用限制性酶切和Southern杂交对葡萄无核基因分子标记的分析
分子标记介绍
分⼦标记介绍分⼦标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋⽩质。
即DNA⽚段即能反映⽣物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA ⽚段；能受基因控制并且能够稳定遗传的，能代表个体或群体的遗传特征，并可被⽤作遗传分析的物质。
它能够直接反映基因组间DNA间的差异。
常⽤的分⼦标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、ISSR、EST等。
RAPD、AFLP属于以PCR为基础的分⼦标记；RFLP属于以Southern为基础的分⼦标记；SSR、ISSR属于以重复序列为基础的分⼦标记；EST以mRNA为基础的分⼦标记。
1 主要的分⼦标记介绍1.1 限制性⽚段长度多态性（RFLP）RFLP是应⽤Southern杂交技术检测DNA在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA⽚段的⼤⼩。
所以对于引起酶切位点变异的突变如点突变或部分DNA⽚段的缺失、插⼊、倒位⽽引起酶切位点缺失或获得等均可应⽤。
此⽅法的基本步骤包括：DNA的提取、⽤限制性内切酶酶切DNA、凝胶电泳分开DNA⽚段、把DNA⽚段转移到滤膜上、利⽤放射性标记的探针显⽰特定的DNA⽚段、分析结果。
探针⼀般选择单拷贝的。
其优点为共显性标记，稳定且可重复但耗时，昂贵且需应⽤同位素。
⽤该技术可作出植物的RFLP图谱，并应⽤于植物遗传和育种研究。
杨长红等采⽤PCR-RFLP技术，对库尔勒⾹梨等19个主要梨品种的cpDNA遗传多态性进⾏研究，其利⽤10对通⽤引物对总DNA进⾏扩增，并且采⽤7种限制性内切酶对PCR产物进⾏酶切，通过软件分析得出：7对引物（cp01、cp02、cp03、cp04、cp06、cp09、cp10）能在梨属植物上扩增出1条特异性谱带，cp09／MvaI，cp03／Hin6I的酶切位点有显著差异。
根据结果分析，库尔勒⾹梨与鸭梨、砀⼭梨、苹果梨、早酥、慈梨、⾦川雪梨、锦丰、新疆句句梨的平均距离系数较⼩，与其他梨的平均距离系数较⼤。
1.2 随机扩增多态性DNA(RAPD)RAPD是以8-10个碱基的随机寡聚核苷酸序列为引物，利⽤PCR技术⾮特异性扩增DNA⽚段，然后⽤凝胶电泳分开扩增⽚段，即得到⼀系列多态性DNA⽚段.染⾊后即可进⾏多态性分析。
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记1.分子标记技术及其定义1974年,Grozdicker等人在鉴定温度敏感表型的腺病毒DNA突变体时, 利用限制性内切酶酶解后得到的DNA片段的差异, 首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰富的多态性而发展起来的可直接反映生物个体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质分子。
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为基础的遗传标记。
分子标记技术本质上都是以检测生物个体在基因或基因型上所产生的变异来反映基因组之间差异。
2.分子标记技术的类型分子标记从它诞生之日起, 就引起了生物科学家极大的兴趣,在经历了短短几十年的迅猛发展后, 分子标记技术日趋成熟, 现已出现的分子标记技术有几十种, 部分分子标记技术所属类型如下。
2.1 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术(1) RFLP ( Rest rict ion Fragment Length Polymorphism)限制性内切酶片段长度多态性标记；(2) CISH ( Chromosome In Situ Hybridization) 染色体原位杂交。
2.2 以重复序列为基础的分子标记技术(1) ( Satellite DNA ) 卫星DNA；(2) ( Minisatellite DNA ) 小卫星DNA;(3) SSR( Simple Sequence Repeat ) 简单序列重复, 即微卫星DNA。
2.3 以PCR为基础的分子标记技术(1) RAPD ( Randomly Amplif ied Polymorphic DNA ) 随机扩增多态性DNA；(2) AFLP( Amplif ied Fragment Length Polymorphism) 扩增片段长度多态性；(3) SSCP( Single Strand Conformation Polymorphism) 单链构象多态性；(4) cDNA-AFLP( cDNA- AmplifiedFragment Length Polymorphism) cDNA -扩增片段长度多态性；(5) TRAP( Target Region Amplified Polymorphism) 靶位区域扩增多态性；(6) SCAR ( Sequence Char acterized Amplified Region) 序列特征化扩增区域；(7) SRAP ( Sequencerelated Amplified Polymorphism) 相关序列扩增多态性。
分子标记技术在葡萄属植物上的研究状况及进展【文献综述】
文献综述生物技术分子标记技术在葡萄属植物上的研究状况及进展摘要：分子标记技术则从DNA分子水平检测物种的遗传多样性，直接有效，是目前最为普遍采用的方法。
分子标记具有不受发育时期、组织类别、环境条件等因素干扰、多态性高、数量多、不影响目标性状表达连锁遗传现象的特点。
