全合成人源单骨架抗体库的构建及初步筛选
抗体文库构建方法
抗体文库构建方法
抗体文库构建的方法主要包括以下步骤：
1. 免疫动物：选择适合的动物，如年轻、健康的动物，进行免疫。
通常在2个月的时间跨度内，动物被注射4-8次目标抗原和佐剂的混合物。
每次注射约50-200μg免疫原，确切数量取决于抗原分子量、免疫原性和/或毒性。
2. 淋巴细胞提取：免疫接种后，取抗凝血（通常来自颈静脉，也可以是淋巴结活检），制备淋巴细胞。
3. mRNA提取：提取淋巴细胞的mRNA。
4. cDNA合成：将mRNA转化为cDNA。
5. VHH基因扩增：使用两步巢式PCR扩增VHH基因。
6. 构建抗体库：将VHH基因与适当的表达载体（如噬菌体或酵母）连接，转化宿主细胞，建立抗体库。
7. 筛选抗体：通过各种筛选方法（如抗原亲和筛选、免疫沉淀等）从抗体库中筛选出目标抗体。
8. 抗体优化：通过亲和力成熟、突变引入等方法对筛选出的抗体进行优化，提高其亲和力和特异性。
9. 抗体表达与纯化：将优化的抗体基因转染到适当的表达系统中，表达并纯化抗体。
10. 抗体表征：对纯化的抗体进行表征，包括亲和力、特异性、免疫原性等方面的分析。
以上步骤仅供参考，建议咨询专业人士获取准确信息。
PD-1PD-L1抗体的制备与鉴定研究
PD-1/PD-L1抗体的制备与鉴定研究免疫检查点是在人体内免疫调控过程中的可以下调免疫效应细胞激活反应的关键因子,而PD-1正是T细胞上的重要免疫点之一。
肿瘤细胞通过在其细胞膜表面高表达PD-L1与T细胞表面的PD-1结合,向吞噬细胞发出“Do not eat me”的信号,从而促进抗原特异性T细胞的凋亡,减少调节性T细胞的凋亡,最终实现免疫逃逸。
阻断型抗体是通过阻断PD-1、PD-L1之间的信号传递,减少调节性T细胞的凋亡,从而增强T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
本研究以获取PD-1、PD-L1单克隆抗体为目的,通过病毒免疫技术、杂交瘤技术、全合成人源抗体库筛选技术等,获得了可以特异性识别PD-1蛋白的单克隆抗体4G9及PD-L1蛋白的单克隆抗体1A7。
首先,通过病毒包装的方式,产生滴度为1×10<sup>6</sup>TU/mL PD-1慢病毒颗粒。
同时利用大肠杆菌表达系统制备浓度为0.54mg/mL,纯度>85%的PD-1ECD重组蛋白用于接下来的抗体检测实验。
利用病毒颗粒感染小鼠,已达到抗原免疫的效果,其效价大于1:2.6×10<sup>7</sup>。
接着利用细胞融合技术获取7株可以产生特异性抗体的杂交瘤细胞,经过三次克隆化后得到与抗原结合能力最强且可以稳定分泌特异性识别PD-1的单克隆抗体4G9,并对其进行体外检测。
经鉴定4G9单抗属于IgG2a、κ亚型。
通过小鼠腹水制备的方法大量制备抗体随后经Western-Blot检测其特异性,其纯化后腹水与抗原亲和力常数为5.15×10<sup>8</sup>L/mol。
利用间接ELISA的方法检测反复冻存后细胞结合能力,结果表明4G9细胞株可以稳定分泌抗PD-1蛋白的单克隆抗体。
基于以上鉴定结果,4G9是一株具有良好特异性结合能力的单抗细胞株。
人源化单克隆抗体制备工艺
速度极快, 最快在1 周内即可完成抗体的分离工作。
核糖体展示技术
1997 年Hanes 等在Mattheakis 等的多聚核糖体展示技术的基础上 进行改进建立了核糖体展示技术。
基本ne,September 26, 2012
一、Molecular Modeling and Structural Analysis of D9 Fv
D9 VH and VL mRNA was extracted from D9 hybridoma cells, amplified by Reverse Transcription-PCR and then sequenced. The deduced amino acid sequences are shown here.
