全合成人源单骨架抗体库的构建及初步筛选
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[5 ] 尹长城 , 王尚资 , 林正红 , 等. 一种构建高质量随机肽库的有效方法 [J ]. 生物化学与生物物理学报 , 2003, 35: 921 - 924.
[ 6 ] Borrebaeck CAK. Antibody Engineering[M ]. New York: Oxford Universi2 ty Press, 1995: 97 - 115.
参考文献 :
[ 1 ] Knapp ik A, Ge L, Honegger A, et al. Fully synthetic human combinatori2 al antibody libraries ( HuCAL ) based on modular consensus frameworks and CDRs random ized with trinucleotides[ J ]. J M ol B iol, 2000, 296: 57 - 86.
[ 2 ] Desiderio A, Franconi R, Lopez M, et al. A sem i2synthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a single2framework scaffold[ J ]. J M ol B iol, 2001, 310: 603 - 615.
[ 4 ] Cox J P, Tomlinson I M, W inter G. A directory of human germ2line V kappa segments reveals a strong bias in their usage[ J ]. Eur J Imm unol, 1994, 24: 827 - 836.
[ 7 ] Steinhauer C, W ingren C, Hager AC, et al. Single framework recombinant antibody fragments designed for p rotein chip app lications [ J ]. B iotech2 niques, 2002, Supp l: 38 - 45.
1 材料和方法
1. 1 材料 噬菌粒载体 pCANTAB S2, 由 Amersham Pharma2 cia公司的 pCANTAB 5E改造而成 。大肠杆菌 TG1 与辅助噬 菌体 M13KO7和抗 E2tag抗体 , 均购自 Amersham Pharmacia公 司 。DNA胶回收试剂盒购自 TaKaRa公司 。限制性内切酶和 蛋白 M arker购自 New England B iolabs公司 。HRP2羊抗鼠 IgG 购自 R&D公司 。重组表达的人外周淋巴组织趋化性细胞因 子 ( SLC)为本室制备 。本实验中所涉及的 DNA 合成和测序均 由上海博亚公司完成 。 1. 2 方法 1. 2. 1 单骨架全合成人源噬菌体抗体库的构建 ( 1)单链抗 体骨架序 列 的 选 择 及 合 成 : 采 用 人 抗 体 胚 系 基 因 DP47 和 DPK22作为合成库的骨架序列 , 抗体序列位点的计数按 Kabat 计数系统进行 。将以上胚系基因 [4 ]按大肠杆菌偏好密码子转
图 3 4株噬菌体抗体与抗原结合活性的 EL ISA分析
2 结果
2. 1 全合成人源单骨架噬菌体抗体库的构建 scFv的骨架 序列 、重轻链库及 scFv库的扩增产物如图 2 所示 。经过 20 次连接和电转化后 , 构建得到全合成抗体库 , 经系列稀释计 算抗体库的库容为 8 ×107。
图 2 重 、轻链库及 scFv库构建中 PCR产物的琼脂糖凝胶电 泳鉴定
轮次
1 2 3
包被抗原的量 (mg/L ) 100 20 5
投入噬菌体 的量
1 ×1011 1 ×1011 1 ×1011
产出噬菌体 的量
5. 6 ×104 8. 2 ×105 5. 7 ×107
投入 /产出比 (% )
5. 6 ×10 - 7 8. 2 ×10 - 6 5. 7 ×10 - 4
3 Corresponding author
1. 2. 2 单骨架全合成抗体库的鉴定与筛选 ( 1)单骨架全合 成抗体库的淘选 : 以重组人 SLC为抗原 , 固相化至抗原管后 , 参照文献 [ 6 ]的方法对抗体库进行 3 轮亲和淘选 。每轮淘选 均测定次级库的滴度 , 并计算噬菌体的投入产出比作为特异
收稿日期 : 2004 - 08 - 25; 修回日期 : 2004 - 12 - 14 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863)重点项目 (No. 2001AA215381) 作者简介 : 王尚资 (1974 - ) , 女 , 内蒙古赤峰人 , 博士.
Tel: ( 010) 80726905; Email: wangsz@ouc. edu. cn
图 1 全合成抗体库的构建流程图
表 1 构建抗体库所用的引物
引物 名称
a b c d
引物序列
5′2ATG ACC ATG ATT ACG CCA AG23′ 5′2CAG GGT GCC TTG GCC CCA A 23′ 5′2GGC CAA GGC ACC CTG GTG ACG GTT AGC TCA G23′ 5′2TTC GAA TTC AA G GCC TCG GGG GCC CGT ACG TTT AA T TTC AAC TTT CG23′
选用经过优化并具有某些特殊性质 (如高稳定性 、高表 达性质 )的抗体序列作为骨架 , 构建单骨架合成抗体库 , 具有 组分清晰 、表达均一 、设计构建灵活等优点 , 因而得到广泛 应用 [2, 3 ] 。本实验中 , 我们采用抗体基因全合成的方法 , 构 建了 1个中等库容的全合成单骨架抗体库 , 并对其进行了质 量分析和筛选鉴定 。
换为 DNA序列 , 将每个序列拆分为 6个含有重叠区的寡核苷 酸序列 , 分别经序列合成拼接后 , 连接至 pCANTAB S2 载体 中 。经测序分析后 , 将克隆有正确胚系基因序列的载体命名 为 pCANTAB scFv。 ( 2)分组式合成法合成 CDR3区 : 以已知 的抗体序列为参考 , 对重链 CDR3区 ( HCDR3 )和轻链 CDR3 区 (LCDR3) , 分别进行了随机化和部分随机化设计 。为了消 除传统的随机化合成法中不可避免的终止密码子 , 采用了一 种新颖的分组式方法合成 CDR3区的随机化序列 [5 ] , 并能够 在特定位点引入不同比例的氨基酸 。 ( 3)单骨架全合成抗体 库的组装和构建 : 单骨架全合成抗体库的组装流程图见图 1, 引物见表 1。以克隆有 DP47和 DPK22基因的 pCANTAB scFv 载体为模板 , 分别扩增 DP47胚系基因和 linker2DPK22胚系基 因 。进行胶回收并纯化后 , 再取等摩尔数的 DP47、HCDR3和 linker2DPK22、LCDR3及 相 应 引 物 , 分 别 进 行 25 个 循 环 的 PCR扩增 , 便可得到重链库和轻链库 。将纯化的重 、轻链库 DNA 片段各取 100 ng于 PCR体系中进行 scFv的组装 。
M: DNA marker(DL 2 000) ; 1: scFv基因 ; 2: VL 基因 ; 3: L inker2DPK22胚 系基因的 PCR产物 ; 4: VH 基因 ; 5: DPK47胚系基因的 PCR产物.