近年来，国内外许多学者利用分子标记技术对葡萄植物遗传多样性开展了不少研究。
本文简单叙述了分子标记分类和特点，以及它在葡萄属植物分子水平上的研究状况。
关键词：分子标记；葡萄属；研究进展葡萄是属于葡萄科（Vitaceae）葡萄属（Vitis.linn）植物，落叶木质藤本，在园艺学分类上属于浆果、多年生落叶木本藤蔓植物[1]。
葡萄浆果的营养成分丰富，含有碳水化合物、配糖类、矿物质、酶、含氮有机物、无氮有机物、维生素、有机盐、生物催化剂等；在医疗保健上葡萄有补肾、降压、开胃的功效，对预防治疗神经衰弱、心血管疾病等疾病都有显著的效果。
葡萄起源于黑海和地中海沿岸，在长期的进化和栽培历史中形成了许多种群和品种。
现在世界上存在的葡萄品种大约有14000种[2]。
葡萄属分为两个亚属：圆叶葡萄亚属（Muscadina Planch）和真葡萄亚属（Euvitis Planch）。
在我国，葡萄属植物从海南岛到大兴安岭，从西藏高原到东海之滨均有分布，其分布之广，产量之大，种类之多，特性之丰富，在全世界各国是少有的[3]。
品种鉴别时葡萄研究和生产实践的重要环节之一，但葡萄是无性繁殖，且品种交流频繁产生一些中间型和过渡性杂种，给葡萄的分类鉴定带来困难[4]。
1分子标记的概述1.1 分子标记的分类作物遗传多样性研究是通过使用一些遗传标记就行作物种质资源的遗传多样性检测。
目前，遗传标记主要有四大类分别是：形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记。
分子标记(Moleculem arket)是指与特定基因或标记连锁的一段经过扩增并可检测出的DNA序列。
DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为两大类。
DNA分子标记技术在水产动物中的研究综述
DNA分子标记技术在水产动物中的研究综述摘要：分子生物学的飞速发展及其各项技术的广泛应用,对水产动物的研究工作产生了很大的影响.DNA分子标记在水产动物研究中的广泛应用,对于优良品种的选育、亲缘关系和品系家系的鉴定、重要经济性状基因的定位克隆以及大规模疾病的防治有重要的作用。
关键词：DNA分子标记；RFLP；RAPD；AFLP；水产动物近年来，由于物种种质退化、病害频繁、养殖环境恶化等问题，严重制约了水产养殖业的发展。
将分子标记技术广泛的应用到水产动物研究，不仅有利于选育优良品种和对养殖品种的遗传改良、野生种质资源的恢复、保护，而且还有利于防止种质退化，使水产动物养殖走上健康养殖的道路。
当前，RFLP、RAPD、AFLP 和微卫星DNA等分子标记技术，已被广泛地应用到水产动物遗传育种、疾病检测及系统发育领域的研究中。
1DNA分子标记技术DNA分子标记技术是以基因组DNA的多态性为基础的一种新型遗传标记技术，它可以直接反映生物个体在DNA水平上的差异。
与传统的遗传标记相比，DNA 分子标记具有标记位点多、遗传信息量大、实验重复性强、不受生物的年龄、发育阶段、性别和养殖环境条件的影响等特性，因此倍受遗传学家和育种学家的青睐，已被广泛地应用于生物的基因定位、基因克隆、遗传育种等诸多方面，并成为分子生物学与分子遗传学研究的主要内容之一。
如今，应用于遗传育种领域的DNA分子标记技术主要有：RFLP；RAPD；AFLP；微卫星DNA。
2 几种DNA分子技术在水产动物中的研究进展2.1 RAPD标记2.1.1 RAPD标记的原理及其特点RAPD即随机增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA），是在PCR 基础上发展起来的一项分子标记技术，是由美国科学家J.Williams和J.Welsh 两个研究小组于1990年几乎同时建立的。
基本原理是用一系列（通常为数百个）不同的碱基顺序随机排列的寡核苷酸单链（一般10bp）作为引物，对所研究的基因组DNA进行PCR扩增。
基于转录组和基因组的葡萄无核分子机制及无核相关基因功能研究
基于转录组和基因组的葡萄无核分子机制及无核相关基因功能研究摘要葡萄(Vitis spp.) 是世界第二大水果，无核葡萄更是为现代鲜食消费和制干产业所青睐，无核葡萄因而成为适应市场和产业发展的育种方向，具有极大的研究价值。
目前，葡萄无核分子机制尚未明晰，无核关键基因也有待继续挖掘，鉴于此，本研究以有核葡萄‘红地球’与无核葡萄‘森田尼无核’的杂交分离后代群体为材料，开展了杂交有核、无核葡萄后代胚珠发育3个关键时期的转录组分析，并采用混样测序策略对葡萄无核亲本‘森田尼无核’、有核亲本‘红地球’及其杂交有核、无核后代植株进行基因组重测序，并将转录组与基因组测序结果相结合对葡萄无核机制进行探究；同时系统地从进化和表达模式方面分析葡萄MADS-box基因家族，克隆了2个无核相关基因，并进行初步功能验证。
获得的主要结果如下：1、通过对有核葡萄‘红地球’与无核葡萄‘森田尼无核’的杂交有核、无核葡萄后代进行胚珠发育的质量监控，确定胚珠发育的3个关键时期。
将所选取时期的杂交有核、无核葡萄后代各5株进行胚珠极端性状混合池转录组测序，共获得6607个显著差异表达基因，并从差异基因涉及的表达模式、基因本体注释、生物学过程富集、代谢路径富集、激素响应及表观调控等方面进行多角度的分析。
发现杂交有核、无核葡萄后代胚珠发育的差异主要集中在种皮发育、胚乳发育、激素平衡、表观遗传调控及胚珠身份基因复合物形成方面。
激素水平测定发现CTK含量在有核葡萄后代胚珠显著高于无核后代，GA、IAA和ABA含量则在无核葡萄后代胚珠显著高于有核后代。
基于模式植物拟南芥种子发育的相关研究，从种皮发育、胚乳发育及胚珠发育基因复合物形成这3个主要方面绘制了葡萄胚珠发育差异基因的网络调控图。
2、以有核葡萄‘红地球’与无核葡萄‘森田尼无核’的杂交有核、无核葡萄后代叶片混合池为材料，通过基因组测序鉴定到大量的功能性变异位点。
