哮喘致敏小鼠模型的建立及脾脏CD4+T细胞的分离
(参考课件)OVA诱导小鼠过敏性哮喘模型的建立
（4）、相关研究表明，卵白蛋白（OVA）容易引起BABL/c小鼠产生 气道高反应性和血清中IgE超敏反应的过敏反应 [1]。并且雌性BABL/c 小鼠的炎症反应更加显著，
研究进展
1.2 致敏原的选择
选择用尘于螨制的作话过价敏格性昂支贵气；管哮喘动物模型的致敏原主要有卵 白若蛋是白病、毒真和菌真孢菌子则、制尘成螨哮、喘蟑模螂型变虽应为原临等床。中在通制过作控哮制喘病模原型体感 的染过而程控中制，哮选喘择发不生同提的供致依敏据原，基但本其都稳能定制性作较出差各，种其不致同敏的的哮机制 喘还模需型要，进但一是步几的乎研每究个；致敏原都有自己自身的缺点。 蟑螂变应原、花粉以及职业性致敏原等由于种类繁多、模型制 作很难标准化而使模型的复制变得非常复杂，因此在制作哮喘 模型的过程中很少选择； 虽然选择使用OVA作为致敏原，很难制作出重症哮喘模型，然 而，OVA具有易于获得、免疫原性强、相关试剂可选择性大等 特点，作为经典抗原，常与特定的佐剂联合使用。
OVA诱导小鼠过敏性哮喘模型的建立
1
Content (目录)
研究 进展
重要 性
病因 病机
治疗 方法
研究 总结
研究 进展
3
研究进展
近年来，随着社会工业化进程的加快，人们生活水平的 提高，过敏性哮喘患者的数量呈上升趋势，研究者们也将如 何治疗过敏性哮喘作为了一个重要的研究方向。为了研究过 敏性哮喘的病因、发病机制和探索相应的治疗方法，因此对 过敏性哮喘动物模型的建立尤为重要。本次实验的目的是建 立BABL/c小鼠过敏性哮喘模型。
人源化小鼠模型的构建及其相关医学应用
专题论述20238261人源化小鼠模型的构建及其相关医学应用侯宗昊，王 馨，陈姝彤，张若文#（北华大学基础医学院，吉林吉林 132000）摘要：在过去近四十年中，在生物医学研究中，人源化小鼠模型的发展和普遍应用，极大地加速了将基础研究成果转化为临床潜在诊断和治疗策略的速度。
人源化免疫系统重建的技术发展随着人源化小鼠模型的进步而得以提高，并且构建模型的技术手段也日趋成熟。
肿瘤免疫治疗已经迎来了新时代，人源化小鼠模型已经成为了有效的研究工具，主要应用在评估新疗法、指导免疫治疗以及研究组合疗法中，并且其在肿瘤免疫治疗研究中应用有望推进临床治疗的发展，为临床治疗前的研究提供有效的研究工具。
关键词：人源化小鼠；肿瘤；免疫系统；小鼠模型中图分类号：Q95 文献标志码：B 文章编号：1003-8655（2023）08-0082-03癌症的治疗方法已经由手术，放化疗和靶向治疗的传统方法迈入了免疫治疗的新阶段。
人类和动物基因的相似水平比较高，在动物体内模拟人类疾病的形成，构建相应疾病的动物模型，将为探索人类疾病的发生发展机制、研究治疗新模式、评估药物有效性，时效性和安全性的可靠手段。
与常规的体外培养细胞模型相比，从动物模型上探索的实验结论更有说服力，免疫缺陷动物受体的出现推动了人源化动物模型的快速发展，其缩小了动物模型与人类的种属差异，使人源化动物模型更为可靠的还原人体内的情况。
1 人源化小鼠模型的出现过程具有功能性的人类基因、细胞或者组织的小鼠模型即为人源化小鼠模型，它也是学者研究人类疾病最常用，最主要的替代模型。
最早的免疫缺陷小鼠是裸鼠，外观为无鼻毛，足尖常收缩呈螺旋样畸形的是原种新生裸体小鼠的特征。
而裸鼠则为无毛，但可以观察到有被毛滤泡的细毛组织，同时为正常胸腺缺陷型。
重度联合免疫缺陷（Server Combined Immune-deficiency，SCID）小鼠具有16号染色体上的隐性基因突变（PrkdcSCID），存在严重缺乏Ｔ细胞、Ｂ细胞的情况，且胸腺、外周淋巴组织均出现严重的萎缩，胸腺、淋巴结和脾滤泡几乎没有淋巴细胞。
三种哮喘小鼠动物模型的对比研究
•论著.三种哮喘小鼠动物模型的对比研究黄超文赵强钟莲娣钟雪莺仝金斋黄炎明【摘要】目的探讨三种哮喘小鼠造模方式在病理改变、灌洗液中细胞组分、气道反应性、气道炎症指标等方面的差异。
方法分别采用屋尘蠕提取物（HDM）、卵清蛋白（OVA）和甲苯二异氧酸酯（TDI）构建小鼠哮喘模型,检测小鼠肺病理改变、肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞和上皮细胞数量、气道高反应性、炎症因子表达情况。
结果HDM、OVA所诱导的哮喘小鼠BALF中细胞组分主要以嗜酸性粒细胞为主。
三组哮喘小鼠在接受不同浓度的乙酰甲胆碱雾化后气道阻力明显增高，与浓度呈正相关，而HDM和OVA诱导的哮喘小鼠气道阻力较TDI组更高。
三组小鼠的血清IgE和BALF中嗜酸性粒细胞炎症指标IL-4、IL-5JL-13明显增高，TDI组所诱导的IgE和BALF IL-4JL-5JL-13均分别低于HDM组和OVA组。
结论不同造模方式建立的哮喘小鼠动物模型在气道反应性、气道炎症和病理特点各有不同，HDM哮喘小鼠和OVA哮喘小鼠具有典型的嗜酸性粒细胞哮喘表现，而TDI哮喘小鼠表现为混合细胞性哮喘动物模型。
【关键词】哮喘；动物模型；屋尘螭提取物；卵清蛋白；甲苯二异氤酸酯［中图分类号］R562.2［文献标识码］A DOI:10.3969/j.issn.1002-1256.2019.11.001支气管哮喘是一种由多种炎症细胞和炎症组参与的慢性气道变应性炎症,并以气道黏液高分泌、气道高反应性和气道重塑为主要特征⑴。
Brown Norway、Wistar大鼠、Sprague Dawly大鼠为常见的大鼠哮喘动物模型，而BALB/c小鼠、C57BIV6小鼠则是常见的哮喘小鼠动物模型⑷。
目前造模方式常采用屋尘蟻提取物（HDM）、卵清蛋白（OVA）、甲苯二异氤酸酯（TDI）、灭活的呼吸道合胞病毒（RSV）等刺激诱导哮喘动物模型⑶。
本研究拟建立HDM、OVA、TDI分别诱导的三种哮喘小鼠动物模型，对比其在气道反应性、气道炎症和病理方面的差异，评价各模型的优劣。
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定
小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定[摘要] 目的建立小鼠三种不同部位巨噬细胞体外分离培养的方法，并对其进行鉴定。
方法分别从小鼠腹腔、脾脏、骨髓中分离获取巨噬细胞，经台盼蓝染色计数后于含10%胎牛血清的DMEM培养液、1%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养；通过活细胞形态观察；HE 染色光镜观察；吞噬鸡红细胞功能检测；酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。
结果获得高纯度的巨噬细胞，具有巨噬细胞的形态特征，具备良好的吞噬功能，鸡红细胞吞噬率分别为腹腔94.68%，脾脏92.47%，骨髓93.11%；酸性磷酸酶染色阳性率为腹腔89.43%，脾脏85.21%，骨髓88.55%；α-醋酸奈酚酯酶染色阳性率为腹腔85.32%，脾脏81.81%，骨髓85.76%。