抗体药物市场销售额增势不减，世界各国纷纷投入巨资开发这座“金 矿”，全球医药巨头，如辉瑞、罗氏、诺华等更是不惜重金开发抗体 药物。国内方面，成都康弘的郎沐表现出色，2014年上市8个月实现销 售额1亿元，2015年销售额约3亿元。
在临床实践中，抗体药物也呈现愈发活跃的状态。美国詹森研究开发 有限责任公司副总裁威廉·R·斯特罗尔表示，过去十年间，多种抗体治 疗方法和新平台已被设计研发，未来抗体治疗的范围将进一步扩大。 “目前一些针对免疫肿瘤学的抗体已被研发，即将进入临床，为癌症 患者、免疫功能紊乱、代谢障碍等患者提供更多治疗方法。”
抗体的现状
从1992年首个抗体药物Orthoclone上市以来，截至2016年03月，欧美日 等主要市场共上市了61个抗体药物。2014年上市了6个抗体药物，2015 年上市了9个抗体药物，连续两年打破历史记录。2015年，61个抗体药 物合计销售额达到906亿美元，与2014年相比增长了8.2%。从销售数据 来看，前21位的抗体药物都超过了10亿美元。
单克隆抗体
单克隆抗体生物技术制药之单克隆抗体【摘要】杂交瘤技术使鼠源单克隆抗体被广泛用于人类疾病的诊断和研究，建立了治疗性抗体的第一个里程碑。
随着生物学技术的发展和抗体基因结构的阐明，应用ＤＮＡ重组技术和抗体库技术对鼠单抗进行人源化改造，先后出现了嵌合抗体、人源化抗体和全人抗体，它们从不同角度克服了鼠单抗临床应用的不足，使抗体制备技术进入了一个全新的时代。
【关键词】单克隆抗体、分类、制备、纯化、应用【前言】1975年Koehler和Milstein创立了体外杂交瘤技术(Koehler等,1975)，得到了鼠源性单克隆抗体，开始了多克隆抗体走向单克隆抗体的新时代。
与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有无可比拟的优越性，它具有特异性高、效价高、纯度高、理化性状均一、重复性强、成本低并可大量生产等优点。
鼠源性单抗应用于人类有较强的免疫原性，但主要缺陷是诱发人抗鼠抗体（human anti－mouse antibody，HAMA）反应，其次是鼠单抗不能有效地激活人体的生物效应功能，因此限制了其临床应用(Dhar等，2004)。
减少或避免HAMA反应并提高疗效的主要途径是鼠源性单抗人源化，随着对各类抗体结构和氨基酸序列及其变异的种属和功能之间关系的深入了解，而能够利用抗体工程技术对抗体结构进行改造。
抗体的应用经历了非人源抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体，最终到制备全人源单抗的转基因小鼠和噬菌体展示文库等不同的阶段。
1、单克隆抗体定义抗体主要是由B淋巴细胞合成，每个B淋巴细胞有合成一种抗体的遗传基因。
动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，含遗传基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。
当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞，被激活的B细胞分裂增殖形成该细胞的子孙，即克隆由许多个被激活B细胞的分裂增殖形成多克隆，并合成多种抗体。
如果能选出一个制造一种专一抗体的细胞进行培养，就可得到由单细胞经分裂制增殖而形成细胞群，即单克隆。
抗CCR7单链抗体的筛选及初步鉴定
３ Ｎ ｔｔｎＤｖ ｉ ｈ ｆ ｉｔ ｏ ｉ ｌ ｄ ａ Ｃ ｌｇ ， ｉ ｄｏＵ ｉ ｒｔ， ｉ ｄｏＳａ ｄｎ ２ ６ ０ ，ｈｎ ． ｕｒｉ ｉｓ ｎｏ ｅＡ ｌ ｅ Ｈ ｓ ｔ ， ｉ ｌ ｏｌ ｅＱｎ ａ ｎｖ ｓｙ Ｑｎ ａ ｈｎ ｏｇ ６０ ３ Ｃ ｉ ｉｏ ｉｏ ｆｔ ｆ ａ ｄ ｐ ａ Ｍｅ ｃ ｅ ｉ ｇ ｅｉ ｇ ａ；
化 Ｅ ｃｌＨＢ １１ ．ｏｉ ２ ５ 进行 可溶表达 。抗 体亲 和层 析纯化 后 ， 经
Ｗｅｔｒ ｌ 鉴定 ， ｓ ｎｂｏ ｅ ｔ 通过 Ｅ ＩＡ法 检测可 溶性 Ｓ Ｆ ＬＳ ｃｖ抗体 的免 疫 活性 。免疫细胞化学和放射免疫显像 鉴定 ｓＦ ｃｖ抗体与 乳
腺癌细胞结 合 的特异 性 。结果 Ｓ Ｆ ｃｖ基 因插入 率 为 ９ ％ ０
收稿 日期 ：０ ９—１ ２０ ２—２ ， 回日期 ：０ ０一Ｏ ２ ５修 ２１ １— ８ 基金项 目： 国家 自然科学基金资助项 目（ ｏ３ ３０ ２ ） Ｎ ０７ ４ ２
作 者 简介 ： 春 波 （ ９ ０一） 男 ， 士 生 ， 师 ， 究 方 向 ： 瘤 基 因 樊 １８ ， 硕 医 研 肿
４０ １） ００ ６ （ 重庆 医科大 学 １ 放射 医学教研 室、 ． ． ２ 附属 第一 医院核 医学科 ， 重庆
中 国 图书 分 类 号 ： ９ ． １ Ｒ３ ４ ３ Ｒ７ ７ ９ ３ Ｒ ３２ １ ； ９ ． ； ３ ．０
（ ８２ ） 双酶切鉴定 检测到 目的条带 。经 ４轮 细胞筛选 ， １／ ０ ， ３
Ｅ ｃｌＨ ２ ５ ．ｏ Ｂ １ １中实现可溶表达。Ｗｅｔ ｎｂｏ结 果显示获得 ｉ ｓ ｒ ｌｔ ｅ 抗体相对分子质 量为 ３ ｕ左 右。免疫 细胞化学 检测 与放 ４ｋ
双峰驼天然单域抗体库的构建及鉴定