通过结合杂交有核、无核葡萄后代胚珠发育的转录组数据，发现含有功能性变异位点的差异表达基因包括抗病蛋白、蛋白激酶、转录因子、细胞色素P450、纤维素相关蛋白及钙调蛋白等种子发育相关因子。
Southern印迹技术应用与注意事项
目 录
• southern印迹技术概述 • southern印迹技术的应用 • southern印迹技术的操作步骤 • southern印迹技术的注意事项 • southern印迹技术的优缺点
01 southern印迹技术概述
定义与原理
定义
Southern印迹技术是一种用于检测DNA片段在凝胶电泳后转移到膜上的分子 生物学技术。
基因突变检测
突变位点的确定
根据研究目的确定需要检测的 基因突变位点。
探针制备
针对突变位点设计特异性探针 ，可以是放射性或非放射性标 记。
杂交反应
将探针与固定在膜上的DNA片 段进行杂交，形成探针-DNA复 合物。
信号检测
通过放射自显影或荧光检测等 方法，检测杂交信号，确定是
否存在突变。
基因表达谱研究
限制性酶切和Southern转移
探针杂交
对处理后的DNA进行限制性酶切和凝胶电 泳分离，然后进行Southern转移。
使用甲基化特异性探针进行杂交，检测甲 基化状态。
03 southern印迹技术的操 作步骤
样本准备
01
02
03
样本类型
DNA样本，通常为基因组 DNA或PCR产物。
样本浓度
确保DNA浓度适中，过高 或过低都会影响电泳效果。
对实验条件要求高
需要精确控制电泳和杂交条件，否则可能导致实验失败。
与其他技术的比较
与Northern印迹技术比较
两者都是检测基因表达的重要手段，但Northern印迹技术主要用于检测RNA，而 Southern印迹技术主要用于检测DNA。
与PCR技术比较
PCR技术是一种扩增特定DNA片段的方法，而Southern印迹技术主要用于检测和分析 DNA片段。PCR技术更适用于DNA的快速扩增和定性分析，而Southern印迹技术更适
分子标记辅助选择讲解
第十七章分子标记辅助选择育种传统的育种主要依赖于植株的表现型选择(Phenotypieal selection)。
环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素会影响表型选择效率。
例如抗病性的鉴定就受发病的条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择、鉴定工作更困难。
一个优良品种的培育往往需花费7～8年甚至十几年时间。
如何提高选择效率，是育种工作的关键。
育种家在长期的育种实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。
遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。
棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的紫色叶鞘等形态性状标记，在育种工作中曾得到一定的应用。
以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的细胞学标记，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。
生化标记主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上反映基因型差异。
它们在小麦、玉米等作物遗传育种中得到应用。
但是它们多态性低，且受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件等影响，难以满足遗传育种工作需要。
以DNA多态性为基础的分子标记，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是分子标记辅助选择(molecular marker-as—sisted selection，MAS)育种更受到人们的重视。
第一节分子标记的类型和作用原理一、分子标记的类型和特点按技术特性，分子标记可分为三大类。
第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，主要有限制性片段长度多态性标记(Restriction fragment length polymorphisms，RFLP标记)；第二类是以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR反应)为基础的各种DNA指纹技术。
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法
Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。
一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量[1-2]。
Southern印迹杂交显色图片Southern印迹杂交技术是分子生物学领域中最常用的具体方法之一。
其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。
但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。
有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。
Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。
southern印迹杂交原理流程图早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。
印迹方法如电转法、真空转移法；滤膜发展了尼龙膜、化学活化膜（如APT、ABM纤维素膜）等。