结论小鼠三个不同部位均可简便实用的分离出巨噬细胞，可以满足不同的研究目的。
巨噬细胞不仅是许多病原体的宿主细胞,而且在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键性作用[1-3],比如调节促炎和抗炎细胞因子的释放、吞噬或杀死胞内微生物和肿瘤细胞、降解和提呈抗原等。
它还可以与其他免疫细胞协同发挥更大的功能，比如树突状细胞、粒细胞、NK细胞和T细胞等。
小鼠巨噬细胞吞噬作用是反映机体非特异性免疫功能的主要指标，也是临床免疫学实验常用的方法之一。
现将已有的巨噬细胞分离方法改进，从3种不同部位分离小鼠巨噬细胞，并做以对比。
1 材料与方法1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone）；RPMI-1640培养基（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（Binder，Thermo）。
1.2 从小鼠腹腔中分离巨噬细胞（1）取6~8周龄左右的小鼠，腹腔注射2mL无菌的液体石蜡。
待3~4d后收集腹腔细胞。
（2）颈椎脱臼法法处死小鼠，消毒，用注射器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1~2 min，静置5min，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。
66.小鼠福利受损模型的建立及营养干预作用的研究_杨斐
小鼠福利受损模型的建立及营养干预作用的研究杨 斐，胡 樱， 许兰文（复旦大学实验动物科学部，上海２０００３２）［摘要］ 目的 探索建立实验小鼠的福利受损模型，并研究营养干预对模型小鼠福利的改善作用。
方法 以反复制动模拟常规实验处置对小鼠的福利损害，测定与福利相关的神经内分泌、免疫、生化、生长指标和饲料效价，评价其在实验中消耗的生物学代价；采用营养咬棒对模型小鼠同步干预，测定相关指标。
结果 制动小鼠体增重和饲料效价（ＦＥＲ）显著降低（Ｐ＜０．０１），血清促肾上腺皮质激素（ＡＣＴＨ）、皮质酮（ＣＯＲＴ）、肾上腺素（ＥＰＩ）、去甲肾上腺素（ＮＥ）水平显著升高（Ｐ＜０．０１），血清β－内啡肽（β－ＥＰ）、白介素－２（ＩＬ－２）水平、脾脏指数、外周血白细胞总数（ＷＢＣ）、脾脏Ｔ 、Ｂ淋巴细胞增殖能力（ＳＩＴ， ＳＩＢ）显著降低（Ｐ ＜０．０５， Ｐ ＜０．０１）。
与模型对照组比较，营养咬棒组ＣＯＲＴ、ＡＣＴＨ 、ＥＰＩ 和ＮＥ显著降低（Ｐ＜０．０５），脾脏指数、脾脏Ｔ 、Ｂ 淋巴细胞增殖能力、ＩＬ－２ 和ＷＢＣ显著升高（Ｐ＜０．０５，Ｐ ＜０．０１）。
结论 制动小鼠再现了福利损害时动物的神经内分泌紊乱、免疫抑制和生长抑制状况，可作为福利受损的动物模型，营养干预有助于改善制动小鼠的神经内分泌紊乱和免疫抑制。
［关键词］ 动物福利；模型；生物学代价；营养干预；小鼠［中图分类号］ Ｑ９５－３３ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １００４－８４４８（２００８）０２－００７４－０６［收稿日期］ 2007-07-16［基金项目］ 上海市科技发展基金项目 （０６４９０９０１１）［作者简介］ 杨 斐(1968-), 男, 副研究员, 硕士生导师, 从事实 验动物学及比较医学的教学、科研和管理工作。
E-mail: yfdwbfd@［通讯作者］ 许兰文（１９４５－）， 女， 教授， 硕士研究生导师。
Ｅ－ｍａｉｌ： ＬＷＸＵ＠Ｓｈｍｕ．ｅｄｕ．ｃｎ在实验动物福利技术研究领域，近年来越来越多的证据表明常规的实验处置手段能够引起动物的应激反应，如不予及时控制和干预，往往导致额外的福利损害［１］，不仅降低了实验动物的福利水平，也在一定程度上干扰了科学研究。
卵清蛋白诱导小鼠建立支气管哮喘模型
卵清蛋白诱导小鼠建立支气管哮喘模型张亚娟;王亚楠;丁亚骏;何璐云;刘鑫;康巧珍【摘要】目的:建立一种稳定的小鼠哮喘模型,以便用于支气管哮喘的研究及治疗.方法:清洁级,雌性BALB/c小鼠16只,随机分为模型组和对照组,模型组于第0天和第14天注射卵清蛋白(ovalbumin,OVA)氢氧化铝溶液致敏,第28～30天雾化吸入1％OVA溶液激发,对照组用生理盐水替代OVA溶液.结果:模型组在雾化过程中出现了较明显的头面部瘙痒,前肢缩抬,弓背,呼吸加深加快,安静少动等哮喘急性发作症状.支气管肺泡灌洗液(BALF)中的嗜酸性粒细胞数(eosinophils,EOS)和白细胞总数均明显增多.肺组织病理切片(HE染色后)可见小支气管和伴行血管周围都有较多的炎症细胞浸润,可以看到大量嗜酸性粒细胞,平滑肌增厚,杯状细胞增生,部分肺泡间隔融合并形成肺气肿.结论:用OVA致敏的方法可以成功地建立小鼠哮喘模型.【期刊名称】《河南医学研究》【年(卷),期】2012(021)003【总页数】3页(P268-270)【关键词】支气管哮喘;动物模型;卵清蛋白【作者】张亚娟;王亚楠;丁亚骏;何璐云;刘鑫;康巧珍【作者单位】郑州大学生物工程系河南郑州450001;郑州大学生物工程系河南郑州450001;郑州大学生物工程系河南郑州450001;郑州大学生物工程系河南郑州450001;郑州大学生物工程系河南郑州450001;郑州大学生物工程系河南郑州450001【正文语种】中文【中图分类】R-332支气管哮喘(bronchial asthma，简称哮喘)是一种慢性反复发作的、由多种细胞(尤其是肥大细胞、嗜酸性粒细胞和T细胞)和细胞因子参与的气道变态反应性疾病［1］，在抗原刺激时会引起支气管平滑肌收缩、腺体分泌增多和黏膜血管扩张，最终导致支气管管腔狭窄、呼吸困难，严重时导致死亡。
目前哮喘的发病率和死亡率逐年增长，尚无根治的办法，严重困扰着人类的健康。
环磷酰胺诱导的小鼠骨髓抑制模型及中药对其防治作用机制研究进展
