翻译与非翻译马铃薯y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较

浙江大学
博士学位论文
翻译与非翻译马铃薯Y病毒外壳蛋白基因介导的抗病性比较
姓名：***
申请学位级别：博士
专业：植物病理学
指导教师：温孚江;李德葆
2001.5.1
塑坚叁兰竖．！兰堡堡兰——
摘要
利用来源于病毒本身的基因或核苷酸序列转化植物来获得抗病毒的工程植株，已成为遗传工程中改良作物对病毒病抗性的主要措施之一。

利用病毒的外壳蛋白（ＣＰ）基因为转基因（ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）是较为成熟的抗病毒育种策略。

但是，一些转病毒ｃＰ基因的转基因植物的抗病机制（是ＲＮＡ介导还是蛋白质介导）目前还有争议。

近年来，ＲＮＡ介导的抗性已成为植物抗病毒基因工程领域研究的热点。

本研究以马铃薯Ｙ病毒（ＰＶＹ“）为基因源，分别克隆了翻译的ＰＶＹ“ＣＰ基因和非翻译的ＰＶＹ“ＣＰ基因，构建了两种植物表达载体，并转化了烟草ＮＣ８９。

对这两种转基因植物进行了抗病性、分子生物学及生物学鉴定和比较。

同时，对从山东省内分离的两个ＰＶＹ病毒分离物进行了初步研究，＼具体结果如下：
＼
】．根据已报道的马铃薯Ｙ病毒坏死株系（ＰＶＹ“）核苷酸序列，设计并合成了两种寡聚核苷酸引物，以ＰＶＹ”的ＲＮＡ为模板，扩增出翻译的ＰＶＹ“ＣＰ（简称ＣＰＮ）基因和非翻译的ＰＶＹ“ＣＰ（简称ＣＰＭ）基因，将扩增的片段克隆到载体ｐＢＳＫ的ＢａｍＨｌ和印ｎＩ之间，并进行了序列测定。

分别用ＢａｍＨＩ和＾≯ｎＩ从重组克隆载体上将ＣＰＭ和ＣＰＮ基因切下，并插入植物表达载体ｐＲＯＫＩＩ３５Ｓ启动子下游，利用ＰＣＲ筛选及酶切鉴定得到含ＣＰＮ的重组克隆ｐＰＶＹＣＰＮ和含ＣＰＭ的重组克隆ｐＰＶＹＣＰＭ。

用三亲交配法将重组克隆导入根癌农杆菌，分别获得了含ｐＰＶＹＣＰＮ和ｐＰＶＹＣＰＭ质粒的农杆菌菌株，用于普通烟草的转化。

２．将含外源基因的根癌农杆菌与烟草栽培品种ＮＣ８９叶盘共培养，将再生苗在含卡那霉素的培养基上选择，分别获得经ＣＰＮ和ＣＰＭ基因转化的植株２７７株和２４５株。

对所得到的抗卡那霉素的再生苗进行分子生物学检测表明，在含有１５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素的培养基上转ＣＰＮ和ＣＰＭ基因的植株分别有９５％｛１９８％为Ｄｏｔ－ｂｌｏｔ阳性植株，即获得了２６３株含ＣＰＮ的Ｔｏ代转基因烟草和２４０株含ＣＰＭ的Ｔｏ代转基因烟草。

３．Ｔ。

代转基因植株的抗病性分析表明，以ＰＶＹ”的病汁液为接种物时，两种类型的转基因烟草对ＰＶＹ“的抗病性具有相似性。

但同一类型的不同转基因植株对ＰＶＹ“的抗性强度不同。

我们将其表现型分为三种类型：高度抗病（植株整个生育期未检测到病毒）、抗病（植株ｌ；ｉ『期未检测到病毒，但在接种２０一３０天后植株表现轻微症状）和感病（转基因植株与非转基因对照植株的症状相似）。

而且高度抗病型的植株占转基因总株
ＶＩＩ
浙江人学博Ｉ一学位论文
数的８％左右。

分别用提纯ＰＶＹ“病毒粒体和ＰＶＹ“ＲＮＡ为接种物的实验表明，Ｔｏ代转基因植株表现的抗病性不受接种物性质及其剂量的影响。

表现型为高度抗病的含ＣＰＭ的Ｔ０代转基因植株对马铃薯Ｙ病毒普通株系（ＰＶＹｏ）的侵染也表现为高度抗病。

４．用单一一限制性内切酶酶切Ｔ。

代转基因植株的总ＤＮＡ，并进行Ｓｏｕｔｈｅｍ印迹杂交实验，结果表明，目的基因已经整合到烟草染色体上。

对部分不同抗性的Ｔｏ代转基因植株所含转基因拷贝数的分析初步证明，这两种转基因植株的抗病性与转基因拷贝数都成正相关。

绝大多数高度抗病植株含５．６个转基因拷贝，抗病植株含３－４个转基因拷贝，而感病植株一般含ｌ一２个转基因拷贝。

５．Ｔｏ代转基因植株的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹杂交证明，这两种类型的ＣＰ基因都在ＲＮＡ水平上得到了表达，并且目的基因的ＲＮＡ在细胞内的积累量与转基因植株的抗病强度成反相关，即高度抗病型植株内目的基因ＲＮＡ在细胞内积累量较少，感病型植株内目的基因ＲＮＡ积累量较多，而抗病型的则介于二者之问。