利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析（RFLP）等。
甲萘酚-联苯胺染色法生活力强的花粉染成深红色，生活力弱的花粉染成浅红色，无生活力的花粉则不着色。
现代生物技术在葡萄种质资源、品种改良研究中的应用
培葡萄品种进行 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 分析，从 图。目前在葡萄属植物上构建遗 Ｂ７２－２１６ × Ｂ４５－１８７ 的 ６１ 个杂交
中选出可重复带型，可正确区分 传连锁图谱的研究正不断深入。 后代进行 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 分析，获得了与
所有品种的无性系等。Ｌｏｕｒｅｉｒｏ ２．３ 目标性状连锁基因标记
葡萄无核基因连锁的 Ｄ Ｎ Ａ 多态
植物组织培养是利用植物体 的器官、组织或细胞，通过无菌 操作接种于人工培养基，在一定 的光照和温度条件下进行培养， 使之生长、发育的技术［１ 、２］ 。植物 每个细胞都具有该植物全部遗传 信息和发育成完整植株的能力，
即“植物细胞全能性”——为植 物组织培养提供了理论依据。植 物组织培养根据外植体的来源和 培养目标的不同分为器官培养、 胚培养、花药培养、细胞培养、原 生质体培养等类型。
株，而且叶柄外植体的体细胞胚 陈香波、曹孜义（２０００）从胚培
形成率高于叶片外植体［７］。１９９５年 育的角度出发，在胚发育时期，培
罗耀武等用 ０．２％ 秋水仙素溶液对 养基激素条件对葡萄胚直接萌发
葡萄二倍体玫瑰香葡萄品种植株 成苗和胚状体成苗两条途径的影
的生长点进行 ４５ 小时处理，获得 响进行了研究［８］。
等（１９９３）报道了从葡萄叶片外植 养基上获得幼苗，结果表明，较
体，在 ＮＮ 附加 ６ － Ｂ Ａ、Ｎ Ａ Ａ 的固 体培养基上诱导出体细胞胚，并 进一步诱导出形态正常的完整植
适宜胚发育的培养基是 Ｂ ５ 和 Ｎｉｔｓｃｈ 为基本培养基，附加ＧＡ３０． ２ｍｇ／ｌ、ＩＡＡ１．５ｍｇ／Ｌ、ＩＴ１．０ｍｇ／Ｌ。
１９
ＳINO-OVERSEAS GRAPEVINE & WINE
试验研究
用 Ｒ Ａ Ｐ Ｄ 技术在幼苗期鉴定圆叶 室用美洲种杂种组合为材料构建 将显著提高葡萄育种效率，缩短
分子标记特点和应用
分子标记技术方法和他们特点1、限制性片段长度多态性标记分析(Re striction Fragment Length Polymorphism，RFLP)—RFLPRFLP技术的是检测DNA 在限制性内切酶酶切后形成的特定DNA 片段的大小。
因此凡是可以引起酶切位点变异的突变如点突变(新产生和去除酶切位点) 和一段DNA 的重新组织(如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化) 等均可的产生RFLP技术特点：RFLP技术优点：①结果稳定，重复性好，特别是PCR-RFLP（CAPS）由于是特定引物扩增，退火温度高，因而假阳性低，可靠性更高。
②是一种共显性标记，可区分纯合体与杂合体，数据多态信息量大，不受显隐性关系、环境条件、发展阶段及组织部位影响。
③RFLP标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发育阶段的影响，具有个体、种、属及各种各层次水平的特异性。
④核基因组的RFLP标记表现为孟德尔的共显性遗传，而细胞质基因组的RFLP一般表现为母性遗传。
RFLP技术缺点：①分析所需DNA量较大，分析速度慢。
②步骤较多，周期长，技术复杂，费用高。
③检测多态性水平过分依赖限制性内切酶，使多态性降低，对DNA质量要求高。
④检测中需放射性物质，限制了广泛应用。
⑤对于线粒体DNA而言，因为其进化速度快，影响种以上水平的RFLP分析的准确性。
但是种以上水平影响很小。
2.随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphism DNA）—RAPD以单一的随机引物(一般为10个碱基)利用PCR技术随机扩增未知序列的基因组DNA获得的DNA片段长度变异。
它是利用随机引物通过PCR反应非定点扩增DNA片段，然后用凝胶电泳分析扩增产物DNA片段的多态性。
RAPD技术特点：RAPD优点：①无种属特异性,一套RAPD引物可以应用于任意一种生物的研究，具有广泛和通用的特点。
②适合于自动化分析。
操作技术简单，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术，省工省力和工作进度快。
分子标记技术的类型及其原理
分子标记技术的类型及其原理08农生1班陈耀光 200830010403所谓分子标记就是基于基因组DNA 存在极其丰富的多态性而发展的一类可以直接反映生物个体间DNA 水平上差异的新型的遗传标记方法。
在遗传学发展过程中，先后出现了形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记，其中以分子标记最为理想、可靠，因为DNA分子中碱基的缺失、插入、易位、倒位或是长短与排列不一的重复序列等产生的差异，都可以通过分子标记进行检测。
DNA 分子标记较以往的形态标记其优越性表现在：(1)以核酸为研究对象，不受季节、环境限制，不存在基因表达与否的问题，也没有组织或器官特异性；(2)数量的丰富性，遍及整个基因组，标记的数量几乎是无限的；(3)多态性高，自然存在丰富的等位变异；(4)许多标记表现为共显性，能很好地鉴别纯合基因型与杂合基因型；(5)检测手段简便、快速，并且重复性好；(6)既不对目标形状的表达造成影响，也不会与不良性状之间产生必然的关联。
1 分子标记的类型及其原理分子标记技术自诞生以来，短短的几十年时间中得到突飞猛进的发展，至今被发展和利用的分子标记技术已有二十余种，为不同研究领域提供了有效的技术手段，同时也发挥着至关重要的作用。