环磷酰胺诱导的小鼠骨髓抑制模型及中药对其防治作用机制研究进展王成龙;赵东峰;杨志烈;贾友冀;常君丽;王拥军;杨燕萍【摘要】Patients with chemotherapy-induced myelosuppression is prone to infection or bleeding,which has a serious impact on their treatment,prognosis and quality of life and even endangers life and leads patients and their family to suffering.In recent years,traditional Chinese medicine in preventing and treating chemotherapy-induced myelosuppression have gradually garnered increasing attention.As the animal model of myelosuppression is being established,applied and mature,research on mechanism of Chinese meteria medica in preventing and treating chemotherapy-induced myelosuppression has made great achievements,showing the advantages and prospect of Chinese meteria medica in the treatment of this disease.%化疗后骨髓抑制容易导致患者发生感染或出血,严重影响患者治疗、预后和生命质量,甚至危及生命,给患者及家属带来很大痛苦.中医药防治化疗导致骨髓抑制越来越受到重视.随着骨髓抑制动物模型的建立、应用和成熟,中药防治化疗导致骨髓抑制机制的研究也取得许多进展,显出中药治疗的优势和前景.【期刊名称】《世界中医药》【年(卷),期】2017(012)009【总页数】6页(P2252-2257)【关键词】环磷酰胺;化疗;骨髓抑制;小鼠模型;机制研究【作者】王成龙;赵东峰;杨志烈;贾友冀;常君丽;王拥军;杨燕萍【作者单位】上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院科技中心实验室,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;滨州医学院中西医结合学院,烟台,264003;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海交通大学医学院附属瑞金医院骨科,上海,200025;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032;上海中医药大学附属龙华医院脊柱病研究所,上海,200032【正文语种】中文【中图分类】R285.5化疗是肿瘤治疗的重要手段,骨髓抑制是化疗最常见的不良反应,严重影响化疗进行,使临床疗效降低。
补肾温阳中药对哮喘小鼠Foxp3-mRNA表达及CD4^+CD25^+调节性T细胞水平的影响研究
胞因子（ Ｉ Ｌ － １ ０ 、 Ｉ Ｆ Ｎ － 、 Ｔ Ｇ Ｆ － １ ３ １ ） 均参与了支气管哮喘的发病过程， 补肾温阳中药可通过上调 Ｃ Ｄ ４ Ｃ Ｄ ２ ５ 调节性Ｔ细胞数量、 诱导 Ｆ ｏ ｘ Ｐ ３ － ｍ Ｒ Ｎ Ａ的表达与活化、 降低血清 Ｉ ｇ Ｅ水平及增加 Ｉ Ｌ － １ ０ 、 Ｉ Ｆ Ｎ － Ｔ Ｇ Ｆ － １ ３ １ 含量等机制来达到减轻哮喘炎症的作用。 关键词 ： 补肾温阳； 调节性 Ｔ细胞； 转录因子； 哮喘
达水平显著增高， 差异有统计学意义（ 均为Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） ； 与正常对照组比较， 中药干预组小鼠脾脏中Ｃ Ｄ ４ Ｃ Ｄ ２ ５ 调节性Ｔ细胞数量、 Ｆ ｏ ｘ Ｐ ３ 一 ｍ Ｒ Ｎ Ａ表达水平较低， 差异有统计学意义（ Ｐ ＜ ０ ． ０ １ ） ； 与哮喘模型组比较， 中药 ＋ 抗体干预组小鼠脾脏中Ｃ Ｄ ４ Ｃ Ｄ ２ ５ 调节性 Ｔ细胞数量、 Ｆ ｏ ｘ Ｐ ３ 一 ｍ Ｒ Ｎ Ａ表达水平降低， 差异有统计学意义（ 均为 Ｐ＜ ０ ． ０ ５ ） 。结论 Ｃ Ｄ ４ Ｃ Ｄ ２ ５ 调节性Ｔ细胞、 Ｆ ｏ ｘ Ｐ ３ ． ｍ ｔ ｌ Ｎ Ａ 、 细
Ｃ Ｄ ２ ５＋ 调节 性 Ｔ细胞 水 平 的影 响研 究 木
黄 河清 王世聪 李 希 摘要： 目的 建立哮喘样气道炎症小 鼠动物模型。观察补 肾温阳中药对哮喘小 鼠 １ ％ ｘ ｐ ３ ． ｍ ｌ ｔ Ｎ Ａ表达与活化以及对 Ｃ Ｄ ４
Ｃ Ｄ ２ ５ 调节性 Ｔ细胞的数量、 分化与功能的影响， 探讨补肾温阳法在防治过敏性哮喘气道炎症的作用机制。方法 １ ０ ０只 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ ｅ 小鼠随机分成４组： 正常对照组、 哮喘模型组、 中药干预组及中药＋ 抗体干预组， 除正常对照组外， 其余各组均以卵白蛋白（ Ｏ Ｖ Ａ ） 致 敏激发方法建立小鼠哮喘模型，中药 ＋ 抗体干预组小鼠于激发前 ３ ０ ｍ ｉ ｎ事先给予抗Ｉ Ｌ ． １ Ｏ ＆抗Ｔ Ｇ Ｆ ． １ ３ 抗体滴鼻。同时， 中药干预组 组、 中药 ＋ 抗体干预组于实验的第１ 天至第 ２ １ 天， 每只小鼠给予补肾温阳中药（ 用淫羊藿、 巴戟天、 补骨脂免煎颗粒配制 ５ ０ ０ １ ￣ １ ） 灌
B／T淋巴细胞弱化因子在急性哮喘小鼠模型CD4+T淋巴细胞表达的研究
【 摘要 】 目的
研 究负 向共刺 激受体 Ｂ ／ Ｔ淋 巴细胞 弱化 因子（ Ｂ ａ ｎ ｄ Ｔ ｌ ｙ ｍ ｐ ｈ ｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ａ ｔ ｔ ｅ ｎ ｕ ａ ｔ ｏ ｒ ， Ｂ Ｔ Ｌ Ａ ） 在急性哮喘小鼠模 型
脾脏 Ｃ Ｄ ４ Ｔ淋 巴细胞 中的表达特 点及地塞 米松对 Ｂ Ｔ Ｌ Ａ表 达 的影 响。方法 １ ８只 Ｂ Ａ Ｌ Ｂ ／ Ｃ ６小 鼠按随机 数字表 法分为 空 白 对照组 、 哮喘模 型组 、 地塞 米松 治疗组。Ｏ Ｖ Ａ联合 Ａ Ｌ （ Ｏ Ｈ） 第 １和第 ８天分别致敏和 第 １ ５～ｌ ７天激发 ， 建立 急性 哮喘模型。
Ｈ Ｅ染色观察 ３组气道 炎症浸润情况 ； Ｅ ｌ ｉ ｓ ａ 检测 血清 Ｉ Ｌ － ４和 Ｉ Ｆ Ｎ 一 ； 流 式细胞术检 测小 鼠脾脏 Ｃ Ｄ ４ Ｔ淋 巴细胞 Ｂ Ｔ Ｌ Ａ表达 变
化。结果
Ｈ Ｅ染色 哮喘组肺 部小气 道和 血 管周 围炎 症细 胞浸 润 （ Ｅ Ｏ Ｓ ） 明显， 上皮 细胞 增生 ； 流 式细胞 仪检 测 哮喘 组脾脏
Ｅｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ０ ｆ ＢＴＬＡ ｉ ｎ ＣＤ４ Ｔ ｌ ｙ ｍｐ ｈｏ ｃ ｙ ｔ ｅ ｓ ｏ ｆ ａ ｃ ｕ ｔ ｅ ａ ｓ ｔ ｈｍａ ｍｉ ｃ ｅ ｍｏ ｄ ｅ ｌ 。 ， ， ， ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ， Ｓ ｈ ａ ｎ ｇ ｈ ａ ｉ ２ ０ ０ ０ ０ ３， Ｃｈ ｉ ｎ ａ） Ｙ ｏ ｎ ｇ — ａ ｎ，
不同途径和剂量环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型的对比研究