双峰驼天然单域抗体库的构建及鉴定包福祥;芦婷;阿米娜;赵鑫鑫;邬春艳;温靖;杜雅楠【摘要】重链抗体的可变区VHH是目前天然存在的具有完整功能的最小抗体分子片段,该抗体在基础研究、药物开发等领域应用前景极为广阔.为了构建双峰驼天然单域抗体库并对其进行初步鉴定,从5峰未经免疫的健康骆驼全血中分离淋巴细胞,提取其总RNA,之后反转录为cDNA,利用PCR技术扩增全套编码重链抗体可变区的基因序列,将经过回收并酶切纯化的VHH序列克隆到噬菌体载体上,电转化大肠杆菌TG1感受态细胞,共转化343次.结果表明,构建的双峰驼天然单域抗体库库容为4.4×107,转化阳性率为75%,多样性良好,体现为CDR3区碱基序列及长度存在显著差异.成功地构建了双峰驼天然单域抗体库,为今后从中筛选出具有应用价值的特异性单域抗体奠定了基础.【期刊名称】《畜牧与饲料科学》【年(卷),期】2017(038)005【总页数】7页(P1-7)【关键词】双峰驼;天然抗体库;单域抗体;噬菌体展示技术【作者】包福祥;芦婷;阿米娜;赵鑫鑫;邬春艳;温靖;杜雅楠【作者单位】内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;山东英才学院,山东济南 250104;内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特 010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特 010018;内蒙古农业大学兽医学院,内蒙古呼和浩特010018;农业部动物疾病临床诊疗技术重点实验室,内蒙古呼和浩特 010018【正文语种】中文【中图分类】S858.242.41993年，比利时研究者Hamers-Casterman等［1］发现并报道在骆驼血清中存在着一种天然缺失轻链和重链恒定区、仅由2条重链构成的抗体。
抗体库的构建过程
抗体库的构建过程1. 引言抗体库（antibody library）是一种用于存储和筛选抗体的资源库。
通过构建抗体库，研究人员可以收集并保留大量的抗体样本，以便在需要时进行筛选和鉴定。
本文将详细介绍构建抗体库的过程，包括样本采集、抗体生产、抗体纯化和抗体标记等关键步骤。
2. 样本采集样本采集是构建抗体库的第一步，其目的是收集来源广泛、种类丰富的抗体样本。
常用的样本来源包括动物、人体和细胞培养物等。
2.1 动物样本采集动物样本采集是最常见的样本来源之一。
常用的动物包括小鼠、大鼠、兔子等。
采集动物样本时，需要注意以下几点：1.选择健康的动物，确保其免疫系统正常；2.选择合适的采集方式，如血液采集、脾脏切片等；3.根据实验需要，选择不同时间点的样本，以获得不同抗体的变化情况。
2.2 人体样本采集人体样本采集是研究人员获取人体抗体的重要途径。
常用的人体样本包括血液、血清和组织等。
在采集人体样本时，需要遵守伦理法规，并征得被试者的知情同意。
2.3 细胞培养物样本采集细胞培养物可用于获得特定抗体。
在样本采集过程中，需要注意以下几点：1.选择适当的细胞类型，确保其具有抗体的表达能力；2.采用合适的培养条件，如温度、培养基组成等；3.选择合适的收获时间点，以获得丰富的抗体产量。
3. 抗体生产抗体生产是构建抗体库的关键步骤之一。
抗体可以通过多种方法进行生产，包括动物免疫、细胞培养和重组技术等。
3.1 动物免疫法动物免疫法是最传统的抗体生产方法之一。
它通过将目标抗原注射到动物体内，刺激其免疫系统产生相应的抗体。
具体步骤如下：1.选择适当的动物，如兔子、小鼠等；2.设计合适的免疫方案，包括抗原的剂量、注射次数等；3.在免疫完成后，采集动物血液，获得免疫血清。
3.2 细胞培养法细胞培养法是一种常用的抗体生产方法。
通过将抗原加入细胞培养物中，刺激细胞产生抗体。
具体步骤如下：1.选择适当的细胞类型，如B细胞、淋巴细胞等；2.将抗原加入细胞培养物中，培养一定时间以促进抗体产生；3.收集培养物，分离和纯化抗体。
抗体工程介绍
抗体库技术的应用
● 人源抗体的制备 ● 抗体性能的改良 ● 不经免疫制备抗体
用噬菌体抗体库技术制备人源抗体
◆ 鼠单抗人源化——抗原表位导向选择 （epitope guided selection）
◆ 从免疫个体构建噬菌体抗体库进行筛选 ◆ 从总抗体库筛选（不经免疫制备抗体）
利用抗体库技术改良抗体性能
纯合小鼠的产生和鉴定 纯合小鼠制 的先导系列的紧靠下游
外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端
用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、方便、简捷、高效地筛选出 表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。
筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌
使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体片段， 经过纯化即可获得目的抗体。
全合成库：尚无证实报道，据初步资料 效果颇佳，构建难度大
转人Ig基因小鼠
获取人Ig基因：构建人Ig的YAC及筛选 小鼠胚胎干细胞培养小鼠内源性Ig基因的敲除 获得完整人Ig-YACs克隆 Ig-YACs克隆小ES细胞的导入 含人Ig-YACs的ES细胞移入小鼠胚胎 含人Ig-YACs的ES细胞的小鼠胚胎向小鼠体内送还嵌合