目前，根据对DNA 多态性检测手段和所应用序列范围的不同，对部分分子标记技术分类如下。
1.1 基于全基因序列的分子标记RFLP (restriction fragment length polymorphism,限制性片段长度多态性)：RFLP 作为最早发展的分子标记技术由Grozdicker 等于1974 年创建，并由Bostein 等再次提出。
RFLP 技术的出现开创了直接在DNA 水平上进行遗传研究的新时代。
其基本原理是：基因组DNA中限制性内切酶所识别的序列由于出现碱基变化而致使酶切位点的数量也变化，从而使酶切片段长短发生差异产生长度多态性。
利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因组DNA，由于不同个体中酶切位点的差别就得到了长短相异的片段DNA，电泳分离后，借助Southern 杂交将DNA 片段转移至硝酸纤维素膜上，将具有放射性标记的探针与膜上的片段杂交，通过放射自显影技术就可以获得显示物种特异性的多态性图谱。
Southern杂交分析原理和操作
Southern杂交分析原理和操作【原理】Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上,与标记的核酸探针进行杂交,在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
一．基因组DNA的限制酶切【操作】DNA (1μg/ml)20μg、10×酶切buffer5.0μl、限制性内切酶(lOU /μl) 5.0μl、加ddH2O至50μl,在最适温度下消化1～3h。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好,可以延长消化时间,但超过6h己没有必要。
或者放大反应体积,或者补充酶再消化。
如仍不能奏效,可能的原因是DNA样品中有太多的杂质,或酶的活力下降。
消化后的DNA 加入1/10体积的0.5mol/L EDTA,以终止消化。
然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提,2.5倍体积乙醇沉淀,少量TE溶解(参见DNA提取方法,但离心转速要提高到12000g,以防止小片段DNA的丢失)。
如果需要两种酶消化DNA,而两种酶的反应条件可以一致,则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致,则先用需要低离子强度的酶消化,然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度,再加第二种酶进行消化。
二．基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳【操作】1.制备0.8%凝胶一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2. 电泳电泳样品中加人6×Loading缓冲液,混匀后上样,留一或两泳道加DNAMarker。
1～2V/cm,DNA从负极泳向正极。
电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时,停止电泳。
取出凝胶,紫外灯下观察电泳效果。
在胶的一边放置一把刻度尺,拍摄照片。
正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带,照片摄人刻度尺是为了以后判断信号带的位置,以确定被杂交的DNA长度。
三．DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物【操作】1.碱变性室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
分子标记的发展及分子标记辅助育种
分子标记的发展及分子标记辅助育种分子标记是一种分子生物学技术，利用分子标记可以对生物体进行精确的鉴定和分类，从而为种质资源的收集、保存和利用提供了科学依据，也为育种研究提供了有力的工具。
在过去的几十年里，分子标记在植物和动物育种中的应用得到了快速的发展，并取得了显著的成果。
分子标记的发展始于20世纪80年代初，当时人们发现了一种短序列的DNA片段可以在不同个体之间显示出遗传多样性，这是由于这些DNA片段的序列差异引起的。
这些DNA片段被称为分子标记，通过对它们进行分析可以对个体之间的遗传关系和遗传多样性进行研究。
最早被应用的分子标记技术是限制性片段长度多态性（RFLP），它通过酶切基因组DNA并利用凝胶电泳分析鉴定目标DNA片段。
随着技术的不断进步，研究者们开发了更多的分子标记技术，如随机扩增多态性DNA（RAPD）、简单重复序列（SSR）、单核苷酸多态性（SNP）等。
这些技术的应用使得分子标记研究更加快速、精确和可行，并且具有较高的标记密度和遗传显著性。
分子标记辅助育种是一种利用分子标记技术辅助繁殖和选育目标生物种的育种方法。
通过对目标性状的分子标记进行检测和分析，可以提高育种效率和精确性。
分子标记可以用来鉴定和筛选出具有良好性状的亲本，进行遗传多样性分析，生成遗传地图，以及进行分子辅助选择等。
分子标记辅助育种可以节省时间和人力，并且提高了育种的预测能力和成功率。
在植物育种中，分子标记辅助育种已经取得了显著成果。
例如，通过利用分子标记鉴定具有抗病性的基因或性状，育种者可以选择更适应特定环境或具有更好品质的材料，从而加速育种进程。
此外，分子标记辅助选育还可以用于配制亲本材料，避免不受欢迎的亲缘关系交配，从而提高杂交育种的成功率。
在动物育种中，分子标记辅助育种也得到了广泛应用。
例如，通过对动物基因组进行分子标记分析，可以提高畜禽在繁殖、营养和抗病等方面的性能。