不同途径和剂量环磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型的对比研究一、本文概述本文旨在对比研究不同途径和剂量环磷酰胺在小鼠免疫抑制模型建立中的应用效果。
环磷酰胺作为一种免疫抑制剂，在医学研究和药物开发中具有广泛应用。
然而，关于其最佳使用途径和剂量在不同免疫抑制模型中的研究尚未得出一致结论。
因此，本文通过对小鼠进行不同途径和剂量的环磷酰胺处理，对比其免疫抑制效果，以期为相关研究提供参考。
本研究将采用不同途径（如腹腔注射、静脉注射等）和不同剂量（如低剂量、中剂量、高剂量）的环磷酰胺处理小鼠，观察其免疫功能的变化。
通过对比分析各组小鼠的免疫指标（如淋巴细胞数量、细胞因子水平等），评估不同处理条件下的免疫抑制效果。
本研究还将关注环磷酰胺处理对小鼠生存状况的影响，以确保实验结果的可靠性和实用性。
通过本文的研究，我们期望能够明确不同途径和剂量环磷酰胺在小鼠免疫抑制模型建立中的优劣，为相关领域的研究提供有力支持。
本研究还将为环磷酰胺在临床应用中的剂量选择和给药途径提供理论依据，推动其在免疫治疗领域的发展。
二、材料与方法选用健康、雄性、6-8周龄的C57BL/6小鼠，体重在20-25g之间，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
小鼠饲养在恒温（22±2℃）、恒湿（55±5%）、光照周期12h/12h的环境中，自由饮水和摄食。
所有动物实验均按照《实验动物管理条例》进行，并得到了伦理委员会的批准。
环磷酰胺（Cyclophosphamide，CT）购自Sigma-Aldrich公司。
小鼠免疫球蛋白G（IgG）购自北京博奥森生物技术有限公司。
其他常用试剂如生理盐水、PBS等均为国产分析纯。
实验所用仪器包括：电子天平、微量移液器、离心机、酶标仪、流式细胞仪等。
将小鼠随机分为4组，每组10只。
分别给予不同剂量和途径的环磷酰胺处理：组1（对照组，Ctrl）：生理盐水腹腔注射；组2（低剂量CT组，Low-CT）：CT 50mg/kg腹腔注射；组3（中剂量CT组，Medium-CT）：CT 100mg/kg腹腔注射；组4（高剂量CT组，High-CT）：CT 200mg/kg腹腔注射。
哮喘动物模型的制作及注意事项
取体重200-260 g豚鼠，雌雄各半，置于500 mL的观察室内，以恒定压力喷入17.5%的枸橼酸，喷雾1 min，观察并记录豚鼠在5 min之内的咳嗽潜伏期和咳嗽次数，将咳嗽潜伏期≤10 s或≥120 s，以及5 min内咳嗽次数≤10次或者≥50次的豚鼠全部剔除。预选合格的豚鼠经体重随机分层分组，即模型组、咳必清组、各剂量给药组，每组6只。各组连续灌胃给药7天，每天一次，模型组豚鼠灌以等体积生理盐水。末次给药后1 h，按上述筛选条件引咳豚鼠，观察并记录各豚鼠咳嗽潜伏期及5 min内咳嗽次数，并与模型组比较。
3.氨水诱发小鼠咳嗽实验
18-22 g ICR小鼠，雌雄各半，按体重随机分层分组，即模型组、咳必清组、各剂量给药组。各组连续灌胃给药7天，每天一次，模型组小鼠灌以等体积生理盐水。末次给药后1 h，将小鼠置于一倒置的容积为500 mL，内置一棉球的烧杯中，在向棉球上滴加0.4 mL浓氨水时开始计时，观察并记录小鼠咳嗽潜伏期和3min内咳嗽次数，并与模型组比较。
4.大鼠急性咽炎模型
清洁级SD大鼠，雌雄各半，用喉头喷雾器于大鼠咽部喷体积分数15％氨水， 每次喷 3 揿，相当于6μl 15%氨水停留在大鼠咽部。每天上、下午各 1 次，连续 3 d，造成急性咽炎模型；每日观察记录各组动物外观状态，并观察动物咽部情况，包括黏膜形态、色泽等。
c小鼠于第0天和第14天分别腹腔注射0.1mL/只OVA液(0.2 mg/mL)和DBP溶液（0.5 mg/kg），第21~23天连续3天以0.5%的OVA溶液雾化激发，每天于上午下午固定时间雾化2次，每次20min。雾化过程中观察小鼠一般行为变化，后一次雾化结束后24小时，小鼠摘眼球取血，取支气管肺泡灌洗液( Bronchial Alveolar Lavage, BALF )及肺组织。
IL-4-IRES-eGFP（4get）小鼠模型介绍
IL-4-IRES-eGFP（4get）小鼠模型介绍品系背景：BALB/c该模型对IL-4分泌细胞的可靠追踪和分类使您能够有效地描绘出Th2免疫应答极化，是一种强大的药物测试工具，能够：■ 调节由组织驻留巨噬细胞引起的慢性炎症。
■ 研究与过敏性哮喘有关的气道炎症。
这种IL-4报告小鼠模型得到了广泛的使用和验证，已在60多个知名期刊报道过。
品系说明：■ eGFP报告基因忠实地反映了IL-4表达。
■ 内源性IL-4的表达不受插入基因的影响。
模型验证：IL-4是Th2细胞的典型标志物，可诱导幼稚辅助性T细胞分化为Th2细胞。
Th2细胞的主要功能为刺激B细胞增殖、分化和产生抗体，与体液免疫相关。
与其他现有的通过随机插入产生的IL-4报告小鼠模型相反，该敲入小鼠保留了IL-4的生理表达并且能够监测Th2的活性。
内源性IL-4表达无异常：■ 内源性IL-4表达并具有功能：将报告基因插入内源性IL-4基因座的3'UTR中。
■ 报告基因忠实地反映了IL-4的表达。
能很好地追踪Th2极化：■ 可以通过监测eGFP的表达直接检测表达IL-4的细胞（图1）。
■ 免疫系统不受影响：能响应感染或攻击而产生完好的IL-4（图2）。
■ 能很好地监测Th2细胞的迁移和细胞分选。
图1. eGFP的表达与T细胞中表达的IL-4相关，并反映了IL-4的表达水平。
A) 与Th1相反，Th2在4get细胞的eGFP存在的特异性条件下，能够诱导eGFP的大量表达，从而反映了IL-4的表达情况。
用PKH26红色荧光标记纯化的幼稚CD4+eGFP-纯合4get T细胞。
在CD4+细胞设门后，在存在抗原呈递细胞的情况下，在Th1、中性或Th2条件下培养细胞，并在第4天进行分析。
B) 只有在Th2条件下，4get细胞才特异性表达IL-4。
通过补体裂解耗尽野生型（空心条）、杂合（阴影条）及纯合（4get /4get，深色条）4get小鼠的脾细胞的CD8+细胞，并在Th1或Th2条件下刺激5天。
过敏性鼻炎-哮喘综合征大鼠模型的建立与评价
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织病理 切 片见小 支气管及伴 行血 管周 围有较 多炎症
疋 一哮 喘 综 合 征 模 型 其 发 病 机 理 与 临床 相 似 ， 这模型 ； 改 良
Ｓ ＨＩ Ｓ ｕ ｏ—ｆ ａ ｎ ｇ ，ＺＨＯＵ Ｋｕ ｉ —ｌ ｏ ｎ ｇ ２
