全正确的阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（100 mg/L Amp+）的LB液体培养基，37℃，250 r/min 培养过夜，提取质粒，利用紫外分光光度计检测质粒浓度及OD值后保存至-20℃。

运用公式：C=A/B×6.02×1023（A 为质粒浓度g/μL，B为质粒DNA分子量，C 为质粒浓度拷贝/μL）计算出质粒浓度拷贝数，将其作为ToCV质粒标准品使用。

1.3.3 标准曲线的建立
将质粒标准品用DNase/RNase free water（天根生化科技有限公司）按照10倍梯度进行稀释，获得终浓度为1.1×105～1.1×1011 拷贝/μL的7个质粒样品，使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司qRT-PCR试剂盒按照说明书在实时荧光定量PCR仪（BioRad CFX96梯度荧光定量PCR仪，伯乐，美国）上进行qRT-PCR，每个浓度进行3次技术重复，仪器自动生成标准曲线。

病毒的复合侵染往往会产生协生作用，对寄主植物造成不可估量的伤害。

已有大量研究表明，病毒的复合侵染会提高病毒的致病性，造成更为严重的发病症状，从而加速寄主植物死亡[1113]。

复合侵染还能增加病毒发生基因重组的几率，进而产生具有更强致病力和更广寄主范围的新病毒[1416]。

目前对于ToCV与TYLCV复合侵染的研究主要以分子鉴定以及病害流行为主，二者复合侵染后对寄主植物的影响以及其与介体昆虫相互作用的研究较少，本文重点研究了TYLCV和ToCV复合侵染番茄对烟粉虱的获毒能力和传毒率以及ToCV在烟粉虱和番茄体内累积量的影响，从而明确复合侵染是否影响烟粉虱对ToCV的传播，为研究TYLCV和ToCV复合侵染后二者的协生作用及其分子机制奠定基础，也为ToCV及TYLCV的防控策略提供新思路。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供试毒源：ToCV单独侵染、ToCV与TYLCV复合侵染的番茄采自山东寿光，并且经过PCR以及小RNA测序检测无其他病毒复合侵染。

将毒株移栽至湖南省农业科学院植物保护研究所温室，在不同隔间中单独培养，分别采用虫传的方法获取毒株：取健康Q型烟粉虱用带毒番茄喂饲48 h以获得携带ToCV和携带ToCV与TYLCV的烟粉虱，经随机取样检测确认带毒后，用微虫笼转移带毒烟粉虱至3～4片真叶期的健康番茄上，每株番茄接种50头，取食48 h后移除烟粉虱，30 d后取番茄植株最上部的叶片，采用1.2中RT-PCR法检测传毒是否成功。

每月定期虫传，以保证毒株的供应。

供试植株：番茄品种为‘中杂9号’（Lycopersicon esculentum ‘Zhongza 9’），于温室内培育，（26±1）℃、RH（70±5）%、光周期L∥D=16 h∥8 h，未接触任何农药和昆虫。

供试昆虫：Q型烟粉虱，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所张友军研究员课题组馈赠，饲喂于番茄植株上，之后放在养虫笼内用无虫番茄继代饲养，每隔两个月进行生物型鉴定[17]。

1.2 番茄与烟粉虱带毒情况检测
1.2.1 番茄中ToCV的鉴定
采用RT-PCR法检测番茄ToCV的感染情况，采用华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒按照说明书步骤提取番茄总RNA。

cDNA合成使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司Hiscript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper），按照说明书步骤合成cDNA用作RT-PCR 模板。

以表1中ToCV-3F/ToCV-3R为特异性引物，使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus）试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，目的条带经纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.2 番茄中TYLCV的鉴定
采用PCR法检测番茄TYLCV的感染情况。

用CTAB法提取番茄总DNA。

以表1中TYLCV-F/TYLCV-R为特异性引物，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，目的条带经纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.3 烟粉虱中ToCV的鉴定
烟粉虱RNA提取采用TRIzol （Invitrogen公司）法，将烟粉虱样品置于RNase free 的1.5 mL 离心管中，用液氮冷冻后研磨，参照说明书提取总RNA，后续鉴定步骤参照1.2.1。