抗体生成三要素
多样性B细胞群体（repertiore ） 克隆选择
亲和力成熟
总抗体库(master library)的构建 抗体库容量
多次构建累积
目前报道最大库容在109-1010
组合感染法
最大库容 6.5X1010
组 合 感 染 法 构 建 抗 体 库
构建策略
天然抗体库 半合成抗体库 全合成抗体库
噬菌体表面呈现的小分子抗体
抗 体 库 的 构 建
抗体库的富集筛选
人源性抗核抗体Fab片段抗体库的构建筛选及鉴定的开题报告
人源性抗核抗体Fab片段抗体库的构建筛选及鉴定的开题报告一、背景人类免疫球蛋白是一种在机体免疫防御过程中起重要作用的蛋白质，主要由四个多肽链组成：两个重链和两个轻链。
重链和轻链各自有不同的区域，其中即含有可与外来抗原结合形成免疫复合物的抗原结合部位（Fab片段），也称为抗原识别部位，同时重链和轻链之间的连接区域（Fc片段）可结合多种配体，包括细胞受体、补体蛋白等。
Fab片段与抗原的结合是通过氨基酸残基，如互补决定区（CDR）等进行特异性配对，因此将其提取并经过相应筛选后可对细胞表面的分子进行高效特异性识别，被广泛应用于临床诊断、药物开发等领域。
本研究旨在构建人源性抗核抗体Fab片段抗体库，并通过鉴定、筛选，获取能与抗核抗体特异结合的Fab片段抗体，为进一步研究自身免疫性疾病等相关领域提供有力支持。
二、研究内容及方法1.构建人源性抗核抗体Fab片段抗体库本实验将以人源性抗核抗体为模板，采用RT-PCR技术将其Fab片段DNA序列克隆到质粒载体中，将质粒从E.coli菌株中提取，再经过限制酶切和琼脂糖凝胶电泳等方法进行鉴定。
最后将合格的Fab片段DNA序列基因克隆到噬菌体抗体库质粒中构建成Fab片段抗体库。
2.进行Fab片段抗体筛选将构建好的Fab片段抗体库与靶抗原结合，经过洗涤、脱离、重复上述步骤，以免疫学实验技术如ELISA、Western blot等方法进行鉴定与筛选，最终获得能够对抗核抗体进行特异性结合的Fab片段抗体。
3.鉴定和验证Fab片段抗体对筛选出来的Fab片段抗体进行功能验证，在体内和体外中都可以使用，检测目标分子的表达水平和分布情况，验证其特异性和亲和力。
三、研究意义本研究将建立人源性抗核抗体Fab片段抗体库，厘清自身免疫性疾病的发生机理，有效提高诊断准确率，为药物研发提供新的靶标和研究思路，使得人类免疫球蛋白的应用领域更加广泛。
单域抗体的研究和应用进展
关键词：重链抗体；单域抗体；骆驼；纳米抗体；
传统抗体分子（Ig G）在结构上是由两条相同的重链和两条相同的轻链组成，此种结构在哺乳动物中均是非常保守的。抗体分子的轻链包含了一个VL区和一个CL区（图1）,而重链则拥有1个VH区和3个CH区（CH1、CH2和CH3）.VH区和VL区之间通过二硫键相互连接形成抗体的可变区（Fv）,是抗体识别抗原的最小单位，抗体可变区的序列差异决定了抗体能够特异地识别不同的抗原。而CL区和CH区则是相对保守的，被称为抗体的恒定区，其中CH区的CH2和CH3两个区域对于抗体招募免疫细胞发挥ADCC（抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用）和CDC（补体依赖的细胞毒性作用）功能有着重要的作用[1-2].
由于不存在传统抗体的轻重三大类：免疫库、天然库和全合成库。免疫库是指从预先免疫过的动物（如羊驼等）体内通过特异性富集靶抗原特异的B细胞基因，并扩增。免疫库的受限因素在于免疫原的特征，不同免疫原在动物中的体液免疫应答强弱和表位差异均可能影响最终获得抗体的质量和多样性，最终筛选到的抗体同质化（如识别的表位相同等）程度较高。天然库是采用未经靶抗原免疫动物的B细功率基本与库容成正比，理论上只要所构建的抗体库库容和多样性足够大（>10 CFU/m L）,即可从中筛选到针对各种靶抗原的高亲和力单域抗体，甚至是针对哺乳动物中高度保守的抗原（类似自身抗原）的单域抗体。尽管天然库已具有较高多样性，但由于在实际建库操作中，会因抗体基因家族的偏向性、先天免疫耐受导致的克隆缺失等原因导致多样性降低。直接采用基因合成方法构建的合成单域抗体库可通过调节抗体分子中抗原结合区域附近的骨架区域来进一步提高库的多样性，也可直接基于人源化的VHH分子骨架进行合成构建。Sandrine Moutel等新近采用全合成的方法构建了人源化的通用单域抗体库Na Li-H1,库容达到3×10,并从中成功筛选到若干针对不同靶标的高亲和力单域抗体（k D达到10mol/L–10mol/L）[17].
核糖体展示
背景
筛选技术主要有两类: 体内筛选技术,如噬菌体展示技术、选择性感染 噬菌体技术等。存在一定的限制: 体外筛选技术,如核糖体展示技术。
1必须经过细菌转化的步骤 2抗体库的容量不能超过1010 3而且在表达某些候选抗体分子时,大肠杆菌宿主 菌的生长被抑制或者由于其毒性作用而不能生长, 导致亲和筛选的偏差 4另外,亲和筛选时,具有极高亲和力的抗体分子与 抗原结合后,很难被洗脱,所以无法捕获其编码基 因。 5采用噬菌体展示技术进行抗体分子定向进化时, 除了以上各种限制之外,基因突变与表型筛选之间 的转换也很烦琐。
谢谢
筛选到抗牛胰岛素的单链抗体，与建库的原始 抗体比较，亲和力提高40倍。 2. 3.