１ ． Ｔ ｈ ｅ Ａ ｆ ｉ ｌ ｉ ａ ｔ ｅ ｄＨ ｏ ｓ ｐ ｉ ｔ ａ ｌ ｏ ｆＮ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆＴ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｅ， ｎ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ ， Ｎ ａ ｎ ｉ ｆ ｎ ｇ ２ １ ０ ０ ２ ９， Ｃ ｈ ｉ ａ； ｎ ２ ．Ｎ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ Ｕ ｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ ｏ ｆ Ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ａｌ ｎ Ｃ ｈ ｉ ｅｓ ｎ ｅ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｅ， ｎ Ｊ ｉ ａ ｎ ｇ ｓ ｕ ， Ｎ ａ ｎ ｊ ｉ ｎ ｇ ２ １ ０ ０ ２ ９ ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ．
江苏 南 京
。
方 法： 清洁级健 康雄性 ｓ Ｄ大鼠 ２ Ｏ只， 随机分 为对
注 ７天 ， 从第 １ ５日开始 ， 将模 型组大鼠置 于密闭器ｒ ｒ ａ
ｔ 行 雾化 吸 入 ， 建立模 型 ； 对 照 组 以 生理 盐 水 代 替 。 结
鼻， 打喷嚏 ， 甚则 出现 口唇及双耳 紫绀， 饮水量明显增
江 西 中 医药 大 学学 报２ ０１ ４年 ６月 第 ２６ 卷 第 ３期
Ｊ ＯＵ ＲＮＡＬ ＯＦ Ｊ １ Ａ ＮＧ ＸＩ ＵＮＩ Ｖ Ｅ ＲＳ Ｉ Ｔ Ｙ ０Ｆ Ｔ Ｃ Ｍ ２ ０ １ ４ Ｖ ｏ １ ． ２ ６ Ｎ ｏ ． ３
小鼠脾脏t细胞流式分选实验步骤
实验目的：通过流式细胞仪对小鼠脾脏T细胞进行分选，以探究T细胞在免疫应答中的作用及机制。
一、实验前准备1.1 实验材料准备1.1.1 小鼠脾脏组织1.1.2 10mL注射用生理盐水1.1.3 0.25胰酶液1.1.4 洗涤缓冲液（PBS）1.1.5 红细胞裂解液1.1.6 表面标记抗体：CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC1.1.7 流式细胞仪1.1.8 离心管、移液枪、吸头、培养皿等实验器材1.2 实验环境准备1.2.1 无菌操作台1.2.2 常温恒温器1.2.3 培养箱1.2.4 流式细胞仪操作间二、实验步骤2.1 小鼠脾脏细胞分离2.1.1 将小鼠处死并取出脾脏组织，放入含有10mL生理盐水的培养皿中，剪碎均匀。
2.1.2 加入0.25胰酶液，放入37摄氏度恒温器中消化30分钟。
2.1.3 将组织碎片过滤，用PBS洗涤，避免红细胞污染。
2.1.4 使用红细胞裂解液裂解红细胞，离心沉淀，得到细胞悬液。
2.2 细胞表面标记2.2.1 取得细胞悬液，计数并调整浓度至合适水平。
2.2.2 分别加入CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC表面标记抗体，进行表面标记反应，避免光照。
2.2.3 进行表面标记抗体的洗涤和离心，得到标记的细胞悬液。
2.3 流式细胞仪分选2.3.1 将标记的细胞悬液输入流式细胞仪，设置合适的参数。
2.3.2 进行T细胞的流式细胞仪分选，并收集目标T细胞子集。
2.3.3 对收集的目标T细胞子集进行进一步的分析或培养。
三、实验注意事项3.1 实验过程中要保持无菌操作，避免细胞污染。
3.2 实验中避免表面标记抗体受光照。
3.3 实验材料和仪器的准备和操作要符合实验要求，确保实验结果的准确性和可靠性。
通过上述步骤，可以对小鼠脾脏T细胞进行流式分选实验，进一步探究T细胞在免疫调节中的作用及机制，为相关研究提供重要的实验数据支持。
在实验过程中，对于小鼠脾脏T细胞的流式分选需要严格控制各个步骤，确保实验结果的可靠性和准确性。
PM2.5促进Th9细胞分化及在哮喘发病中作用的初步研究
PM2.5促进Th9细胞分化及在哮喘发病中作用的初步研究付劲蓉;孙立成;夏莉;刘丽娟;黄赛花;韩晓;周玉峰【摘要】目的探讨PM2.5对Th9细胞分化的影响及其在哮喘发病中的作用,为揭示空气污染与哮喘发作的关系及发现新的防治策略提供实验证据.方法采用蟑螂提取物(CRE)作为过敏原建立小鼠哮喘模型,在激发阶段向小鼠气道内滴加不同浓度的PM2.5悬液,通过肺泡灌洗液(BAL)细胞计数、肺部切片HE染色和气道阻力检测来判定PM2.5是否能加重哮喘的发生.流式细胞术检测肺门淋巴结中Th9细胞比例;荧光定量PCR(qPCR)检测肺组织匀浆中IL-9基因的表达.在体外分离CD4+幼稚T 细胞,用TGF-β和IL-4诱导CD4+幼稚T细胞分化为Th9细胞,用流式细胞术、qPCR检测PM2.5对Th9细胞分化及对相关转录因子PU.1、B细胞活化转录因子(BATF)的影响.结果与单纯CRE激发的小鼠哮喘模型相比,PM2.5与CRE联合处理组(PM2.5+CRE)能显著增强哮喘炎症反应,PM2.5+CRE组小鼠的肺泡灌洗液中总细胞计数、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、巨噬细胞和淋巴细胞的数量较CRE组均明显上升,肺部被炎症细胞浸润的程度及气道阻力较CRE组明显增加.PM2.5+CRE 能显著上调肺组织中IL-9表达以及肺门淋巴结中Th9阳性细胞比例.体外分化细胞中,PM2.5+CRE组IL-9阳性细胞的比例(52.0±5.8)％较CRE组(31.7±3.2)％明显增高(P=0.0004).PM2.5能显著上调IL-9及PU.1、BATF等Th9细胞调控基因的表达.结论大气细颗粒物PM2.5可加重过敏原诱发的哮喘炎症,在体内外可显著增强Th9细胞的分化,提示PM2.5可能通过增强Th9细胞的分化加重哮喘.【期刊名称】《中国循证儿科杂志》【年(卷),期】2018(013)003【总页数】5页(P205-209)【关键词】PM2.5;哮喘;Th9细胞;炎症【作者】付劲蓉;孙立成;夏莉;刘丽娟;黄赛花;韩晓;周玉峰【作者单位】复旦大学附属儿科医院和生物医学研究院上海,201102;复旦大学附属儿科医院和生物医学研究院上海,201102;复旦大学附属儿科医院和生物医学研究院上海,201102;复旦大学附属儿科医院和生物医学研究院上海,201102;复旦大学附属儿科医院和生物医学研究院上海,201102;复旦大学附属儿科医院和生物医学研究院上海,201102;复旦大学附属儿科医院和生物医学研究院上海,201102;卫生部新生儿疾病重点实验室上海,201102【正文语种】中文哮喘是在遗传易感背景下由过敏原和环境因素相互作用而引起的一种免疫炎症性疾病[1]。
不同剂量致敏原对小鼠过敏性哮喘模型特异性抗体和炎性细胞因子的影响