1.3 番茄褪绿病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR体系建立
本试验采用高利利建立的番茄褪绿病毒SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 体系[18]，基于ToCV RNA2链的HSP70基因保守区设计引物ToCV-qF和ToCV-qR（表1），目的片段长度为190 bp，经验证该引物特异性及扩增效率良好。

1.3.1 ToCV基因片段克隆与鉴定
以ToCV的反转录cDNA为模板，以ToCV-qF和ToCV-qR为引物，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）试剂盒进行PCR扩增，得到190 bp目的条带，使用Gel Extration Kit回收试剂盒（OMEGA生物公司）纯化回收目的片段，连接至pMD18-T Vector
（TaKaRa），并转化感受态细胞TreliefTM5α Chemically Competent Cell（北京擎科生物有限公司），37℃过夜培养后，以ToCV-qF和ToCV-qR为引物进行菌落PCR检测，将阳性克隆送至上海生物工程有限公司测序。

1.3.2 ToCV质粒标准品的制备
选择测序序列完全正确的阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（100 mg/L Amp+）的LB液体培养基，37℃，250 r/min 培养过夜，提取质粒，利用紫外分光光度计检测质粒浓度及OD值后保存至-20℃。

运用公式：C=A/B×6.02×1023（A 为质粒浓度g/μL，B为质粒DNA分子量，C 为质粒浓度拷贝/μL）计算出质粒浓度拷贝数，将其作为ToCV质粒标准品使用。

1.3.3 标准曲线的建立
将质粒标准品用DNase/RNase free water（天根生化科技有限公司）按照10倍梯度进行稀释，获得终浓度为1.1×105～1.1×1011 拷贝/μL的7个质粒样品，使用南京诺維赞（Vazyme）生物公司qRT-PCR试剂盒按照说明书在实时荧光定量PCR仪（BioRad CFX96梯度荧光定量PCR仪，伯乐，美国）上进行qRT-PCR，每个浓度进行3次技术重复，仪器自动生成标准曲线。

病毒的复合侵染往往会产生协生作用，对寄主植物造成不可估量的伤害。

已有大量研究表明，病毒的复合侵染会提高病毒的致病性，造成更为严重的发病症状，从而加速寄主植物死亡[1113]。

复合侵染还能增加病毒发生基因重组的几率，进而产生具有更强致病力和更广寄主范围的新病毒[1416]。

目前对于ToCV与TYLCV复合侵染的研究主要以分子鉴定以及病害流行为主，二者复合侵染后对寄主植物的影响以及其与介体昆虫相互作用的研究较少，本文重点研究了TYLCV和ToCV复合侵染番茄对烟粉虱的获毒能力和传毒率以及ToCV在烟粉虱和番茄体内累积量的影响，从而明确复合侵染是否影响烟粉虱对ToCV的传播，为研究TYLCV和ToCV复合侵染后二者的协生作用及其分子机制奠定基础，也为ToCV及TYLCV的防控策略提供新思路。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供试毒源：ToCV单独侵染、ToCV与TYLCV复合侵染的番茄采自山东寿光，并且经过PCR以及小RNA测序检测无其他病毒复合侵染。

将毒株移栽至湖南省农业科学院植物保护研究所温室，在不同隔间中单独培养，分别采用虫传的方法获取毒株：取健康Q型烟粉虱用带毒番茄喂饲48 h以获得携带ToCV和携带ToCV与TYLCV的烟粉虱，经随机取样检测确认带毒后，用微虫笼转移带毒烟粉虱至3～4片真叶期的健康番茄上，每株番茄接种50头，取食
48 h后移除烟粉虱，30 d后取番茄植株最上部的叶片，采用1.2中RT-PCR法检测传毒是否成功。

每月定期虫传，以保证毒株的供应。

供试植株：番茄品种为‘中杂9号’（Lycopersicon esculentum ‘Zhongza 9’），于温室内培育，（26±1）℃、RH（70±5）%、光周期L∥D=16 h∥8 h，未接觸任何农药和昆虫。

供试昆虫：Q型烟粉虱，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所张友军研究员课题组馈赠，饲喂于番茄植株上，之后放在养虫笼内用无虫番茄继代饲养，每隔两个月进行生物型鉴定[17]。