另外，分子标记辅助选择还可以用于肉用动物的品质评估和选育，对于提高畜禽产品的品质和市场竞争力具有重要意义。
葡萄无核基因分子标记及应用
葡 萄胚败育 的过 程 中起关 键 的作用 。有 关无 核基 斟 的 论述先后经历 了单 性基因说 、 互补显性基 因说 。 、 多
隐性基 因 “ 、 单 隐性说 与数量性 状说 。 等 ， ‘ 随 着
对 无 核 基 因研 究 的 深 入 ， 可 以初 步得 出 ， 葡 萄 多 个 基 因
前 应用 较 多 的是 胚 挽 救 技 术 ， 该技 术 的 出现 有 效 解 决 了 无 核 葡 萄 育种 中母 本 只能 为有 核 品 种 的 问 题 ， 大 幅 度 伴侣蛋 白基因 ２ １ ， 对番茄和烟草中的该基 因沉默后 可导
葡 萄 Ｂ Ｐ１ 钙 结 合 蛋 白基 因 对 胚 珠 的 发 育 有 一 定 的 影 响， 随 后将 该 基 因 转 入 番 茄 中 示， 番 茄 种 子 明 显 变 少： Ｍｅ ｊ ｉ ａ 等［ ７ 研 究 示 Ｖ ｖ Ａ Ｇ Ｌ１ １ 基 因 在 种 子 败 育 无 核
高 了育种效率 ， 但依然面临胚挽救 育种过程 中胚的发育
世界葡 萄 与葡萄酒组 织公布 数据 显示 ． ２ ０ ０ ０ ￣２ ０ １ １
年， 世界鲜食葡萄的产量由 １ ５ ２ ０ 万 ｔ 增加到 ２ ２ ３ ０ 万 ｔ ．
制； 为确 定无 核性 状 是 由哪些 基 因所 控 制 ， Ｕｒ ｉ 等 。以
Ｉ ＇ ｈ ｏ ｍｓ ｏ ｎ ｓ ｅ ｅ ｄ ｌ ｅ ｓ ｓ ’ 及 其有 核 芽变 为材 料 ， 通 过 对 不 同 发
效 的排除有核后代 ， 加速无核 葡萄育种进程 。该文主要 从葡萄无核标记 的研 究进展 、 在科研 实践 中的应 用、 存在 问题 以及 未来发展方 向等研 究进行 了综述。 关键词 ： 葡萄 ； 无核 ； 分子标记 ； 育种
葡萄无核基因SCAR标记的序列构成与酶切分析
ｓｎ ｅｉｉｇｔｅｓ ｅ ｉｃＰ ｒｎ ｒ ａ ｄｔｅｐｏ ｅｆｒｄ ｌｃ ｎ ｒｐ ｅ ｄｅｓ ｅｓｂ ｔ ｒｅ ｉｇｍａｅｉｌ ａ ｄｉｅ ｔ — ｙ ｔ ｓｚｎ ｐ ｃｆ ＣＲ ｐｈ ｅｓ ｎ ｒｂ ｅｅ ｆ ｇ ａ ｓｅ ｌｓｎ ｓ ｏｈｉ ｂｅ ｄｎ ｔｒ ｓｎ ｎｉ ｈ ｈ ｉ ｈ ｏ ｉ ｇ ｅ ｎ ａ ｄ ｉ ｆ
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采用 自动 荧光 Ｄ Ａ 测 序 仪对 该 片段 的 棱苷 酸 组 成 进 行 双 向刮 序 ， 自无 桉 白 的无 核 基 因 特异 标 记 由 ５ ９对 核 Ｎ 来 ６
利用叶绿体基因组的分子标记鉴定植物种类
利用叶绿体基因组的分子标记鉴定植物种类植物的分类学是植物学中非常重要的一个领域，研究植物分类有助于我们更好地了解和利用植物。
在传统的植物分类学中，主要是根据形态、解剖、生理等方面的差异来分类。
但是，随着分子生物学的发展，利用分子标记来鉴定植物已经成为一种越来越流行的方法。
其中，利用叶绿体基因组的分子标记鉴定植物种类的研究已经取得了很大的进展。
一、叶绿体基因组的特点叶绿体是植物细胞中负责光合作用的细胞器，其形态和大小多样，但通常呈现圆柱形。
叶绿体拥有自己的遗传物质，即叶绿体基因组。
与细胞核DNA相比，叶绿体基因组具有以下几个特点：1. 叶绿体基因组是环状DNA分子，大小在120-160 kb左右，具有一定的稳定性和不同的特点序列；2. 叶绿体基因组有数百个基因，其中大部分编码光合作用和其他代谢途径所需的蛋白质，另外还包括一些RNA和调控元件等；3. 叶绿体基因组存在着较高的突变率，这种变异可以通过细胞分裂和性繁殖传递到下一代，是物种进化中的重要因素之一。
二、利用叶绿体基因组的分子标记鉴定植物种类基于叶绿体基因组的分子标记主要分为两类：一类是限制性酶片段长度多态性（RFLP）分析，另一类是序列标记。
1. RFLP分析RFLP分析是将叶绿体基因组DNA进行限制性酶酶切，得到一系列的DNA片段，然后通过凝胶电泳等方法进行分析。
由于不同物种叶绿体基因组中的限制性酶切位点不同，因此不同物种的RFLP图谱也就不同。
研究表明，通过RFLP分析可以鉴定植物的物种、属、亚种等分类单元，具有很高的可靠性和准确性。
2. 序列标记序列标记是利用PCR方法扩增叶绿体基因组中的特定序列，并通过测序或基于PCR的测序方法对所扩增的序列进行分析，以得到不同物种的差异性标记。
序列标记可以分为cpDNA序列标记和基于PCR的序列标记两种类型。
其中，cpDNA序列标记包括rbcL、matK、trnL-F等叶绿体基因或非编码序列，已经成为植物演化和分类学研究中最常用的序列标记。
用限制性酶切和Southern杂交对葡萄无核基因分子标记的分析
农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2005,13():*基金项目：国家自然科学基金(No.30040036)资助。
黄海青:男，1976年生，硕士研究生。
**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<yzwang@>.收稿日期：2004-02-07接受日期：2004-04-26·研究论文·用限制性酶切和Southern杂交对葡萄无核基因分子标记的分析*杨克强1,2王跃进1*张今今1,3王西平1万怡震1张剑侠1(1.西北农林科技大学农业部西北园艺植物种质资源与遗传改良重点开放实验室，杨陵712100;2.山东农业大学林学院，泰安271018；3.陕西师范大学生命科学院，西安710062）摘要：对葡萄()无核基因特异标记39970524-5-564和39970524-6-1538的DNA序列进行了克隆和测序，其序列全长分别为564和1538bp，GenBank登陆号为AY327513和AY327514。
用Wingene231DNA分析软件对39970524-5-564和39970524-6-1538序列的限制性内切酶酶切位点进行了分析，可识别6个碱基及其以上序列的酶切位点分别有30和131个；RⅠ和dⅢ在39970524-5-564特异标记上没有酶切位点，而RⅠ在39970524--6--1538第135个碱基处有一个酶切位点，dⅢ在39970524-6--1538上没有酶切位点。