不同剂量致敏原对小鼠过敏性哮喘模型特异性抗体和炎性细胞因子的影响胡德建;张香梅【摘要】目的观察不同剂量致敏原对小鼠过敏性哮喘模型血清特异性抗体IgE、IgG2a和白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-12(IL-12)、γ-干扰素(IFN-γ)等炎性细胞因子的影响.方法 45只雌性BALB小鼠随机分为4组,空白对照组腹腔注射不含鸡卵蛋白(OVA)的PBS缓冲液,低、中、高剂量组分别注射含10、100、1 000 μg OVA的PBS缓冲液,第15 ～20天以雾化吸入OVA生理盐水激发致敏,制备过敏性哮喘模型.结果各给药组均出现不同程度炎细胞浸润,低剂量组最为显著;低、中、高剂量组血清IgE、IL-4、IL-5水平呈递减趋势,组间差异显著(P＜0.01),且均显著高于对照组(P＜0.01);各实验组血清IgG2a、IL-12及IFN-γ水平呈递增趋势,组间差异显著(P＜0.01),且与对照组差异显著(P＜0.05或P ＜0.01).结论不同剂量的OVA可能影响小鼠过敏性哮喘模型所产生的细胞因子类型,低剂量OVA造模的效果最为显著,高剂量OVA可能导致小鼠发生免疫耐受.【期刊名称】《实用临床医药杂志》【年(卷),期】2014(018)021【总页数】4页(P8-11)【关键词】致敏原;过敏性哮喘;白细胞介素-4;白细胞介素-5;肿瘤坏死因子-γ;细胞因子【作者】胡德建;张香梅【作者单位】山东省潍坊市人民医院药学部,山东潍坊,261041;山东省潍坊市人民医院药学部,山东潍坊,261041【正文语种】中文【中图分类】R562.2过敏性哮喘是由免疫球蛋白E(IgE)介导的、由肥大细胞、嗜酸性粒细胞及T淋巴细胞等参与的变态反应性疾病。
研究[1-2]表明，过敏性哮喘发作时，患者IgE水平显著升高。
有学者报道，不同剂量的过敏原会引发机体辅助性T细胞(Th)向Th1和Th2分化的不同趋势，从而影响其临床结局[3-4]。
脾胃虚弱型肥胖小鼠模型的建立与评价
脾胃虚弱型肥胖小鼠模型的建立与评价司原成;苗维纳;何嘉悦;丁维俊【摘要】Objective:To copy and evaluate the spleen deficiency syndrome type in obese mice.Method:Replicating obese mice with high-fat diet,and on this basis,according to the spleen deficient fatigue,less food,stay,loose stools and secondary screening eligible obese mice,and through the ELISA method to detect serum total cholesterol,triglycerides,high-density lipoprotein and low density lipoprotein content,observe serum inflammatory factors (interleukin 6,interleukin 10 and tumor necrosis factor alpha) and CD4 +,CD8 +,CD11c + content changes of the spleen,thymus and intestinal corpuscle.Results:The model of obesity mice was62.96％,23.53％ of which was spleen deficiency syndrome type.The IL-1O,the TNF alpha of these mice is significantly higher than normal group,interleukin-6 was significantly lower than normal group.The CD4 +,CD8 + and CD11c + of their gut peyer's patch were also significantly reduced.Conclusion:This method could better screen spleen deficiency syndrome by obesity animal medel.%目的:建立脾胃虚弱型肥胖小鼠模型并进行评价.方法:复制高脂饮食诱导肥胖模型,在肥胖模型的基础上按照神疲乏力、食少纳呆、便溏等主要脾虚指标进行二次筛选符合条件的肥胖鼠.通过ELISA法检测血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白及低密度脂蛋白含量,测定血清中炎症因子(白介素-6、白介素10及肿瘤坏死因子-α)及脾脏、胸腺和肠道派氏小体中CD4+、CD8+及CD11c+等含量变化.结果:肥胖鼠成模率62.96％,其中脾胃虚弱型肥胖鼠23.53％.脾虚型肥胖鼠IL-10、TNF-α显著高于正常组,白介素-6显著低于正常组,其肠遭派氏小体中的CD4+、CD8+及CD11c+明显降低.结论:此方法可以较好地筛选出脾胃虚弱型肥胖鼠,为健脾益气治疗肥胖奠定基础.【期刊名称】《中国中医基础医学杂志》【年(卷),期】2017(023)002【总页数】4页(P177-179,186)【关键词】脾胃虚弱;肥胖,动物模型;乏力;含水量;免疫【作者】司原成;苗维纳;何嘉悦;丁维俊【作者单位】成都中医药大学基础医学院,成都 610072;成都中医药大学基础医学院,成都 610072;成都中医药大学基础医学院,成都 610072;成都中医药大学基础医学院,成都 610072【正文语种】中文【中图分类】R-332肥胖已经成为全世界共同面临的公共卫生问题。
哮喘病实验报告
一、实验背景哮喘是一种常见的慢性呼吸道疾病，其特征是气道慢性炎症、可逆性气流阻塞和气道高反应性。
哮喘的发病机制复杂，涉及多种细胞、细胞因子和炎症介质。
为了深入理解哮喘的发病机制，寻找有效的治疗方法，本研究开展了哮喘病实验。
二、实验目的1. 通过实验观察哮喘模型的建立过程，了解哮喘的基本病理生理变化。
2. 探讨哮喘发病机制中关键细胞因子和炎症介质的作用。
3. 评估新型平喘药物对哮喘模型的疗效。
三、实验材料与方法1. 实验动物：清洁级C57BL/6小鼠，体重18-22g。
2. 试剂与仪器：哮喘模型诱导剂（OVA）、弗氏佐剂、皮质类固醇、抗炎药物、ELISA试剂盒、细胞因子检测试剂盒、肺功能仪等。
四、实验步骤1. 建立哮喘模型：将小鼠随机分为对照组、哮喘模型组、治疗组和安慰剂组，每组10只。
哮喘模型组小鼠皮下注射OVA和弗氏佐剂，对照组小鼠注射生理盐水。
哮喘模型建立成功后，对各组小鼠进行肺功能检测，评估哮喘模型的建立情况。
2. 观察哮喘模型的病理生理变化：取哮喘模型组小鼠肺组织，进行HE染色和免疫组化染色，观察肺组织炎症细胞浸润、气道上皮细胞损伤等病理生理变化。