６．Ｔｏ代转基因植株Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹杂交表明，在表达非翻译的ＰＶＹ“ＣＰ基因的转基因植株内未检测到ＣＰ蛋白，而导入翻译的ＰＶＹ“ＣＰ基因的植株内检测到了ｃＰ蛋白，但是，ＰＶＹ“ＣＰ蛋白含量与抗病性不存在相关关系。

７．以选择标汜卡那霉素基因对卡那霉素的抗性为标记，对部分不同抗性的转基因植株Ｔ．代进行分离鉴定，并以ＰＣＲ进一步证实，结果表明，转基因植株的遗传是复杂的。

在所测试的５０株范围内，高度抗病植株的遗传不符合孟德尔的３：１和１５：１的分离规律：抗病植株的遗传有的符合１５：１的分离规律，但多数不符合。

分子分析表明，外源基因在转基因植株Ｔｔ代中能够遗传，并凡在ＲＮＡ水平ｆＪ正常表达。

８．从山东省种植的烟草和马铃薯上获得了ＰＶＹ病毒的两个分离物，分别为ＰＶＹ—Ｔ和ＰＶＹ．Ｐ，实验初步表明ＰＶＹ—Ｔ属于ＰＶＹｏ株系，ＰＶＹ．Ｐ属于ＰＶＹ“株系。

两者在生物学特性及其侵染寄主导致的细胞病变差异，可作为区别ＰＶＹ不同株系的依据。

、１
关键词：马铃薯Ｙ病毒，细胞病理学，ＣＰ基因，转基因烟草
ＲＮＡ介导的净９性，遗传分析
塑坚查堂堕！：兰竺堡苎——一——
Ｓｕｍｍａｒｙ
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ｔｈｅｂｅｅｎｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｉｎｔｏｔｈｅｔｏｂａｃｃｏｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔ
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ｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ．Ｔｈｅｈｉｇｈｌｙｒｅｓｉｓｔａｎｔｐｌａｎｔｓｃｏｎｔａｉｎｅｄ５－６ｃｏｐｉｅｓｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅ，ｔｈｅｐａｒｔｉａｌｌｙ
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７．ＳｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｇｅｎｙＴｉｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒｅｓｉｓｔａｎｔｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｌｅａｆ－ｄｉｓｃｉｎｋａｎａｍｙｃｉｎ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｍｅｄｉｕｍａｎｄｂｙＰＣＲａｎａｌｙｓｉｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｐｒｏｇｅｎｙＴｌｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｌｉｎｅｓｗａｓｃｏｍｐｌｅｘ．Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅｏｆｔｈｅｔｒａｎｓｇｅｎｅｓｉｎｓｏｍｅｌｉｎｅｓｆｏｌｌｏｗｅｄ１５：１ｓｅｇｒｅｇａｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎ，ｂｕｔｏｔｈｅｒｓｄｉｄｎｏｔ．８．ＴｗｏＰＶＹｉｓｏｌａｔｅｓ（ｉｅ．，ＰＶＹ．ＴａｎｄＰＶＹ．Ｐ）ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｔｏｂａｃｃｏａｎｄｐｏｔａｔｏｆｉｅｌｄｓｉｎＳｈａｎｄｏｎｇｐｒｏｖｉｎｃｅ．ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅＰＶＹ—ＴｉｓｏｌａｔｅｂｅｌｏｎｇｔｏｔｈｅＰＶＹ”ｓｔｒａｉｎｇｒｏｕｐ．ａｎｄｔｈｅＰＶＹ．ＰｗａｓｓｉｍｉｌａｒｔｏＰＶＹ“．Ｔｈｅｙａｒｅｄｉｔｉｅｒｅｎｔｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙｏｆｐｕｒｉｆｉｅｄｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅ，ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐａｎｄｔｈｅｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓｃａｕｓｅｄｂｙｔｈｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｗｏｉｓｏｌａｔｅｓｏｆＰＶＹＴｈｅｓｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓｍｉｇｈｔｂｅｕｓｅｆｕｌｉｎｔｈｅｖｉｒｕｓｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｐｏｔａｔｏｖｉｒｕｓＹｃｏａｔｐｒｏｔｅｉｎｇｅｎｅ，ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｔｏｂａｃｃｏ，ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，ｇｅｎｅｔｉｃａｎａｌｙｓｉｓ，ｃｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ．
Ｘ
致谢
本研究是在导师温孚江教授的悉心指导下完成的。