用39970524-5-564DNA作探针对葡萄基因组DNA作Southern杂交，结果在无核亲本红光无核及无核基因供给者无核白和无核杂种上出现杂交带，而且呈单拷贝，而在有核亲本红地球及有核杂种上未出现杂交带，进一步证明了39970524-5-564特异片段来源于无核葡萄基因组，为检测和克隆葡萄无核基因提供了证据。
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农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2005,13():*基金项目：国家自然科学基金(No.30040036)资助。
黄海青:男，1976年生，硕士研究生。
**通讯作者。
Author for correspondence.E-mail:<yzwang@>.收稿日期：2004-02-07接受日期：2004-04-26·研究论文·用限制性酶切和Southern杂交对葡萄无核基因分子标记的分析*杨克强1,2王跃进1*张今今1,3王西平1万怡震1张剑侠1(1.西北农林科技大学农业部西北园艺植物种质资源与遗传改良重点开放实验室，杨陵712100;2.山东农业大学林学院，泰安271018；3.陕西师范大学生命科学院，西安710062）摘要：对葡萄()无核基因特异标记39970524-5-564和39970524-6-1538的DNA序列进行了克隆和测序，其序列全长分别为564和1538bp，GenBank登陆号为AY327513和AY327514。
用Wingene231DNA分析软件对39970524-5-564和39970524-6-1538序列的限制性内切酶酶切位点进行了分析，可识别6个碱基及其以上序列的酶切位点分别有30和131个；RⅠ和dⅢ在39970524-5-564特异标记上没有酶切位点，而RⅠ在39970524--6--1538第135个碱基处有一个酶切位点，dⅢ在39970524-6--1538上没有酶切位点。
用39970524-5-564DNA作探针对葡萄基因组DNA作Southern杂交，结果在无核亲本红光无核及无核基因供给者无核白和无核杂种上出现杂交带，而且呈单拷贝，而在有核亲本红地球及有核杂种上未出现杂交带，进一步证明了39970524-5-564特异片段来源于无核葡萄基因组，为检测和克隆葡萄无核基因提供了证据。
关键词：葡萄;无核基因;限制性酶切分析;Southern杂交Analysis of the DNA sequences of molecular markers linked to grapeeedlessness gene by restriction enzyme and Southern blottingYANG Ke-Qiang1,2WANG Yue-Jin1ZHANG Jin-Jin1,3WANG Xi-Ping1WAN Yi-Zhen1ZHANG Jian-Xia1()DNA molecular markers linked to grape(L.)seedlessness gene:39970524-5-564and39970524-6-1538 derived from Flame Seedless were retrieved from agarose gel and ligated into the pGEM R-T Easy Vector System,and then trans-formed into DH5α.Sequencing of positive clones was carried out and the result demonstrated that the 39970524-5-564was564bp and the39970524-6-1538was1538bp.The sequences data have been submitted to GenBank.The Gen-Bank accession numbers were AY327513and AY327514,respectively.The restriction-sites of the sequences of the39970524-5-564 and39970524-6-1538were analyzed by software'Wingene231'.The results showed that30restriction enzymes with recognition sites of equal or greater than6bases long had been cutting sites on the sequences of39970524-5-564and131restriction enzymes had cut-ting sites on the sequences of39970524-6-1538.No cutting sites on the sequence of39970524-5-564were found by RⅠand dⅢ;but there was one cutting site at135bp of the sequence of39970524-6-1538by RⅠand no cutting site on this sequence by