肝动脉门静脉化疗栓塞治疗兔VX2肝癌后残癌新生血管的研究

肝动脉门静脉化疗栓塞治疗兔VX2肝癌后残癌新生血管的研
究
吴鸿峰;余梁;胡茂能
【摘要】Objective To investigate the effect of neovascularization in residual carcinoma of the rabbit VX 2 liver tumor after tran-scatheter arterial chemoembolization ( TACE) combined with selective portal vein embolization ( SPVE) .Methods Forty-two rabbits were randomly divided into two groups .The experimental group ( group A ) was treated with a combination of TACE and SPVE while the control group (group B) was treated with TACE alone.All the rabbits underwent plain and enhanced CT scanning on the 14th and 21st day after tumor implantation.On 15th day they were carried out TACE treatment .On 18th day the rabbits in group A and group B respectively under-went SPVE and portal vein DSA examination .On 22nd day the remaining rabbits were implemented laparotomy and the hepatic artery and por-tal vein were directly punctured for DSA examination and then sentenced to death .The expression of vascular endothelial growth factor ( VEGF) and microvessel density ( MVD) in survival cancerous tissues were detected .Results The value of VEGF and of MVD in group A was(120.70 ±10.99) and (58.90 ±9.05) respectively, and the levels of VEGF and MVD in group B were (136.50 ±15.45) and (71.80
±12.06) respectively.The difference betwe en the two groups was statistically significant (P<0.05).Conclusion Portal veins supply blood to the periphery of liver cancer tissues and TACE combined with SPVE can
improve the degree of tumor necrosis and inhibit an -giogenesis .%目的研究经导管肝动脉化疗栓塞(TACE)联合选择性门静脉栓塞(SPVE)治疗兔VX2肝癌对残癌组织新生血管生成的影响.方法 42只实验兔,采用随机数表法分为实验组(A组)和对照组(B组),每组21只.A组行TACE联合SPVE治疗,B组单纯行TACE治疗.A、B两组于第14、21天,行CT平扫+增强扫描,第15天行TACE治疗,第18天分别
行SPVE和门静脉数字减影血管造影(DSA)检查,第22天开腹行直接穿刺肝动脉和门静脉DSA检查并处死,取肿瘤周边残癌组织,检测血管内皮细胞生长因子(VEGF)
及微血管密度(MVD)的表达情况.结果A组VEGF、MVD值分别为(120.7±10.99)、(58.9±9.05),B组VEGF、MVD值分别为(136.5±15.45)、(71.8±12.06),两组差异均有统计学意义(P<0.05).结论门静脉对周边的肝癌组织具有部分血供,且TACE联合SPVE能够提高肿瘤的坏死程度,抑制新生血管的生成.
【期刊名称】《安徽医学》
【年(卷),期】2017(038)012
【总页数】4页(P1513-1516)
【关键词】肝动脉化疗栓塞;门静脉栓塞;VX2肝癌;血管内皮生长因子;微血管密度【作者】吴鸿峰;余梁;胡茂能
【作者单位】230022 安徽医科大学合肥第三临床学院(合肥市第三人民医院)影像
中心放射科;230022 安徽医科大学合肥第三临床学院(合肥市第三人民医院)影像中心放射科;230022 安徽医科大学合肥第三临床学院(合肥市第三人民医院)影像中心放射科
【正文语种】中文
肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一，WHO国际癌症研究中心估计，2012年全球肝
癌新发病例约78.24万例，死亡74.55万例，中国肝癌发病39.48万例，死亡38.32万例[1]。

由于起病隐匿，患者早期常没有明显症状，大部分患者发现时，
已处于中晚期阶段，且多发生于乙型肝炎及肝炎后肝硬化后，行肝癌外科切除手术困难。

肝动脉化疗栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)是目前治疗中晚期肝癌的首选术式。

但临床发现，肝癌经充分的TACE治疗后，仍存在肿瘤栓塞不完全及复发和转移。

肝脏是由肝动脉和门静脉共同供血，国内外学者[2]由此推测，门静脉也可能参与肝癌供血，肝动脉化疗栓塞后，门静脉血供增强，导致TACE术后肝癌的复发和转移。

因此，本研究主要通过探讨TACE联合选择性门静脉栓塞(selective portal vein embolization，SPVE)术后残癌组织内血管内皮
生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和微血管密度(microvascular density，MVD)表达状况，分析相关影像学检查结果，进一步明
确肝癌血供来源及TACE联合SPVE对残癌内新生血管的影响。