从选题、方案制定和实施到研究结果的分析整理、论文的撰写，都凝聚着导师的心血和智慧。

温老师渊博的知识、开拓创新的学者风范、严谨的治学作风和豁达的处世态度将使我受益终身。

在论文完成之际，谨此致以诚挚的敬意和深深的感谢。

衷心感谢我的博士论文指导小组老师李德葆教授、郑成超教授和周雪平教授，在业务学习、实验技能培养、资料分析、论文撰写以及生活等方面他们都给予我许多教诲、指导和关怀。

本研究是在山东农业大学植物抗病毒基因工程实验室完成的，实验室主任温孚汀教授是浙江大学的兼职教授，博士生导师。

实验室严谨求是的工作作风、热烈浓厚的学术气氛、互助共进的团结精神给了我极大的感染。

在读期间，实验室的全体老师和同窗师兄妹，特别是宋云枝副教授，朱常香、颜景燕老师给予我极大的支持和帮助，使我能全心投／ｘ，Ｎ科研中，忙而有序地完成实验研究，在此向实验室所有给予我帮助的老师和同学们表示衷心的感谢和良好的祝愿。

本实验室的往届博士生吕士恩参与了本论文第二部分第三章中的部分研究工作，在此表示感谢。

在杭州学习期间，得到了我的同窗好友和浙江大学植保系、，Ｊｉ物所的老师们，特别足郑重教授的关心和帮助，谨此对他们表示真诚的感谢。

感谢山东农业大学的领导和老师们对我的支持，特别感谢朱汉城教授、严敦余教授对我和我全家人的关心和帮助。

本研究得到了国家自然科学基金资助。

最后，对多年来一直不断地支持我、鼓励我，并为我的学业付出艰辛劳动和无尽关怀的我的夫人贾寿华女士，表示衷心的感谢。

郭兴启
２００１年５月
浙江大学博士学位论文
第一部分文献综述
第一章马铃薯Ｙ病毒属病毒与寄主互作的
分子生物学研究进展
马铃薯Ｙ病毒属（Ｐｏｌｙｖｉｒｕｓ）是植物病毒中最大的属，包括已确定的和可能的成员１８０多种。

病毒粒体为弯曲线形，大小为１１—１５×６８０—９００ｎｍ，其核酸为一单链ｉＦ义ＲＮＡ，蛋白质为一多肽。

病毒在寄主细胞质中形成典型的风轮状或卷旋状内含体。

此属病毒在自然界主要由蚜虫以非持久性的方式传播，有的还能通过种子传播，危害多种植物，并造成巨大的经济损失，因而越来越受人们关注。

随着细胞生物学和分子生物学技术的快速发展和新技术方法在植物病毒研究中的不断应用，人们对植物病毒的认识进入了一个崭新的阶段。

目前，在利用报告基因、免疫胶体金标记、以及病毒侵染性ｃＤＮＡ克隆等方法，对马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组进行深入研究的同时，病毒学家已把寄主与病毒之间，病毒与传播介体之间的互作机制作为对该属病毒研究的主要内容之一。

从某和噫义上讲，对病毒基因、基因产物、寄主细胞成分和传播介体之间的动态互作关系的研究更为重要，因为病毒是一种专性寄生物，其生活史的完成必须依赖于寄主。

事实上，病毒一寄主互作的研究也是病毒基因组功能研究的深入和扩展。

本章综述了近年来马铃薯Ｙ病毒属病毒的系统侵染、病毒的传播以及植物对该属病毒的抗性等方面的分子生物学研究的最新进展。

１．病毒的基因组结构
马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组是一单链『Ｆ义ＲＮＡ，其长约１０ｋｂ，其５’端共价键连一基因组相关蛋白（ＶＰｇ），３’端连一多聚腺苷酸尾巴ｐｏｌｙ（Ａ）。

浚基因组只有一个开放阅读框架（ＯＲＦ），翻译后形成一个多聚前提蛋白，通过自身编码的蛋白酶加工成成熟的蛋白质来行使各种功能（见图１）。

从多聚蛋白的Ｎ端到ｃ端不同基因产物依次为：Ｐ１（第一个蛋白），ＨｃＰｒｏ（蚜传辅助成分／蛋白酶），Ｐ３（第三个蛋白），６Ｋｌ（第一个６Ｋ肽段），ＣＩ（圆柱状内含体蛋白），６Ｋ２（第二个６Ｋ肽段），ＮＩａ（核内含体蛋白ａ，ＶＰｇ—Ｐｒｏ），ＮＩｂ（核内含体蛋白ｂ），ＣＰ（外壳蛋白）。