1.2 番茄与烟粉虱带毒情况检测
1.2.1 番茄中ToCV的鉴定
采用RT-PCR法检测番茄ToCV的感染情况，采用华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒按照说明书步骤提取番茄总RNA。

cDNA合成使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司Hiscript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper），按照说明书步骤合成cDNA用作RT-PCR 模板。

以表1中ToCV-3F/ToCV-3R为特异性引物，使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus）试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，目的条带经纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.2 番茄中TYLCV的鉴定
采用PCR法检测番茄TYLCV的感染情况。

用CTAB法提取番茄总DNA。

以表1中TYLCV-F/TYLCV-R为特异性引物，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，目的条带经纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.3 烟粉虱中ToCV的鉴定
烟粉虱RNA提取采用TRIzol （Invitrogen公司）法，将烟粉虱样品置于RNase free 的1.5 mL 离心管中，用液氮冷冻后研磨，参照说明书提取总RNA，后续鉴定步骤参照1.2.1。

1.3 番茄褪绿病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR体系建立
本试验采用高利利建立的番茄褪绿病毒SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 体系[18]，基于ToCV RNA2链的HSP70基因保守区设计引物ToCV-qF和ToCV-qR（表1），目的片段长度为190 bp，经验证该引物特异性及扩增效率良好。

1.3.1 ToCV基因片段克隆与鉴定
以ToCV的反转录cDNA为模板，以ToCV-qF和ToCV-qR为引物，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）试剂盒进行PCR扩增，得到190 bp目的条带，使用Gel Extration Kit回收试剂盒（OMEGA生物公司）纯化回收目的片段，连接至pMD18-T Vector （TaKaRa），并转化感受态细胞TreliefTM5α Chemically Competent Cell（北京擎科生物有限公司），37℃过夜培养后，以ToCV-qF和ToCV-qR为引物进行菌落PCR检测，将阳性克隆送至上海生物工程有限公司测序。

1.3.2 ToCV质粒标准品的制备
选择测序序列完全正确的阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（100 mg/L Amp+）的LB液体培养基，37℃，250 r/min 培养过夜，提取质粒，利用紫外分光光度计检测质粒浓度及OD值后保存至-20℃。

运用公式：C=A/B×6.02×1023（A 为质粒浓度g/μL，B为质粒DNA分子量，C 为质粒浓度拷贝/μL）计算出质粒浓度拷贝数，将其作为ToCV质粒标准品使用。

1.3.3 标准曲线的建立
将质粒标准品用DNase/RNase free water（天根生化科技有限公司）按照10倍梯度进行稀释，获得终浓度为1.1×105～1.1×1011 拷贝/μL的7个质粒样品，使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司qRT-PCR试剂盒按照说明书在实时荧光定量PCR仪（BioRad CFX96梯度荧光定量PCR仪，伯乐，美国）上进行qRT-PCR，每个浓度进行3次技术重复，仪器自动生成标准曲线。

病毒的复合侵染往往会产生协生作用，对寄主植物造成不可估量的伤害。

已有大量研究表明，病毒的复合侵染会提高病毒的致病性，造成更为严重的发病症状，从而加速寄主植物死亡[1113]。

复合侵染还能增加病毒发生基因重组的几率，进而产生具有更强致病力和更广寄主范围的新病毒[1416]。

目前对于ToCV与TYLCV复合侵染的研究主要以分子鉴定以及病害流行为主，二者复合侵染后对寄主植物的影响以及其与介体昆虫相互作用的研究较少，本文重点研究了TYLCV和ToCV复合侵染番茄对烟粉虱的获毒能力和传毒率以及ToCV在烟粉虱和番茄体内累积量的影响，从而明确复合侵染是否影响烟粉虱对ToCV的传播，为研究TYLCV和ToCV复合侵染后二者的协生作用及其分子机制奠定基础，也为ToCV及TYLCV的防控策略提供新思路。

1 材料与方法
1.1 试验材料
供试毒源：ToCV单独侵染、ToCV与TYLCV复合侵染的番茄采自山东寿光，并且经过PCR以及小RNA测序检测无其他病毒复合侵染。