核糖体展示技术原理及分类
• 1997年Pluckthun提出的以RNA-核糖体蛋白质三聚体形式的核糖体展示技术 • Roberts等设计的mRNA-多肽融合技术 • 2002年zhou JM等改进的核糖体失活展示 技术
核糖体展示技术的实际运用核糖体展示技术原理及分类1997年pluckthun提出的以rna核糖体蛋白质三聚体形式的核糖体展示技术2002年zhoujm等改进的核糖体失活展示技术核糖体展示技术的基本流程firstgenerationmrna多肽融合技术的基本流程secondgenerationdnalibaryrtartartartarta核糖体展示技术在构建及表达scfv中的应用从免疫小鼠的脾脏中提取总rna体外转录成mrna构建scfv的核糖体展示模板在大肠杆菌或真核细胞核糖体系统中翻译亲和筛选出特异的核糖体复合物通过edta解聚从核糖体复合物中分离mrnamrna逆转录成cdna并通过pcr扩增获得侯选dna下一轮循环的富集筛选克隆和序列分析及表达活性分析rtpcr扩增抗体库基因linkerspacersdt75stemloop3stemlooplinkerprimerprimert7sdscfv的核糖体展示模板构建示意图整个过程均在细胞外进行不需要转化细胞因此可获得大容量库10111013避免了细胞内外操作的频繁转换大大缩短筛选周期简化了操作
抗体库技术
强 的抗 体 。 本 文将 此技 术 作 一介 绍 。
【 关键 词 】 抗 体库 ； 体 外成 熟 ； 阳性 克 隆
ｆ ｒ ｏ ｍ ａ ｎｙ ｓ ｐｅ ｃ ｉ ｅ ｓ ｗｉ ｔ ｈ ｏ ｕ ｔ ｎｅ ｇ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｓ ｅ ｌ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ａ ｎ ｉ ｍａ ｌ ｓ ． Ｔｈ ｉ ｓ ｒ ｅ ｖ ｉ ｅ ｗ ｉ ｓ ｆ ｏ ｃ ｕ ｓ ｅ ｄ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｉ ｔ ｏ ｎｓ ， ａ ｐ ｐ ｌ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ａ ｎ ｄ ｐ ｒ ｏ ｓ ｐ ｅ ｃ ｔ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈｉ ｓ
为 了克 服 随机 组 合抗 体 库 的随 机性 强 ，库 容 量 大 ， 筛 选 工作 量 大 和不 易获 得 特 异性 抗 体 的缺 点 ， １ ９ ９ １ 年 将 噬 菌
突变 ， 并 用 噬菌 体 呈 现 的方 法 进 行 了筛 选 ， 得 到 亲 和力 提 高１ ０ ０ 倍 的 突变体 。而且 对 突变 规律 进行 了分析 时 ，发 现
【 Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ 】Ｉ ｔ ｈ ａ ｓ ｂ ｅ ｅ ｎ ｐ ｒ ｏ ｖ ｅ ｄ ｔ ｈ ａ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ ｂ ｏ ｄ ｉ ｅ ｓ ａ ｒ ｅ ｅ ｘ ｔ ｒ ｅ ｍｅ ｌ ｙ ｉ ｍｐ ｏ ｒ ｔ ａ ｎ ｔ ｉ ｎ ｔ ｈ ｅ ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ ｄ ｉ ａ ｇ ｎ ｏ ｓ ｉ ｓ ｎｄ ａ ｔ ｒ ｅ ａ ｔ ｍｅ ｎ ｔ ． Ｔ ｏ ｍｅ ｅ ｔ ｔ ｈ ｅ ｄ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｅ ｄ ｅ ｍａ ｎｄ ｓ
抗P-选择蛋白人源性单克隆抗体的制备
［ 要 ］ 目 的 ： 得 人 源 性 抗 Ｐ 选 择 蛋 白（ｅ ｃｉ ） 异 性 抗体 ， 相 关 疾 病 治疗 奠 定 基 础 。 方 法 ： Ｈ Ｋ ９ 摘 获 一 ｓｌ ｔ 特 ｅ ｎ 为 在 Ｅ ２ ３细 胞
中真 核 分 泌 表 达 人 Ｐ 选 择 蛋 白功 能 性 片段 ， 一 以此 蛋 白片 段 作 为 抗 原 ， 用 本 室 构 建 的大 容 量 全 合 成人 源 性 噬 菌 体 利
，
ＷＡ ｈａ￣，ＬＮ Ｊ ｎ Ｂ Ｕ ｈ－ ｉ Ｅ Ｊ ｎ Ｙ ｎ ＮＧ Ｓ ｕｎ Ｉ ｉ － ｏ ａ ，Ｓ Ｎ Ｚ ｉＷｅ，Ｈ ｉ － ｏ￣ ａ
１ ｅ ｉｇ Ｉｓ ｉ ｔ ｏ Ｂｏ ｃ ｎ ｌｇ ， ｅ ｉｇ １ ０ ７ ； ．Ｂ ｉｎ ｎ ｉｔ ｅ ｆ ｉ ｅ ｈ ｏｏｙ Ｂ ｉｎ ０ ０ １ ｊ ｔｕ ｔ ｊ
抗 体 库 进行 筛选 ， 经过 ３轮 固相 筛 选后 ， 性 克 隆得 到 富集 ； 其 中 富集 效果 最好 的一 株 单 链 抗 体 Ａ 阳 将 １改 造 成 全 抗体
（ｇ ） 重 组 质 粒 转染 Ｈ２ ３细 胞 后 ， 体 得 到表 达 ； 达 后 在 全 抗 体 水 平 上 用 ＥＬＳ 和 Ｗｅｔｒ ＩＧ１ ， ９ 抗 表 ＩＡ ｓｅｎ印 迹 分 别 验 证 了 Ａ１抗 体 的特 异 性 ， 通 过 非 竞争 Ｅ ＩＡ 方 法 初 步 测定 这 株 抗 体 的亲 和 力 。结 果 ： 并 ＬＳ ３轮 筛 选 得 到 ３株 特 异 性 噬 菌体 抗 体 ， 中 富集 效果 最 好 的单 链 抗体 Ａ１改造 成 全抗 体 形 式后 特 异 性 良好 ， 体 亲和 力 Ｋｄ２ ０ ｍｏ／ 其 抗 ＝ ｘ１ ｌＬ。结 论 ： 筛选 得
到 一株 特 异 性 较 好 的抗 Ｐ 选 择 蛋 白人 源性 单 克 隆抗 体 Ａ１ 其 特 异 性和 亲和 力 较好 ， 继 续 开发 的价 值 。 一 ， 有