另外，５’端还有非翻译区（ＵＴＲ），其长度在１４４到２０５个核苷酸之间。

３’端的ＵＴＲ富含Ａｕ片段，折叠成稳定的二级结构。

浙江走擘博士学位论文
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图１．１马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组结构
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２．病毒的系统侵染
病毒从植物的局部位点侵入，向植物其它部位转运并造成系统侵染，这一过程可大体分为下列几个阶段：（１）病毒在最初受侵染的细胞内复制；（２）病毒或病毒基因组通过胞
问连丝从最初受侵染的细胞运动到邻近细胞，在细胞间运动；（３）病毒进入植物的韧皮部，
进行长距离的转运：（４）病毒逸出韧皮部，在远离侵染点的组织内进行复制和细胞问运动。

一般病毒在植物细胞间的运动和长距离的转运是由病毒编码的特异运动蛋白（ＭＰ）来完
成，而马铃薯Ｙ病毒属病毒不编码这种专一性的ＭＰ蛋白，病毒的运动功能是出ＣＰ蛋白、
ＨｃＰｒｏ蛋白、ＣＩ蛋白和ＶＰｇ蛋白协助完成。

因此，马铃薯Ｙ病毒属病毒系统侵染的主要
环节与一般病毒存在着明显的差异。

２．１病毒基因组的扩增
马铃薯Ｙ病毒属病毒的基因组扩增包括两部分，即病毒ＲＮＡ翻译成病毒特异的蛋白质和复制ＲＮＡ自身。

由于病毒蛋白参与ＲＮＡ的复制，因此ＲＮＡ的复制和翻译在空问上
和时涮上是交互联系的。

马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组５’端不同Ｊ：真核生物基因组５’端
的帽子结构，而是连接一个病毒自身编码的ＶＰｇ蛋白，它与核糖核蛋白体有关，但其结
构还不清楚。

由于真核生物中ｍＲＮＡ的翻译需要５’端帽子和３’端ｐｏｌｙ（Ａ）之间的互作
协调（Ｇａｌｌｉｅ，１９９８），因此马铃薯Ｙ病毒属病毒５’端的ＶＰｇ蛋白也可能与翻译因子相结
合在翻译中起重要作用。

对芜菁花叶病毒（ＴｕＭＶ）和烟草蚀纹病毒（ＴＥＶ）的研究证明
了ＶＰｇ的这种作用（Ｗｉｔｔｍａｎｎ，１９９７；Ｏａｌｌｉｅ，１９９８）。

此外，５’端的ＶＰｇ蛋白在核糖体的进
入中也起重要作用（Ｓｉｍｏｎ．Ｂｕｅｌａ，１９９７）。

在ＲＮＡ复制过程中，Ｎｌｂ聚合酶的活性
（Ｈｏｎｇ，１９９６）、ＴＥＶ复制复合物与内质网膜的连接以及６Ｋ蛋白在连接膜时所起的锚定作
用等都是重要的发现（Ｈｏｎｇ，１９９６；Ｓｃｈａａｄ，１９９７ａ）。

对ＰＶＹＰｌ定位研究表明Ｐｌ与基因组
的扩增有关（Ｖｅｒｃｈｏｔ，１９９５），Ｋａｓｓｃｈａｕ等（１９９７）实验证明，ＨｅＰｒｏ和Ｐ３都参与了基因
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组的扩增。

另外，ｃＰ编码区和３７端非翻译区序列的二级结构也影响着病毒复制的功能（Ｈａｌｄｅｍａｎ—Ｃａｈｉｌｌ．１９９８）。

２．２病毒细胞间的运动
Ｒｏｊａｓ等（１９９７）用显微注射技术证明，菜豆普通花叶坏死病毒（ＢＣＭＮＶ）和莴苣花叶病毒（ＬＭＶ）的ｃＰ和ＨｃＰｒｏ均可在细胞间进行运动，它们通过增加胞问连丝的体积排阻限度（ｓｉｚｅｅｘｃｌｕｓｉｏｎｌｉｍｉｔ，ＳＥＬ），促进病毒ＲＮＡ在细胞问的运动。

如果将ＣＰ的中问区域或ＨｃＰｒｏ的Ｃ端突变后，病毒就不能进行细胞问的运动。

ＨｅＰｒｏ在细胞间的运动比ｃＰ更频繁，距离更远，并且能使胞间连丝ＳＥＬ扩大到能让３９ｋＤＦ－葡聚糖通过的程度，而ＣＰ只能达到让１０ｋＤＦ－葡聚糖通过的程度。

Ｄｏｌｊａ等（１９９５）通过对构建ＴＥＶ—ＧＵＳＣＰ中心区域突变体的研究发现，所有突变体在细胞间的运动和病毒粒体的装配过程都是缺陷型的，表明ＣＰ在病毒的运动过程中起重要作用。