dⅢ.The39970524-5-564DNA labeled was used as a probe for Southern blotting with genomic DNA from Red Globe,Flame Seedless,Thompson Seedless,4seedless hybrids and3seeded hybrids.One band revealed a unique fragment presented in all seedless individuals but absents from all seeded individuals.It suggested that specific marker39970524-5-564corresponded to a single copy sequence in the grape genome农业生物技术学报2005年linked to the major seedlessnessgene.grape();seedlessness gene;molecular marker;restriction enzyme;Southern blot无核性状是葡萄重要的经济和商品性状,王跃进等(1996)用RAPD技术采用BSA法，获得了与无核主效基因相关的RAPD标记UBC-269450。
经对UBC-269450测序，其长度为484bp，因此RAPD标记UBC-269450应改为UBC-269484(王跃进等，1997)。
王跃进等(2002)根据UBC-269484的序列合成了2个寡聚核苷酸引物，当用18bp（5'-CCAGTTCGCC-CGTAAATG-3'）引物对获得UBC-269484标记原组合的亲本和无核杂种后代进行PCR扩增时，可以扩增出约590bp片段,即为无核基因的携带者和表达者；进一步用18bp引物对其原始无核祖先无核白和国际商业化无核品种及C78-47×B52-122杂交组合的后代进行PCR扩增,凡拥有约590bp片段的均为葡萄无核基因的携带者和无核性状的表达者,18bp寡聚核苷酸具有检测葡萄无核基因探针的作用,命名为检测葡萄无核基因的探针1号(GSLP1)。
18bp引物已做为检测葡萄无核基因的分子探针申请了专利(专利号为ZL97100615.6)。
本研究对这2个标记的DNA片断回收和测序，并对其序列进行了限制性酶切和Southern杂交分析。
1试材和方法1.1植物材料所用植物材料为葡萄()红地球、红光无核、无核白以及红地球(有核)×红光无核(无核)杂交组合的F1共7株。
1.2仪器PCR仪为PTC-100型，台式低温高速离心机为Eppendorf centrifuge5415D型，台式常温高速离心机为Eppendorf centrifuge5417R型，立式灭菌锅为Tomy SS-325型，纯水仪为Milli-Q型，电泳仪为DYY-Ⅲ-8B型，紫外观察仪为ZF型。
1.3试剂DNA回收纯化用Sangon公司UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒；特异片段的克隆用Promega公司pGEM R-T Easy Vector System试剂盒；质粒的回收纯化用Sangon公司UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒；Southern杂交用Roche公司Dig DNA Labeling and Detection试剂盒；限制性内切酶R Ⅰ购自Promega公司，dⅢ购自Sangon公司。
其它试剂分别购自Sangon、Takara、华美和Sigma公司。
1.3方法1.3.1葡萄基因组DNA的提取参照王跃进等(1997)的方法。
1.3.2特异标记DNA片段的回收按照UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒的说明操作。
1.3.3特异标记DNA片段的连接、转化参照李德葆等(1994)的方法和pGEM-T Easy Vector Sys-tem试剂盒说明进行。
转化质粒经酶切和PCR法鉴定后，阳性克隆用Sangon公司UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒回收纯化，送Sangon公司测序。
所用测序仪器为ABI PRISM377-96，测序试剂为Big Dyeterminator，用双脱氧终止法测序，从测序引物3'端之后第1个碱基开始测序。
1.3.4特异片段DNA序列的限制性酶切分析用WinGene231DNA(/)分析软件完成。
1.3.5Southren杂交用PCR反应法制备探针，RⅠ和dⅢ双酶切基因组DNA。
具体步骤安照Dig DNA Labeling and Detection Kit试剂盒的说明。
2结果和分析2.1葡萄无核基因特异标记DNA片段的克隆与测序结果从红光无核PCR扩增产物中，用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒，从凝胶上回收了39970524-5-564和39970524-6-1538特异标记DNA 片段。
回收片段连接到PGEM R-T Easy Vector，转化于DH5α，在含有Amp(100μg/mL)和涂布有X-Gal/IPTG的LB平板上培养进行蓝白斑筛选。
图1.重组质粒酶切和PCR鉴定结果Fig.1.Identification of recombinant plasmids by restriction en-zyme RⅠand PCR respectivelyM,PCR marker;1、2,39970524-5-564和39970524-6-1538片段酶切;3、4,39970524-5-564和39970524-6-1538片段PCR。