3. 检测关键细胞因子和炎症介质：采用ELISA试剂盒检测哮喘模型组和对照组小鼠肺组织中IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α等细胞因子的含量。
4. 评估新型平喘药物的疗效：将哮喘模型组小鼠随机分为治疗组和安慰剂组，治疗组小鼠给予新型平喘药物，安慰剂组小鼠给予安慰剂。
治疗一定时间后，再次进行肺功能检测，评估新型平喘药物的疗效。
五、实验结果1. 哮喘模型建立成功：哮喘模型组小鼠肺功能显著降低，与对照组相比，FEV1、FVC等指标显著下降，表明哮喘模型建立成功。
2. 肺组织病理生理变化：哮喘模型组小鼠肺组织出现明显的炎症细胞浸润、气道上皮细胞损伤等病理生理变化，与对照组相比，差异具有统计学意义。
3. 关键细胞因子和炎症介质检测：哮喘模型组小鼠肺组织中IL-4、IL-5、IL-13、TNF-α等细胞因子含量显著升高，与对照组相比，差异具有统计学意义。
T细胞在哮喘免疫调节中的作用
垦丛匡堂堡哩垂丝坌盟！！！！至箜；！鲞笠！塑璺！生垦！！堕！堑！塑！！！鲤塑塑墅！：皇２：！！！！！∑！！：！！：盟！：！Ｔ细胞在哮喘免疫调节中的作用吴祖群沈华浩哮喘是由Ｔ细胞、嗜酸粒细胞、肥大细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症性疾病，气道慢性炎症导致气道高反应性（ＡＨＲ）的形成。
其中Ｔｈ２细胞通过分泌ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ一９、ＩＬ一１３等多种细胞因子在哮喘发病中起主要作用，而Ｔｈｌ分泌的ＩＦＮ一７抑制Ｔｈ２的功能，近年来研究发现ＣＤ４＋Ｔ细胞还包括多种具有调节功能的细胞群体并参与哮喘的免疫调节。
另外，ＮＫＴ细胞和ＣＤ８＋Ｔ细胞在哮喘免疫调节中亦具有一定的作用。
１Ｔｈｌ／Ｔｈ２与哮喘１９８６年，Ｍｏｓｓｍａｎｎ等ｎ１发现小鼠ＣＤ４＋Ｔ存在Ｔｈｌ和Ｔｈ２两个亚群，Ｔｈｌ产生白介素一２（ＩＬ－２）、干扰素（ＩＦＮ）７和８，不产生ＩＬ一４和ＩＬ一５；Ｔｈ２产生ＩＬ一４、ＩＬ一５、ＩＬ一６和ＩＬ一１０，但不产生１Ｌ一２或ＩＦＮ一７。
两亚群细胞均产生ＩＬ～３和粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ—ＣＳＦ）。
后来发现人类Ｔｈ同样存在Ｔｈｌ和Ｔｈ２亚群。
正常情况下，Ｔｈ０按一定比例向Ｔｈｌ和Ｔｈ２分化，两者以相互拮抗和自身促进的方式，形成复杂有序的细胞因子网络，调节正常的免疫应答。
１．１Ｔｈ２在哮喘免疫调节中的作用大量研究表明，哮喘患者存在Ｔｈｌ／Ｔｈ２亚群功能失衡，Ｔｈ０向Ｔｈ２分化过度，Ｔｈ２淋巴细胞分泌ＩＬ一４、ＩＬ一５、ＩＬ一９、ＩＬ一１３等细胞因子，ＩＩ。
一４和ＩＬ一１３促进Ｂ细胞合成过敏原特异性ＩｇＥ，ＩｇＥ与肥大细胞及嗜碱粒细胞膜表面高亲和力ＦｃｔＲＩ结合，诱导释放出大量炎症介质和细胞因子，介导速发相哮喘反应。
ＩＬ一５是嗜酸粒细胞强效增殖、趋化及活化因子，介导嗜酸粒细胞趋化到气道，嗜酸粒细胞释放多种细胞因子和细胞毒性产物，引起气道上皮脱落，暴露神经末稍，增加ＡＨＲ，是气道炎症反应的重要效应细胞。
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文章编号:100025404(2001)0320369202技术方法哮喘致敏小鼠模型的建立及脾脏CD4+T细胞的分离Establishment of sensitized asthma model in mice and CD4+T lymphocyte isolation from spleens程晓明,王长征,李淑平,钱桂生 (第三军医大学附属新桥医院全军呼吸内科研究所,重庆400037) 提 要:目的 建立一种可靠的哮喘致敏小鼠模型及分离脾脏C D4+T细胞。
方法 采用卵蛋白致敏的方法建立模型,运用panning法分离C D4+T细胞。
结果 此模型小鼠肺组织呈现典型的哮喘样病理改变,其外周血、支气管肺泡灌洗液(BA LF)中嗜酸性粒细胞百分比(E OS%)显著高于正常对照组(P<0.01)。
C D4+T细胞纯度经流式细胞术(FC M)检测,纯度达97.3%。
结论 此方法建立的模型及分离的C D4+T细胞可用于哮喘的实验研究。
建立哮喘动物模型及分离高纯度的C D4+T细胞是实验研究哮喘发病机制的重要前提。
本实验就小鼠致敏模型的建立及其脾脏C D4+T细胞的分离方法进行介绍。
1 材料与方法1.1 主要试剂及材料1.1.1 淋巴细胞分离液 将9%ficoll400溶液(S igma公司)和33.9%泛影葡胺溶液按比例混合,调比重至1.090。
1.1.2 尼龙毛柱的制备 称取80mg尼龙毛,将其细致撕匀后装入2ml一次性注射器内,柱高约4cm。
用Hanks液充分浸湿尼龙毛柱,使其内不留气泡,高压灭菌消毒。
使用前用预温至37℃的RP MI1640(含10%胎牛血清,Fetal calf serum,FCS)洗柱后封闭下端出口。
1.1.3 C D8+单克隆抗体(M onoclonal antibody,mAb)包被平皿的制备 取若干个聚苯乙烯平皿,将C D8+mAb溶液(北京邦定公司)100μl加入平皿中,并加入0.05m ol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.5)3ml,混匀,室温下无菌放置40min,磷酸盐缓冲液(P BS, pH7.2)漂洗,加入含1%FCS的P BS,室温下无菌孵育15min, P BS漂洗,4℃保存备用。
1.2 实验动物及分组 4～6周健康BA LB/c小鼠40只,雌雄不限,体重16～20g,由第三军医大学实验动物中心提供。
将小鼠随机分为两组,A 组为正常对照组,以生理盐水代替鸡卵清蛋白(Ovalbumin, OVA,G radeⅡ,S igma公司)致敏和激发小鼠;B组为致敏模型组,给予OVA致敏和激发。
1.3 致敏小鼠模型的建立 分别于第1天、第13天经小鼠腹腔注射OV A10μg和氢氧化铝凝胶(Al(OH)3)20mg混合液;第25天时,将每只小鼠单独置于5L密闭容器中,以1%OV A进行雾化吸入激发,使小鼠暴露在OV A气雾中20～30min直至出现哮喘样发作为止,持续6d。
由402型超声雾化器(上海合力医用器械厂)提供雾化动力。
基金项目:国家自然科学基金资助项目(39870946) 作者简介:程晓明(1973-),女,安徽省淮南市人,博士研究生,医师,主要从事哮喘方面的研究。
电话:(023)68755320 收稿日期:2000208219;修回日期:20002122081.4 外周血、支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavagefluid,BA LF)中嗜酸性粒细胞百分比(percentagesof eosinophils,E OS%)计数及肺组织标本留取1.4.1 外周血及BA LF中E OS%计数 各组小鼠各14只最后一次激发24h后,经腹腔麻醉,行气管切开,收集BA LF5ml,针刺心脏取血约0.5～0.8ml。