ｃＩ蛋白作为基因组复制过程所必需的螺旋酶，也参与了病毒细胞间的运动（Ｋｌｅｉｎ，１９９４），ＣＩ蛋白所形成的风轮状内含体常常位于胞间连丝的开口处，阻止了病毒的胞间运动。

Ｒｏｂｅｒｔｓ等（１９９８）采用免疫金标记技术和电镜观察也证明了ＣＩ蛋白和ＣＰ蛋白对病毒胞间运动的影响。

通过构建烟草脉带斑驳病毒（ＴＶＭＶ）的重组体和点突变分析表明，ＶＰｇ也参与了病毒的胞间运动（Ｎｉｃｏｌａｓ，１９９７）。

Ｍａｓｕｔａ等（１９９９）研究证明，ＶＰｇ不仅在病毒复制中起重要作用，而且对ＰＶＹ在细胞问的运动也有重要影响。

烟草品种ＶＡＭ（ＶｉｒｇｉｎＡＭｕｔａｎｔ）具有～个隐性基因ｖ口，ＶＡＭ对ＰＶＹ不同分离物有不同程度的抗性，但对大多数ＰＶＹ分离物表现高抗或耐病。

组织定位及杂交分析表明，烟草品种ＶＡＭ对ＰＶＹ的抗性发生在病毒细胞阳Ｊ运动阶段上。

通过进一步比较能攻破ＶＡＭ抗性的突变体与最初毒株在氨基酸序列上的异同发现，ＶＰｇ中一个氨基酸的替换导致了ＶＡＭ抗性的丧失，这表明ＶＰｇ在ＰＶＹ细胞问运动中起作用（Ｍａｓｕｔａ，１９９９）。

２．３病毒的长距离转运
至少有三种蛋白（ＣＰ、ＨｃＰｒｏ和ＶＰｇ）参与了病毒的长距离转运过程。

在ＴＥＶＣＰ的Ｎ端或ｃ端采用删除的方式所形成的ＴＥＶ．ＧＵＳ突变体，不能进行长距离的转运，证明了ＣＰ在病毒长距离转运中的作用。

Ｋａｓｓｃｈａｕ等（】９９７）研究表明，ＨｃＰｒｏ蛋白中心区域的半胱氨酸被替换后，对病毒的胞间运动功能无明显的影响，但可以完全抑制ＴＥＶ的长距离转运。

该病毒突变体的长距离转运在表达ＨｃＰｒｏ基因的转基因植株内可得到恢复，这说明ＨｃＰｒｏ是影响ＴＥＶ长距离转运的重要因子。

通过对ＴＥＶ重组体的研究表明，ＶＰｇ也参与了病毒的长距离转运（Ｓｃｈａａｄ，１９９７ｂ）。

３．病毒ＨｃＰｒｏ蛋白在ＰＴＧＳ中的作用
近年来，对ＨｃＰｒｏ蛋白功能的研究表明，ＨｃＰｒｏ蛋白能抑制植物中转录后基因沉默（ＰＴＧＳ）（Ｂｒｉｇｎｅｔｉ，１９９８），而ＰＴＧＳ是（转基因）植物中普遍存在的抗病毒机制（ＢａｕｌＣＯｒｏｂｅ．１９９９ａ）。

因此，能产生ＨｃＰｒｏ蛋白的马铃薯Ｙ病毒属病毒与其它属病毒同时侵染植物时，常常表现为协同关系，即ＨｃＰｒｏ蛋白通过干扰寄主正常的防御机制起到了致病增强子的作用，使另一种病毒能产生更严重的症状（Ｐｒｕｓｓ，１９９７；Ｓｈｉ，１９９７）。

这在转基因植物和自然植物中都有报道。

对转基因植物的研究发现，表达Ｐｌ／ＨｃＰｒｏ的转基因植株和报告基因（ｕ／Ａ和ｇｆｐ）已发生ＰＴＧＳ的转基因植株进行遗传杂交时，其后代报告基因的功能得到了恢复，即Ｐ１／ＨｃＰｒｏ抑制了转基因植物中的ＰＴＧＳ；对报告基因（ｕ／Ａ和ｅ／ｐ）已发生ＰＴＧＳ的转基因植株，用表达ＨｃＰｒｏ的ＰＶＸ载体接种时，植株内病毒积累水平明显比用野生型ＰＶＸ接种时高，并且恢复了已发生沉默的报告基因（ｕｉＡ和ｅ／ｐ）的表达功能（Ａｎａｎｄａｌａｋｓｈｍｉ，１９９８）。