抗人OX40单克隆抗体的制备和初步鉴定
抗人OX40单克隆抗体的制备和初步鉴定侯小娟;陈鸿斌;袁旭东;王双;仇玮祎;孙志伟【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2017(28)3【摘要】目的:获得全人源抗人OX40特异性抗体候选株,为相关药物开发奠定基础.方法:依托本实验室构建的大容量全合成全人源噬菌体单链抗体库平台,以OX40为抗原进行固相筛选,经过3轮条件渐进严苛的筛选后,阳性克隆得到富集;将其中富集效果最好的一株单链抗体scFv-1改造成全抗体(IgG1)形式,改造成功的重组质粒按照一定比例转染HEK293-F细胞进行抗体的瞬时表达;基于AKTA系统对全抗体进行纯化,将纯化得到的金抗体重命名为OX40mab-1.通过ELISA、间接免疫荧光、流式细胞术等试验分别验证OX40mab-1与抗原的结合活性、特异性、血清稳定性;通过BIAcore3000初步测定抗体亲和力.结果:3轮筛选后得到1株富集率达95％的单链抗体,改造成全抗体形式后,与抗原OX40的结合EC50为0.015 μmol/L;该抗体与其他无关抗原均不结合,特异性良好;37℃血清放置15 d后,与抗原依具有较好的结合活性,血清稳定性良好;经BlAcore 3000初步测定该抗体亲和力为251 nmol/L.结论:获得1株理化性质良好、特异性较好的抗OX40全人源单克隆抗体OX40mab-1,具有继续开发价值.%Objective:To harvest a fully human anti-human OX40 specific antibody for developing related drug.Methods:We chose OX40 as a target antigen to screen specific antibodies from the fully human single-chain anti-body phage library and got the enriched positive clones after 3 rounds of solid screening.The best enriched single-chain antibody scFv-1 was redesigned to be a fully human antibody,and thecorresponding recombinant plasmid was transfected into HEK293-F cells for transient expression.The final prodcut,named as OX40mab-1,was purified based on AKTA system,and the binding activity,specificity,serum stability were verified via ELISA,indirect immunofluorescence,and flow cytometry respectively.The affinity of OX40mab-1 was determined via BIAcore 3000.Results:After 3 rounds of screening,a single chain antibody with an enrichment rate of 95％ was harvested,and was reconstructed into a fully human antibody OX40mab-1 The binding EC50 of OX40mab-1 to OX40 was 0.015 μmol/L.OX40mab-1 did not bind to unrelated antigens,showing its specificity,and its good binding activity to antigen retained after 15 days in serum at 37℃,proving its serum stability and its affinity was 251 nmol/ L determined by BIAcore 3000.Conclusion:An anti-OX40 fully human monoclonal antibody with good bindingactivity,specificity,and serum stability was obtained,and deserves for further development.【总页数】8页(P242-248,376)【作者】侯小娟;陈鸿斌;袁旭东;王双;仇玮祎;孙志伟【作者单位】军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;北方战区空军参谋部门诊部,辽宁沈阳110015;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071;军事医学科学院生物工程研究所,北京100071【正文语种】中文【中图分类】R392.1【相关文献】1.抗人绒毛膜促性腺激素β亚单位羧基末端肽（hCGβ-CTP）单克隆抗体制备及初步鉴定 [J], 王锐;安晓丽;梁秋波;张道旭;李郑武;2.抗人干扰素α2b单克隆抗体制备及初步鉴定 [J], 王锐;王延涛;安晓丽;刘恒;张秀芹3.抗人EGFRvⅢ ex单克隆抗体的制备及初步鉴定 [J], 江秀玲;胡有根;石必枝4.抗人FXYD3单克隆抗体的制备与初步鉴定 [J], 马焕先;高丽杰;张爱群;周宁新5.人OX40单克隆抗体的制备、纯化及初步鉴定 [J], 崔杰;辛宁;冯永堂;鞠吉雨;王成伟;刘艳菲;苗乃法因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