将全部液体离心,收集沉淀细胞,加入红细胞裂解液去除红细胞。
用E OS计数液行E OS计数。
1.4.2 肺组织标本留取 打开未经支气管肺泡灌洗的各组各6只小鼠胸腔,观察肺脏的大体改变,剪取部分肺组织,经10%甲醛固定后切片,行HE染色。
1.5 C D4+T细胞的分离及鉴定1.5.1 C D4+T细胞的分离 打开小鼠腹腔,无菌取出脾脏放入冷Hanks液中,将其捻碎并滤过100目无菌钢网,收集脾细胞悬液加入到淋巴细胞分离液中,2000g离心30min,沿管壁轻轻吸出中间灰白色细胞层,重悬于含10%FCS的RP MI1640溶液中;按每1×108个细胞加入尼龙毛柱中,37℃,5%C O2孵箱中孵育1h;打开下端出口,使T细胞悬液以40～60滴(Drop, d)/min流出,用RP MI1640溶液反复洗柱至洗脱液达6～8ml,将细胞悬液按每1×107个加入C D8+mAb包被的聚苯乙烯平皿中,并加入RP MI1640溶液2ml,混匀,4℃作用70min,每20分钟轻轻旋摇1次,沿平皿壁吸取细胞悬液并用RP MI1640溶液轻洗2次,2000g离心10min,收集的细胞悬液即C D4+T细胞。
经台盼蓝计数,细胞存活率>89%。
1.5.2 C D4+T细胞纯度鉴定 采用流式细胞术(Flow cytom2 etry,FC M)鉴定C D4+T细胞纯度[1]。
1.6 统计学分析 各组结果以 x±s表示,各组间比较采用非配对t检验。
2 结果2.1 小鼠致敏模型的肺组织病理改变 致敏组小鼠的肺脏与正常对照组小鼠的肺脏相比体积明显增大,表面肿胀,有多处形状不规则的暗红色充血区。
切面有白色泡沫状渗出物,并可见明显的血管断面。
肺组织切片HE染色可见支气管及血管周围有大量的炎性细胞浸润,以E OS为主,肺间质及肺泡腔内也可见E OS浸润。
细小的支气管963第23卷第3期2001年3月 第 三 军 医 大 学 学 报ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AEV ol.23,No.3Mar.2001内可见粘液栓。
气道上皮多处断裂,基底膜明显增厚且形态不规则。
细支气管平滑肌发生肥厚性增生。
2.2 外周血及BA LF 中E OS %2.2.1 外周血E OS % 致敏组小鼠外周血E OS %(11.0±2.7)与正常对照组(0.7±0.5)比较显著增高(P <0.01)。
2.2.2 BA LF 中E OS % 正常对照组小鼠BA LF 中几乎没有E OS (0.0±0.01),致敏组小鼠BA LF 中E OS %(21.9±4.4)与正常对照组比较显著升高(P <0.01)。
2.3 C D4+T 细胞纯度鉴定结果 经FC M 检测,C D4+T 细胞的纯度为97.3%,见图1。
图1 FCM 检测CD4+T 细胞纯度3 讨论 本实验建立的BA LB/c 小鼠致敏模型病理表现为:肺脏明显水肿,细、小支气管内有多量的粘液栓,气道上皮断裂、脱落,基底膜增厚,支气管及肺血管周围有以E OS 为主的大量炎性细胞浸润,与哮喘的病理学特点相似;同时,此模型小鼠外周血及BA LF 中E OS %显著增加,与哮喘患者外周血及BA LF 中E OS %的改变一致,说明此模型可用于哮喘的实验研究。
Panning 法又称洗淘法。
它是运用抗原与抗体相结合的原理进行细胞分离的一种方法,具有简便,经济、细胞完整性好等特点。
国外在90年代早、中期即将这种方法广泛用于实验中。
随着科学技术的不断进步,目前国外用于分离细胞的方法主要是磁珠分离法[2]和流式细胞仪法[3],但其造价昂贵,在国内并不能普遍开展,故运用Panning 法分离细胞仍不失为一种高效、经济的方法。
本实验用Panning 法分离的C D4+T 细胞经FC M 检测,纯度高,完全可用于进一步的实验研究。
关键词:哮喘;模型;小鼠;C D4+T 细胞 中图法分类号:R -332;R562.25 文献标识码:B参考文献:[1]沈关心,周汝麟.现代免疫学实验技术[M].武汉:湖北科学技术出版社,1998.180-183.[2]H olmes B J ,M acAry P A ,N oble A ,et al.Antigen 2specific CD8+T cellsinhibit IgE responses and interleukin 24production by CD4+T cells[J ].Eur J Immunol ,1997,27(10):2657-2665.[3]Denkers E Y,Scharton 2K ersten T ,Barbieri S ,et al .A role for CD4+NK 1.1+T lym phocytes as major histocom patibility com plex class Ⅱinde 2pendent helper cells in the generation of CD8+effectors function against in 2tercellular in fection[J ].J Exp M ed ,1996,184(1):131-139.(编辑 陈聪连)技术方法文章编号:100025404(2001)0320370202胰肾一期联合移植手术方法探讨Exploration on operation methods in simultaneous pancreas 2kidney transplantation杨彤翰1,张银甫2,杨唐俊2,梁 平1,李 靖1,左国华1,杨清浩2,冯嘉渝2 (第三军医大学附属新桥医院:1肝胆外科;2泌尿外科,重庆400037) 提 要:目的 探讨胰肾一期联合移植手术方法中有关问题。
方法 采用原位低温灌注,整块切除的方法切取供胰。
将供胰移植于病人的右侧髂窝,供肾移植于左侧髂窝,供体十二指肠与受者的膀胱侧侧吻合。
结果 5例病人中,3例术后胰腺及肾脏功能满意,未使用胰岛素,进正常饮食,血糖一直在正常范围,肾功能良好,至今已分别生存20月、14月、11月。
其余2例中,1例因排斥反应,于术后第47天死于急性心功能衰竭。
另1例因血栓形成,于术后第33天切除移植胰腺,但肾功能良好。
结论 胰肾联合移植是治疗Ⅰ型糖尿病伴肾功能衰竭的有效方法之一。
胰肾联合移植术用于治疗糖尿病性肾病,国外开展较早,而国内则少有临床应用的报道[1]。
我院于1998年12月15日开始至今共实施5例,结合文献复习,本研究就术中有关问题进行重点讨论。
作者简介:杨彤翰(1947-),男,山东省莱州市人,教授,主要从事胰腺移植方面的研究,发表论文28篇。
电话:(023)68755114274606 收稿日期:2000210210;修回日期:20012022051 临床资料1.1 一般资料 男3例,女2例,年龄41～53岁,平均年龄48.4岁。