Ｋａｓｓｃｈａｕ等（１９９８）研究表明，ＨｃＰｒｏ中心区域介导了病毒之间的协同作用和对ＰＴＧＳ的抑制。

并且，在与Ｐｌ蛋白共存时，ＨｃＰｒｏ蛋白对ＰＴＧＳ的抑制作用会得到加强。

对自然植物来讲，Ｖｏｉｎｎｅｔ等（１９９９）研究结果也证明了这种协同关系。

马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）是一种在寄主体内只存在于韧皮部中的病毒，可能是寄主中类似ＰＴＧＳ的抗病机制，限制了病毒进一步的运动。

当与表达ＨｃＰｒｏ蛋白的ＰＶＹ或水仙花叶病毒（ＮＭｖ）同时侵染三生烟时，ＰＬＲＶ在植株体内的浓度增加了１２倍。

当与不表达ＨｃＰｒｏ的苜蓿花叶病毒（ＡＬＭＶ）或烟草黑环病毒（ＴＢＲＶ）同时侵染时，则不能改变ＰＬＲＶ在植株体内的浓度。

因此，在烟草体内ＰＬＲＶ浓度的增加，可能是由于ＰＶＹ或ＮＭＶ的ＨｃＰｒｏ对植株中类似ＰＴＧＳ的抗病机制的抑制，使得ＰＬＲＶ粒体能够从韧皮部扩散到叶脉以外的区域。

然而，在病毒一寄主复杂的互作关系中，抑制ＰＴＧＳ的病毒蛋白其抑制作用有时被寄主的抗病机制所抵制。

这种现象在番茄不孕病毒（ＴｏＡＶ）与烟草植株互作中得到直接证实（Ｌｉ，１９９９）。

最近Ｋａ呵ｅＵａ等（２０００）研究结果间接地说明了ＨｃＰｒｏ蛋白对ＰＴＧＳ的抑制作用被寄主所抵御。

甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）（Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ）与甘薯褪绿矮化病毒（ＳＰＣＳＶ）（Ｃｒｉｎｉｖｉｒｕｓ）同时侵染甘薯时，表现出了异常的协生关系。

因为能产生ＨｃＰｒｏ蛋白的ＳＰＦＭＶ不是协生的引起者，而是协生关系中的受益者。

ＳＰＦＭＶ在寄主体内的浓度比单独侵染时高６００倍，而ＳＰＣＳＶ的浓度则变化不大。

当ＳＰＦＭＶ单独侵染时，由于寄主的抗病机制，抵御了ＨｃＰｒｏ的抑制作用，ＳＰＦＭＶ在寄主内的浓度较低：当ＳＰＦＭＶ与ＳＰＣＳＶ同时侵染时，ＳＰＣＳＶ可能产生了一种蛋白干扰了在寄主韧皮部传导的抗
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浙江大学博士学住论文
ＳＰＦＭＶ的信号，使寄主失去了对ＳＰＦＭＶ的抗病性。

４．病毒诱导的症状学
马铃薯Ｙ病毒属的大多数病毒能引起明显的症状，如能使受侵染的植株矮化、产量减少等。

通常在单子叶植物叶片上引起纵向褪绿或坏死条斑；在双子叶植物叶片上则引起褪绿脉带、花叶斑驳、坏死和叶片扭曲等症状。

对一个特定基因型的寄主来讲，病毒、病毒株系以及环境条件决定了该寄主的症状特点和变化类型，也许它们通过影响寄主的生理和发育来实现症状的表达。

症状是寄主和病毒之间复杂的细胞和非细胞性物质相互作用的结果，对于任何亲和性的寄主和病毒互作来讲，症状的严重度反映病毒复制和积累的水平。

近年来许多研究表明，马铃薯Ｙ病毒属病毒基因组的某些区域在症状学上有一定的作用。

ＴｖＭｖ基因组的突变分析表明，Ｐ１／ＨｃＰｒｏ编码区，特别是ＨｃＰｒｏ５７端编码区，在烟草植株中参与了症状的表达（Ｋｌｅｉｎ，１９９４）。

通过对来自豌豆种传花叶病毒的（ＰＳｂＭＶ）两个株系所构建的重组病毒的分析，Ｊｏｈａｎｓｅｎ等（１９９６）发现ＰＳｂＭＶ基因组的ＮＩａ和ＮＩｂ编码区对症状的严重度有重要影响。

两个独立的ＴＥＶ基因片段，一个是ｌ／３大小的Ｐ３编码区：另一个是３’端的ＣＩ，６Ｋ２和５’端的Ｎｌａ编码区，共同影响了胡椒的萎焉症状（Ｃｈｕ，１９９７）。

对李痘病毒（ＰＰＶ）基因组Ｐ３．６Ｋｌ之间的切割位点序列改造所形成的突变体，其症状表现或者是减退或者是更严重（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９５）。