全人源抗体
第五章 人源性抗体第二节 全人源抗体单抗的人源化，其主要目的就是通过各种手段降低鼠源单抗的异源性，而其中最有效的办法就是把整个抗体做成人源的，也就是全人源抗体。
全人源抗体可通过噬菌体、酵母、核糖体等展示技术；转基因小鼠及单细胞PCR 全人源单克隆抗体技术等获得（图1）。
图1 全人源抗体制备途径抗体库技术是利用基因克隆技术将全套的抗体重链和轻链可变区基因克隆出来，重组到表达载体，通过在相应表达系统表达并展示有功能的抗体分子片段，进而筛选出特异性的可变区基因的技术。
抗体库技术是一种将抗体组合文库与噬菌体、核糖体、酵母等表面展示技术相结合所形成的新技术，该技术将抗体分子展示在噬菌体等表面，并保持了抗体的天然构象和生物学活性，为进一步筛选和制备高特异性的人源抗体提供良好的技术平台。
抗体库技术与传统单克隆抗体制备技术相比，具有以下优点：1）抗体库技术省去了细胞融合的步骤，省时省力，避免了因杂交瘤不稳定而需要反复克隆化的繁琐程序。
2）扩大了筛选容量，可筛选106以上的克隆。
3）抗体库技术直接得到了抗体的基因，既没有杂交瘤丢失的问题，又便于进一步构建各种基因工程抗体。
4）抗体库技术得到的抗体可利用原核表达系统表达，比如小分子抗体scFv、Fab等可以直接利用原核系统表达。
5）可以制备一些难于制备的抗体，比如一些对小鼠毒性强的抗原，用它们直接免疫小鼠可能会造成小鼠的死亡，但用抗体库技术就没有这个问题。
噬菌体抗体库技术（图2），1985年乔治·史密斯发明的噬菌体展示的技术他也因此获得2018年诺贝尔化学奖（图3）。
该技术利用噬菌体表面展示技术，首先通过PCR扩增出抗体的全套可变区基因，并将其克隆入噬菌体展示载体中，这样抗体基因在噬菌体表面表达并展示在噬菌体表面。
再经过多轮“吸附-洗脱-扩增”的过程筛选并富集特异性抗体（图4）。
这一技术将表型和基因型联系在一起，使抗原识别能力和再扩增结合在一起，是一极为高效的表达、筛选体系。
抗体cmc开发流程
抗体cmc开发流程
抗体cmc开发流程
1、筛选来源：首先要明确抗体cmc开发要解决的问题及所需抗体性能
要求，以满足产品中抗体性能特点筛选抗体来源，主要分为品系来源、机器人来源、海外来源和基因组来源等。
2、基因编辑：在编辑抗体基因库之前，需要进行抗体库构建和抗体稳
定性检测，以确保基因编辑可行性。
编辑抗体库时，主要根据要求的
特性，通过基因群选择基因，进而构建出目标抗体库。
3、筛选抗体：在筛选和抗体库构建完毕之后，便可以根据设定的条件
对抗体库进行筛选，滤除不合格的基因抗体，留下具有良好性能的细
胞系，以获得最终的融合抗体。
4、鉴定抗体：筛选出具有良好性能的抗体后，还需进行抗体鉴定，以
验证抗体是否具有构建要求的性能特点。
这一步实验中，主要使用特
殊的表达宿主，进行的抗体的抗原结合能力，同时包括有分析抗体的
单克隆性等。
5、定制抗体：在抗体鉴定阶段，我们实验团队会根据客户定量需求，
按照静脉注射、靶向抗体药物、细胞外基因转染等形式调节抗体的整
体性能，使抗体与客户的特定要求完美协同，从而为未来的cmc开发
提供基础。
6、抗体稳定性检测：在进行抗体定制化开发之前，我们实验团队还需
要为抗体进行全面的抗体稳定性检测，以明确抗体的稳定状态，保证
抗体的可行性。
7、clm抗体认证：为保证最终产品的可行性，我们实验团队还需要为clm抗体及其开发历程进行认证，以完整展示全程开发过程及最终产品
的稳定性。
8、抗体性能验证：最后，我们实验团队在实验小鼠体内评估抗体性能，以确保产品功效及灵敏度，确保抗体完成cmc开发任务。
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3 讨论
随着人们对抗体结构和功能认识的深入和对各种抗体库构 建与筛选经验的积累 , 新的设计方案不断出现 , 使繁琐的建库与 筛选工作日趋简便易行 。
本实验中 , 采用表达良好的骨架序列 , 一方面有利于抗体分 子在大肠杆菌中表达和折叠 , 减少了因各种表达问题所致库容量 降低的问题 , 提高了功能性抗体分子的比例 , 使中等库容抗体库 中的功能性抗体分子数量接近高库容抗体库中的有效抗体分子 , 从而降低了构建高质量抗体库的繁琐操作 , 使建库的工作更为简 便易行。另一方面 , 单骨架的设计可使不同克隆间抗体分子的表 达量趋于一致 , 有利于随后的展示和筛选过程 , 以便实现高通量 筛选的平行性。此外 , Steinhauer等 [7]的研究表明 , 从稳定性高、 表达良好的单骨架抗体库中 , 分离的抗体分子具有良好的生物物 理学特性 , 适用于高密度抗体芯片的构建。
轮次
1 2 3
包被抗原的量 (mg/L ) 100 20 5
投入噬菌体 的量
1 ×1011 1 ×1011 1 ×1011
产出噬菌体 的量
5. 6 ×104 8. 2 ×105 5. 7 ×107
投入 /产出比 (% )
5. 6 ×10 - 7 8. 2 ×10 - 6 5. 7 ×10 - 4
[ 4 ] Cox J P, Tomlinson I M, W inter G. A directory of human germ2line V kappa segments reveals a strong bias in their usage[ J ]. Eur J Imm unol, 1994, 24: 827 - 836.