1.1 材料
1.1.1 实验动物后腿肌肉内VX2瘤新西兰种兔1只，健康新西兰大白兔42只，体质量1.9～
2.6 kg，雌雄不拘，普通饲料喂养。

1.1.2 实验设备、器材及药品 GE INNOVA-3100IQ DSA，自制兔手术台，苯巴比妥钠(福建省闽东力捷迅药业有限公司；批号：160607)，利多卡因(中国大冢制药；批号:7B78J2)，超液态碘化油(Guerbet；批号：13LU605A)，表阿霉素(山东新时代有限公司；批号：155170604)，碘佛醇(江苏恒瑞；批号：170604DC)，4F经皮肝穿扩张管，穿刺针，3F SP微导管(库克公司)、微导丝(库克欧洲公司)，眼科剪，眼科镊，动脉夹，鼠抗人CD34、VEGF单克隆抗体试剂盒(武汉博士德)等。

1.2 方法
1.2.1 兔VX2肝癌模型的建立苯巴比妥钠(100 mg/kg)静脉麻醉，经耳缘静脉推
注全麻后，无菌条件下，依次切开荷瘤种兔后腿皮肤和皮下软组织，剥离瘤体，去除坏死组织，剪取瘤体边缘生长旺盛的鱼肉样肿瘤组织，置于生理盐水中，再将上述组织用眼科剪剪成约0.5 mm3大小的瘤块，于实验兔剑突下，偏左侧开腹1.5 cm，直视以4F经皮肝穿扩张管，斜行轻柔刺破肝左叶包膜插入约1 cm，用内芯推入瘤块3～4个，拔出鞘管后，压迫穿刺通道，确认无出血后，缝合伤口，连续肌内注射青霉素3 d，40万U/d，以预防感染。

1.2.2 实验设计对实验兔进行接种肿瘤后，通过CT扫描证实，42只接种成功且符合实验要求(单一肿瘤灶)。

采用随机数表法分为实验组(A组)和对照组(B组)，每组21只。

接种肿瘤后第15天，A、B两组行经股动脉-肝动脉化疗栓塞，将微导管
超选至肝左动脉内，在数字减影血管造影(digital subtraction angiography，DSA)设备严密监视下，注入混合乳剂0.4 mL(碘油和表阿霉素2 mL∶5 mg配置)，术后拔管，结扎右侧股动脉，缝合切口，消毒包扎。

第18天，A组另行SPVE，
通过肠系膜静脉超选至门静脉肝左叶分支，注入超液态碘化油1.5 mL，根据实时
造影显示，适当增减栓塞剂量。

B组行门静脉DSA检查，注入1.5 mL生理盐水。

第21天，两组行肝脏CT检查，第22天，行直接肝动脉和门静脉穿刺DSA检查。

检查完成后，处死所有实验兔，取肝脏，保存在40%甲醛水溶液中，送病理检查。

1.2.3 病理学检查所有实验兔肝脏的病理标本均以病灶边缘残癌为中心取材，同时包含癌组织和癌旁组织。

用10%的甲醛溶液固定后，石蜡包埋，切成4 μm薄片，经HE染色后，用鼠抗人 CD34、VEGF 单克隆抗体试剂检测MVD和VEGF，操
作步骤严格按照试剂盒进行。

1.2.4 免疫组化结果判定 VEGF表达[3]：肿瘤细胞内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。

低倍镜下，寻找阳性细胞分布较集中的区域，再用400倍光镜观察，在阳性细胞
分布密集的区域，随机选取5个观察区域，分别计数每个区域内的阳性细胞数，
取平均值。

MVD计数[4]：肿瘤组织及其邻近间质内出现棕黄色颗粒的内皮细胞或内皮细胞簇，即被认为是单个微血管。

低倍镜下，观察整张切片的情况，寻找微血管密度最高的5个区域，采用计算机病理图像分析系统，200倍光镜下，计数每个区域微血管的数目，计算平均值，即为微血管密度值。

1.3 统计学方法应用SPSS 2
2.0进行统计分析，计量资料以表示，两组间均数比
较采用t检验，相关性分析采用Pearson相关分析，以P<0.05为差异有统计学
意义。