进一步研究表明，ＰＰＶ基因组５’端非编码区中１８个核苷酸的缺失所形成的突变体，只表现轻微症状（Ｓｉｍｏｎ．Ｂｕｅｌａ，１９９７）。

尽管人们从病毒基因组水平对症状学进行了探讨并取得了一定的进展，但是，目前仍然没有一个较为统一的原理来解释症状的形成过程。

在其它病毒属中已表明，病毒基因的产物可以作为症状诱导因子使未接种的寄主表现症状（Ｏｌｅｓｉｎｓｋｉ，１９９５；Ｃｅｃｃｈｉｎｉ，１９９７），但在马铃薯Ｙ病毒属中目前还未见这方面的报道。

从某种意义上讲，我们缺乏对症状表达的理解，也反映了我们对与病毒互作的寄主植物蛋白的认识不够。

随着遗传分析研究的深入，不久将会在这方面取得新进展。

目前，只有两个与病毒互作的植物蛋白被鉴定出来：（Ｉ）在ＴｕＭＶ与拟南芥植株互作中，证明了与ＴｕＭＶ基因组中ＶＰｇ作用的寄主因子是ｅｌＦ（ｉｓｏ）４Ｅ蛋白（Ｗｉｔｔｍａｎｎ，１９９７）；（２）利用免疫技术，鉴定出了与ＴｕＭＶ基因组中ＣＰ发生相互作用的寄主因子是位于与叶绿体上的３７．ｋＤａ蛋白（ＭｃＣｌｉｎｔｏｃｋ，１９９８）。

但是，在互作中这两种寄主蛋白对病毒复制和症状表达的作用目前还不清楚。

产生症状的生化过程是复杂的，并且这些引起症状的生化变化作为原因，与症状产生的结果很难区别。

因为植物病毒的侵染是一个发展的过程，在局部侵染
的细胞中，病毒复制的指数阶段仅需几个小时，而系统侵染则要几天甚至几个星期。

这种时空交错的复杂关系无疑给病毒诱导的症状学的研究增加了难度。

５．病毒的传播
５．１病毒的蚜虫传播
马铃薯Ｙ病毒属病毒可以经蚜虫以非持久性的方式传播，蚜虫的口针在植物表面简单的剌吸就可以获毒并具有传毒能力。

研究发现，病毒编码的ＣＰ蛋白和ＨｃＰｒｏ蛋白参与了蚜虫传毒过程，其中ＣＰ基因Ｎ端一个保守的氨基酸三联体Ａｓｐ．Ａｌａ—Ｇｌｙ（ＤＡＧ）和ＨｃＰｒｏ基因Ｎ端富含半胱氨酸保守区内的赖氨酸ｂｏｘ（ＫＩＴＣ）是蚜虫能否传毒的重要作用位点。

另外，ＨｃＰｒｏ编码区中的ＰＴＫｂｏｘ也是影响蚜虫传毒的关键因子（Ｐｉｒｏｎｅ，１９９６）。

研究表明，蚜虫能否传毒取决于蚜虫是否提前或与病毒粒体一起获得ＨｃＰｒｏ蛋白，缺少ＨｃＰｒｏ蛋白的突变体，蚜虫就不能传毒。

因此人们推测，ＨｃＰｒｏ在ｃＰ蛋白和存在于介体１２１器中的受体之间起到了桥梁的作用。

Ｐｉｒｏｎｅ等（１９９６）对传毒过程中ＨｃＰｒｏ的作用提出了成桥假说（Ｂｒｉｄｇｅｔｈｅｏｒｙ），他认为在蚜虫传毒过程中，ＨｃＰｒｏ是一个双功能分子，一个功能区与病毒ＣＰ蛋白结合；另一个功能区与位于蚜虫口器上的受体结合。

Ｂｌａｎｃ等（１９９７）和Ｐｅｎｇ等（１９９８）的实验结果给这个假ｃ兑中ｃＰ与ＨｅＰｒｏ相互作用的观点提供了直接证据。

Ｂｌａｎｃ等（１９９７）体外实验表明ＴＶＭＶ的ＨｃＰｒｏ能与ＴＶＭＶＣＰ中的ＤＡＧ区直接相结合，而Ｐｅｎｇ等（１９９８）则证明了ＨｃＰｒｏ与病毒粒体的结合，并且ＨｃＰｒｏ与ｃＰ或病毒粒体的结合能明显提高蚜虫的传毒效率。

但是，该假说中关于ＨｃＰｒｏ与蚜虫口器中的受体蛋白相互作用的观点，目前还没有直接证据。

５．２病毒的种子传播
马铃薯Ｙ病毒属中有的病毒可以经种子传播。

研究表明，病毒使种子带毒的方式有两种途径，第一，病毒侵染配子，受精后带毒的配子使胚也带上病毒；第二，病毒不侵染配子，而是在植物丌花受精后病毒侵染不成熟的胚，从而使种子带上病毒。