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参考文献 :
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换为 DNA序列 , 将每个序列拆分为 6个含有重叠区的寡核苷 酸序列 , 分别经序列合成拼接后 , 连接至 pCANTAB S2 载体 中 。经测序分析后 , 将克隆有正确胚系基因序列的载体命名 为 pCANTAB scFv。 ( 2)分组式合成法合成 CDR3区 : 以已知 的抗体序列为参考 , 对重链 CDR3区 ( HCDR3 )和轻链 CDR3 区 (LCDR3) , 分别进行了随机化和部分随机化设计 。为了消 除传统的随机化合成法中不可避免的终止密码子 , 采用了一 种新颖的分组式方法合成 CDR3区的随机化序列 [5 ] , 并能够 在特定位点引入不同比例的氨基酸 。 ( 3)单骨架全合成抗体 库的组装和构建 : 单骨架全合成抗体库的组装流程图见图 1, 引物见表 1。以克隆有 DP47和 DPK22基因的 pCANTAB scFv 载体为模板 , 分别扩增 DP47胚系基因和 linker2DPK22胚系基 因 。进行胶回收并纯化后 , 再取等摩尔数的 DP47、HCDR3和 linker2DPK22、LCDR3及 相 应 引 物 , 分 别 进 行 25 个 循 环 的 PCR扩增 , 便可得到重链库和轻链库 。将纯化的重 、轻链库 DNA 片段各取 100 ng于 PCR体系中进行 scFv的组装 。
1 材料和方法
1. 1 材料 噬菌粒载体 pCANTAB S2, 由 Amersham Pharma2 cia公司的 pCANTAB 5E改造而成 。大肠杆菌 TG1 与辅助噬 菌体 M13KO7和抗 E2tag抗体 , 均购自 Amersham Pharmacia公 司 。DNA胶回收试剂盒购自 TaKaRa公司 。限制性内切酶和 蛋白 M arker购自 New England B iolabs公司 。HRP2羊抗鼠 IgG 购自 R&D公司 。重组表达的人外周淋巴组织趋化性细胞因 子 ( SLC)为本室制备 。本实验中所涉及的 DNA 合成和测序均 由上海博亚公司完成 。 1. 2 方法 1. 2. 1 单骨架全合成人源噬菌体抗体库的构建 ( 1)单链抗 体骨架序 列 的 选 择 及 合 成 : 采 用 人 抗 体 胚 系 基 因 DP47 和 DPK22作为合成库的骨架序列 , 抗体序列位点的计数按 Kabat 计数系统进行 。将以上胚系基因 [4 ]按大肠杆菌偏好密码子转
的回收率可以看出 , 与靶抗原亲和结合的噬菌体颗粒不断得到富 集 (表 2)。 (2)噬菌体抗体与抗原的结合活性及特异性鉴定 : 用 EL ISA法检测噬菌体抗体与重组 SLC抗原的结合活性结果表明 ,Байду номын сангаас4株噬菌体抗体与重组 SLC抗原具有较高的结合活性 , 与 BSA 无交叉反应 (图 3)。 表 2 3轮亲和淘选对噬菌体抗体的富集效应
M: DNA marker(DL 2 000) ; 1: scFv基因 ; 2: VL 基因 ; 3: L inker2DPK22胚 系基因的 PCR产物 ; 4: VH 基因 ; 5: DPK47胚系基因的 PCR产物.
2. 2 单骨架全合成抗体库的鉴定与筛选 (1)单骨架全合成抗 体库的淘选 : 以本实验室重组表达纯化的 SLC作为固相抗原 , 对 全合成单骨架抗体库进行 3轮淘筛。逐步降低靶分子的浓度 , 以 利于淘筛出高亲和力的噬菌体抗体 。从每轮淘筛的重组噬菌体
图 1 全合成抗体库的构建流程图
表 1 构建抗体库所用的引物
引物 名称
a b c d
引物序列
5′2ATG ACC ATG ATT ACG CCA AG23′ 5′2CAG GGT GCC TTG GCC CCA A 23′ 5′2GGC CAA GGC ACC CTG GTG ACG GTT AGC TCA G23′ 5′2TTC GAA TTC AA G GCC TCG GGG GCC CGT ACG TTT AA T TTC AAC TTT CG23′
图 3 4株噬菌体抗体与抗原结合活性的 EL ISA分析
2 结果
2. 1 全合成人源单骨架噬菌体抗体库的构建 scFv的骨架 序列 、重轻链库及 scFv库的扩增产物如图 2 所示 。经过 20 次连接和电转化后 , 构建得到全合成抗体库 , 经系列稀释计 算抗体库的库容为 8 ×107。
图 2 重 、轻链库及 scFv库构建中 PCR产物的琼脂糖凝胶电 泳鉴定
ISSN1007 - 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 (3)
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文章编号 : 1007 - 8738 (2005) 03 - 0347 - 02
全合成人源单骨架抗体库的构建及初步筛选
王尚资 1 , 尹长城 2 , 林正红 2 , 王祥斌 2 , 刘 晶 2 , 管华诗 1 , 黄华 23
选用经过优化并具有某些特殊性质 (如高稳定性 、高表 达性质 )的抗体序列作为骨架 , 构建单骨架合成抗体库 , 具有 组分清晰 、表达均一 、设计构建灵活等优点 , 因而得到广泛 应用 [2, 3 ] 。本实验中 , 我们采用抗体基因全合成的方法 , 构 建了 1个中等库容的全合成单骨架抗体库 , 并对其进行了质 量分析和筛选鉴定 。
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ISSN1007 - 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 (3)
性噬菌体抗体富集的指标 。 ( 2)噬菌体抗体与抗原的结合活 性及特异性鉴定 : 挑取经 3轮筛选得到的 PCR 阳性克隆 , 培 养至菌液浓度达 A600 = 0. 9, 加入 1 mmol/L IPTG于 30℃诱导 表达 16 h, 取培养基上清 , EL ISA 法测定各个克隆的抗原结 合活性 , 保留具有较高活性的克隆 , 测序鉴定 。 EL ISA 中以 重组人 SLC作为抗原 , BSA 作为对照抗原 。抗 E2tag抗体作 为一抗 , HRP2羊抗鼠 IgG作为二抗 。
[ 7 ] Steinhauer C, W ingren C, Hager AC, et al. Single framework recombinant antibody fragments designed for p rotein chip app lications [ J ]. B iotech2 niques, 2002, Supp l: 38 - 45.
3 Corresponding author
1. 2. 2 单骨架全合成抗体库的鉴定与筛选 ( 1)单骨架全合 成抗体库的淘选 : 以重组人 SLC为抗原 , 固相化至抗原管后 , 参照文献 [ 6 ]的方法对抗体库进行 3 轮亲和淘选 。每轮淘选 均测定次级库的滴度 , 并计算噬菌体的投入产出比作为特异