将毒株移栽至湖南省农业科学院植物保护研究所温室，在不同隔间中单独培养，分别采用虫传的方法获取毒株：取健康Q型烟粉虱用带毒番茄喂饲48 h以获得携带ToCV和携带ToCV与TYLCV的烟粉虱，经随机取样检测确认带毒后，用微虫笼转移带毒烟粉虱至3～4片真叶期的健康番茄上，每株番茄接种50头，取食48 h后移除烟粉虱，30 d后取番茄植株最上部的叶片，采用1.2中RT-PCR法检测传毒是否成功。

每月定期虫传，以保证毒株的供应。

供试植株：番茄品种为‘中杂9号’（Lycopersic on esculentum ‘Zhongza 9’），于温室内培育，（26±1）℃、RH（70±5）%、光周期L∥D=16 h∥8 h，未接触任何农药和昆虫。

供试昆虫：Q型烟粉虱，由中国农业科学院蔬菜花卉研究所张友军研究员课题组馈赠，饲喂于番茄植株上，之后放在养虫笼内用无虫番茄继代饲养，每隔两个月进行生物型鉴定[17]。

1.2 番茄與烟粉虱带毒情况检测
1.2.1 番茄中ToCV的鉴定
采用RT-PCR法检测番茄ToCV的感染情况，采用华越洋多糖多酚植物RNA提取试剂盒按照说明书步骤提取番茄总RNA。

cDNA合成使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司Hiscript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit （+gDNA wiper），按照说明书步骤合成cDNA用作RT-PCR 模板。

以表1中ToCV-3F/ToCV-3R为特异性引物，使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司2×Taq Plus Master MixⅡ（Dye Plus）试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，目的条带经纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.2 番茄中TYLCV的鉴定
采用PCR法检测番茄TYLCV的感染情况。

用CTAB法提取番茄总DNA。

以表1中TYLCV-F/TYLCV-R为特异性引物，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）试剂盒，按照说明书步骤进行PCR扩增。

PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统上观察并记录结果，目的条带经纯化回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序分析。

1.2.3 烟粉虱中ToCV的鉴定
烟粉虱RNA提取采用TRIzol （Invitrogen公司）法，将烟粉虱样品置于RNase free 的1.5 mL 离心管中，用液氮冷冻后研磨，参照说明书提取总RNA，后续鉴定步骤参照1.2.1。

1.3 番茄褪绿病毒SYBR Green I 实时荧光定量PCR体系建立
本试验采用高利利建立的番茄褪绿病毒SYBR Green I 实时荧光定量 PCR 体系[18]，基于ToCV RNA2链的HSP70基因保守区设计引物ToCV-qF和ToCV-qR（表1），目的片段长度为190 bp，经验证该引物特异性及扩增效率良好。

1.3.1 ToCV基因片段克隆与鉴定
以ToCV的反转录cDNA为模板，以ToCV-qF和ToCV-qR为引物，使用2×Taq Plus Master Mix Ⅱ（Dye Plus）试剂盒进行PCR扩增，得到190 bp目的条带，使用Gel Extration Kit回收试剂盒（OMEGA生物公司）纯化回收目的片段，连接至pMD18-T Vector （TaKaRa），并转化感受态细胞TreliefTM5α Chemically Competent Cell（北京擎科生物有限公司），37℃过夜培养后，以ToCV-qF和ToCV-qR为引物进行菌落PCR检测，将阳性克隆送至上海生物工程有限公司测序。

1.3.2 ToCV质粒标准品的制备
选择测序序列完全正确的阳性克隆接种于含有氨苄青霉素（100 mg/L Amp+）的LB液体培养基，37℃，250 r/min 培养过夜，提取质粒，利用紫外分光光度计检测质粒浓度及OD值后保存至-20℃。

运用公式：C=A/B×6.02×1023（A 为质粒浓度g/μL，B为质粒DNA分子量，C 为质粒浓度拷贝/μL）计算出质粒浓度拷贝数，将其作为ToCV质粒标准品使用。

1.3.3 标准曲线的建立
将质粒标准品用DNase/RNase free water（天根生化科技有限公司）按照10倍梯度进行稀释，获得终浓度为1.1×105～1.1×1011 拷贝/μL的7个质粒样品，使用南京诺维赞（Vazyme）生物公司qRT-PCR试剂盒按照说明书在实时荧光定量PCR仪（BioRad CFX96梯度荧光定量PCR仪，伯乐，美国）上进行qRT-PCR，每个浓度进行3次技术重复，仪器自动生成标准曲线。