2.1 CT扫描表现接种第14天时，肝脏CT扫描显示，42只实验兔肝脏接种肿瘤
成功，且符合实验要求。

肿瘤直径l.3～2.2 cm，平扫多呈等密度，中心部分坏死
区呈低密度，边界欠清，小部分病灶具有分叶征。

肿瘤于动脉期呈明显边缘环形强化，中心坏死区则无明显强化，肿瘤与周围肝实质分界更加清晰。

门静脉期和平衡期，肿瘤周边环状强化减退，与周围明显强化的肝实质界限明显。

接种第21天时，实验兔肝脏CT平扫显示，碘化油在肿瘤周边区呈不规则环状或小片状致密沉积，肿瘤Ⅲ期增强扫描，无明显强化。

2.2 DSA检查表现接种后第15天，42只实验兔均成功施行经导管股动脉-肝动脉DSA检查。

造影显示，肝左动脉向肿瘤供血，部分肿瘤呈环状染色，并逐渐向中
央部位充填，部分肿瘤直接表现为结节状染色，肿瘤供血动脉的末端分支增多，走形紊乱，血管推移，或呈包绕征，形成肿瘤血管，勾勒出肿瘤形态。

经肝左动脉注入混合乳剂后，混合乳剂多沉积于肿瘤周边部位，肝左动脉逐渐闭塞。

第18天，门静脉DSA显示所有实验兔门静脉走形及分支均未见异常，肿瘤未见染色。

A组
行肿瘤侧门静脉分支栓塞术后，其中1只实验兔死亡。

B组在门静脉造影过程中，死亡1只。

第22天，每组20只实验兔行直接穿刺肝动脉和门静脉造影检查显示，肝左动脉狭窄闭塞，肿瘤未见明显染色，A组实验兔肿瘤侧门静脉分支栓塞后仍闭塞。

2.3 病理学表现光镜下，可见肿瘤大片状坏死，细胞膜破裂，核碎裂明显，细胞
器崩解，未坏死肿瘤细胞多呈圆形及不规则形，体积较大，染色欠均，呈巢状或弥漫分布，排列无规律，细胞核大而浓染，核分裂像多见。

2.4 免疫组化结果两组实验兔的免疫组化结果进行比较，VEGF值、MVD的差异
均有统计学意义(P<0.05)，且VEGF值与 MVD 值呈正相关(r=0.338 P=0.033)。

见表1、图1。

VX2肿瘤是由Shope病毒在兔皮肤上诱发的鳞状细胞癌，经过72次移植传代后，正式建立和命名[5]。

VX2兔肝癌模型具有特征性结构简单，实验周期短，成功率高，重复性好等特点。

此外，由于VX2肿瘤细胞的侵袭特点与人类原发性巨大肝
癌相似，所以作为肝癌最大的实验动物模型在肝癌的研究中得到了广泛的应用[6]。

肝癌是一种典型的血液供应十分丰富的恶性肿瘤，其发生、发展和转移与肿瘤血管生成密切相关，肝癌肿瘤血管生成是肝细胞肝癌生长和转移的先决条件。

国内学者[7-8]分别通过超声、CT研究显示肝癌主要由肝动脉供血，徐晓燕等[9]研究发现
肿瘤在门静脉期会出现不同程度灌注增强，在肿瘤周边肝实质，门静脉供血丰富。

所以门静脉是否对肝癌供血仍有争议。

在本研究中，A组周边残癌组织中，VEGF
表达均低于单纯行TACE的B组，说明A组肝癌细胞坏死程度较B组更加明显，
致使VEGF分泌减少，间接推断门静脉对周边残癌组织是有血供的，但门静脉DSA未见肿瘤染色，表明门静脉对肿瘤血供较少。

由此可推断：VX2肝癌的中心
部分主要由肝动脉供血，周边则可能由肝动脉及门静脉双重供血。

TACE治疗后，向中央部分供血的肝动脉被栓塞，同时，在化疗药物的持续作用下，肿瘤细胞坏死，造成VEGF分泌减少，而肿瘤周边部在肝动脉被栓塞后，仍有门脉供血，肿瘤细
胞未完全坏死，残癌细胞在缺血、缺氧作用下，VEGF分泌增加，促进了新生血管的生成。