该属大多数种传病毒的传毒方式是第一种途径，还有的病毒同时具有这两种途径（Ｍａｕｌｅ，１９９６），而大豆种传花叶病毒（ＰＳｂＭＶ）则是第二种途径的典型代表。

目前，对ＰＳｂＭＶ的种传机制进行了较为深入的研究。

在受ＰＳｂＭＶ侵染的大豆中，有多个寄主植物的基因和多种病毒编码的成份，如ＣＰ蛋白和ＨｃＰｒｏ蛋白等参与并决定了种子传毒的能力（Ｗａｎｇ，１９９５；Ｗａｎｇ，１９９６；Ｗａｎｇ，１９９８）。

在种子传毒的过程中，通过对病毒积累的空间分布的分析，Ｗａｎｇ等（１９９４）证明了ＰＳｂＭＶ的侵入途径是通过胚柄进入胚囊使种子带毒。

而胚柄是植物花的发育过程
中早期易被降解的组织，因此病毒运动的效率对不成熟种子的侵染是非常重要的。

６．植物的自然抗性与工程抗性
植物对马铃薯Ｙ病毒属病毒的侵染所表现的过敏性抗性（ＨＲ）大多数是由单一显性基凶控制的，而导致植物表现非过敏性抗性的基斟可能包括显性基凶、不完全显性基因和隐性基因。

在所有已知的对马铃薯Ｙ病毒属病毒抗性的基因中，约４０％是隐性的，而对其它病毒属来讲，隐性抗性基因不超过２０％。

有两个假说解释了隐性抗性的作用：（１）抗病寄主缺乏某一成分使得病毒不能完成致病过程，因此，显性等位基因编码了一个寄主因子，能使病毒的复制和运动在感病寄主中顺利进行。

（２）感病等位丛因编码了～个显性的负调控抗病性因子。

另外，还有多个抗病基因或多个相互作用的位点也能产生抗性，如Ｃａｒａｎｔａ等（１９９７）报道了胡椒植株中多个隐性基因能对马铃薯Ｙ病毒属中的几种病毒产生抗性。

最近，通过分析隐性抗性基因的作用机制，阐明了部分隐性基因的一些功能特性。

辣椒中的隐性抗病基因，和ｐｖｒ３分别阻止了ＰＶＹ和胡椒斑驳病毒（ＰｅｐＭｏＶ）粒体在植株体内的运动（Ａｒｒｏｙｏ，１９９６；Ｍｕｒｐｈｙ，１９９８）；辣椒中的隐性抗病基因Ｐ广和ｐｖｒｌ分别抑制了ＴＥＶ和ＰｅｐＭｏＶＲＮＡ的复制；豌豆中的隐性抗病基因ｓｂｍ一，对ＰＳｂＭＶＲＮＡ的复制也有抑制作用（Ｋｅｌｌｅｒ，１９９８）。

与此同时，人们对植物中与显性基因有关的抗病机制也有了新的认识，特别是对马铃薯植株中的抗病基因进行了深入的研究。

在带有觑，。

显性抗病基因的抗病马铃薯品种中，ＰＶＹ和ＴＥｖ侵入初期，病毒粒体的运动被阻止，而且病毒初期的运动很快启动了植株的过敏性抗病反应（Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，１９９８）。

通过分析病毒的无毒性和致病性株系之问所形成的重组杂合体，对病毒与植物抗性基因的互作研究，如ＰＳｂＭＶ／ｓｂｍ—ｆ，ＴＶＭＶ／ｖａ，大豆花叶病毒（ＳＭＶ）／Ｒｓｖ等，已取得了新的进展，鉴定出了一些与植株抗病基因相互作用的病毒作用位点。

在ＰＳｂＭＶ与豌豆植株抗性基因ｓｂｍ一，相互作用时，攻破ｓｂｍ一１抗性的病毒作用因子位于ＶＰｇ编码区，更确切的讲是位于ＶＰｇ中心区的１５个氨基酸所组成的片段（Ｋｅｌｌｅｒ，１９９８）；ＴＶＭＶ与烟草抗性基因Ｙａ的互作，也表明是ＴＶＭＶＶＰｇ编码区所起的作用（Ｎｉｃｏｌａｓ，１９９７）：Ｅｇｇｅｎｂｅｒｇｅｒ等（１９９７）用重组的大豆花叶病毒接种含显性抗病基因Ｒｓｖ的大豆植株，病毒攻破了Ｒｓｖ的抗病性。

进一步研究表明，攻破抗性的病毒作用位点是ＨｃＰｒｏ３７端部分片段和Ｐ３编码区的５’端部分片段。

而且，用只含有ＨｃＰｒｏ或Ｐ３编码区的重组病毒接种大豆植株时，都不能攻破Ｒｓｖ的抗性。

这表明只有ＨｃＰｒｏ和Ｐ３在一起时，／ｊ’能攻破这种单一显性基因。