但对肿瘤行TACE联合SPVE后，门静脉对残癌细胞供血同样被中断，致使残癌细胞也明显坏死。

VEGF是促进肿瘤新生血管生成作用最强的一种血管生成因子[10]。

并且通常认为肿瘤细胞可以自分泌VEGF来改善其自身血管系统的形成。

VEGF及其受体在肝癌组织中较正常肝组织表达增高，并与肝癌的复发密切相关[11]。

由于肝癌细胞在生长、增殖过程中，对氧和营养物质强烈需求，导致癌组织内缺氧、缺血严重，而缺氧是VEGF最强烈的诱导剂[12]。

MVD能反映实体肿瘤血管生成的指标，与实体肿瘤的细胞营养和供氧有关，也反映了肿瘤的浸润和转移能力[13]。

王滨等[14]对肝癌患者行TACE治疗后，可导致肿瘤残癌组织中VEGF表达较未行TACE的患者显著增高。

鲁东等[15]在动物实验中也发现了上述情况，并且MVD值与VEGF表达呈正相关。

赵增虎等[16]研究发现，患者经TACE治疗后，肿瘤中央VEGF表达明显低于肿瘤周边部位，且差异有显著差异。

在本实验中，A组残癌组织样本VEGF、MVD表达较B组减少，差异有统计学意义(P<0.05)，表明TACE联合SPVE，对残癌新生血管的生成具有更强的抑制作用。

MVD值与VEGF表达呈正相关，这提示VEGF可促进肿瘤新生血管形成。

综上所述，门静脉对周边的肝癌组织具有部分血供，TACE联合SPVE能够提高肿瘤的坏死程度，抑制新生血管的生成，对中晚期肝癌的治疗具有一定的指导意义。

【相关文献】
[1] TORRE L A,BRAY F,SIEGEL R L,et al.GLOBOCAN 2012:estimated cancer
incidence,mortality and prevalence worldwide in 2012[EB/OL].http://globocan.ia-
rc.fr/Pages/online.aspx,12-12-2013/2017-04-25.
[2] 郑进方,李龙浩,吴昌雄,等.彩超观察肝癌经肝动脉栓塞化疗前后门静脉血供的动态变化[J].实用医学杂志,2012,28(2):256-258.
[3] KARAVASILIS V,MALAMOUMITSI V,BRIASOULIS E,et al.Angiongenesis in cancer ofunknown primary:clinicopathological study of CD34,VEGF and TSP-1[J].BMC Cancer,2005,5(1):1-7.
[4] ABDOU A G,AIAD H,ASAAD N,et al.Immunohistochemical evaluation of vascular endothelial growth factor(VEGF) in colorectal carcinoma[J].J Egypt Natl Canc
Inst,2006,18(4):311-322．
[5] KUSZYK B S, BOITNOTT J K, CHOTI M A, et al.Local tumor recurrence following hepatic cryoablation: radiologic-histopathologic correlation in a rabbit
model[J].Radiology,2000,217(2):477-486.
[6] XU C S，SU Y J，XU M,et al.Correlation between blood circulation grading and angiogenesis usingultrasonic contrast of rabbit VX2 hepatic carcinoma[J].Asian Pac J Trop Med,2016,9(2):153.
[7] 吴晓宁.彩色多普勒超声对原发性及转移性肝癌血供情况的对比分析[J].中外医
疗,2015,34(14) :172-173.
[8] 袁丙阳,贾晓辉.螺旋CT肝动脉期及三维重建对原发性肝癌供血血管及血供情况的评价[J].实用中西医结合临床,2017,17(5):114-114.
[9] 徐晓燕,马苏美,赵威武.门静脉超声造影在肝细胞肝癌血供分析中的应用[J].甘肃医
药,2016,35(11):835-837.
[10]KRSIZER Y, MAWASI N, SEAGAL J,et al.Vascular endothelial growth factor andangiopoietin in liver regeneration[J].Biochem Biophys Res Commun,2001,287(1):209-215.
[11]MARTI H H,RISAU W.Systemic hypoxia changes the organ-specific distribution ofvascular endothelial growth factor and its receptors[J].Proc Natl Acad Sci
USA,1998,95(26):15809-15814.
[12]黄晓武,樊嘉,吴志全,等.肝细胞肝癌与局灶性结节性增生微血管的免疫组化染色比较[J].中华肝胆外科杂志,2004,10(11):756-758.
[13]SHIVAKUMAR S,PRABHAKAR B T,JAYASHREE K,et al.Evaluation of serum vascular endothelialgrowth factor (VEGF) and microvessel density (MVD) as progno-stic indicators in carcino-ma breast[J].J Cancer Res Clin Oncol,2009,135(4):627-636.
[14]王滨,徐辉,曹贵文,等.肝动脉化疗栓塞对肝癌肿瘤新生血管生成及血管内皮细胞生长因子表达的影响[J].中华放射学杂志,2005,39(2):204-206.
[15]鲁东,吕维富,高斌,等.兔VX2肝癌肝动脉栓塞术后肿瘤新生血管的变化与分析[J].中国介入影像与治疗学,2010,7(3):305-308.
[16]赵增虎,张建宇,刘秀芳,等.TACE对原发性肝癌VEGF和MVD的影响[J].中国误诊学杂
志,2007,7(4):717-718.。