2. 2 单骨架全合成抗体库的鉴定与筛选 (1)单骨架全合成抗 体库的淘选 : 以本实验室重组表达纯化的 SLC作为固相抗原 , 对 全合成单骨架抗体库进行 3轮淘筛。逐步降低靶分子的浓度 , 以 利于淘筛出高亲和力的噬菌体抗体 。从每轮淘筛的重组噬菌体
的回收率可以看出 , 与靶抗原亲和结合的噬菌体颗粒不断得到富 集 (表 2)。 (2)噬菌体抗体与抗原的结合活性及特异性鉴定 : 用 EL ISA法检测噬菌体抗体与重组 SLC抗原的结合活性结果表明 , 4株噬菌体抗体与重组 SLC抗原具有较高的结合活性 , 与 BSA 无交叉反应 (图 3)。 表 2 3轮亲和淘选对噬菌体抗体的富集效应
(1中国海洋大学海洋药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003; 2中国科学院遗传与发育生物学研究所 , 北京 100101)
[关键词 ] 全合成抗体库 ; 噬菌体展示 ; 筛选 [中图分类号 ] Q75 [文献标识码 ] B
全套抗体库为制备抗任意抗原的人源抗体提供了来源 , 且具有重要的基础研究和应用价值 。因此 , 构建高质量的抗 体库一直是抗体工程研究的热点 。全合成抗体库技术以其可 控性 、可操作性强 , 组成成分明确 , 设计灵活并能满足高通 量筛选的要求等特点 , 得以迅速发展和广泛应用 [1 ] 。随着对 抗体结构和功能认识的深入 , 人们越来越多地利用蛋白质工 程手段进行优化设计 , 来提高抗体库中抗体分子的表达能力 和稳定性 , 通过提高抗体库中功能性抗体的比例 , 从而有效 地提高抗体库的质量 。
3 讨论
随着人们对抗体结构和功能认识的深入和对各种抗体库构 建与筛选经验的积累 , 新的设计方案不断出现 , 使繁琐的建库与 筛选工作日趋简便易行 。
本实验中 , 采用表达良好的骨架序列 , 一方面有利于抗体分 子在大肠杆菌中表达和折叠 , 减少了因各种表达问题所致库容量 降低的问题 , 提高了功能性抗体分子的比例 , 使中等库容抗体库 中的功能性抗体分子数量接近高库容抗体库中的有效抗体分子 , 从而降低了构建高质量抗体库的繁琐操作 , 使建库的工作更为简 便易行。另一方面 , 单骨架的设计可使不同克隆间抗体分子的表 达量趋于一致 , 有利于随后的展示和筛选过程 , 以便实现高通量 筛选的平行性。此外 , Steinhauer等 [7]的研究表明 , 从稳定性高、 表达良好的单骨架抗体库中 , 分离的抗体分子具有良好的生物物 理学特性 , 适用于高密度抗体芯片的构建。
348
ISSN1007 - 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 (3)
性噬菌体抗体富集的指标 。 ( 2)噬菌体抗体与抗原的结合活 性及特异性鉴定 : 挑取经 3轮筛选得到的 PCR 阳性克隆 , 培 养至菌液浓度达 A600 = 0. 9, 加入 1 mmol/L IPTG于 30℃诱导 表达 16 h, 取培养基上清 , EL ISA 法测定各个克隆的抗原结 合活性 , 保留具有较高活性的克隆 , 测序鉴定 。 EL ISA 中以 重组人 SLC作为抗原 , BSA 作为对照抗原 。抗 E2tag抗体作 为一抗 , HRP2羊抗鼠 IgG作为二抗 。
[ 3 ] Azriel2Rosenfeld R, ValensiM, Benhar I. A human synthetic combinatori2 al library of arrayable single2chain antibodies based on shuffling in vivo formed CDR s into general framework regions[ J ]. J M ol B iol, 2004, 335: 177 - 192.
ISSN1007 - 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 (3)
347
文章编号 : 1007 - 8738 (2005) 03 - 0347 - 02
全合成人源单骨架抗体库的构建及初步筛选
王尚资 1 , 尹长城 2 , 林正红 2 , 王祥斌 2 , 刘 晶 2 , 管华诗 1 , 黄华 23
来自百度文库
[ 6 ] Borrebaeck CAK. Antibody Engineering[M ]. New York: Oxford Universi2 ty Press, 1995: 97 - 115.
参考文献 :
[ 1 ] Knapp ik A, Ge L, Honegger A, et al. Fully synthetic human combinatori2 al antibody libraries ( HuCAL ) based on modular consensus frameworks and CDRs random ized with trinucleotides[ J ]. J M ol B iol, 2000, 296: 57 - 86.
[ 2 ] Desiderio A, Franconi R, Lopez M, et al. A sem i2synthetic repertoire of intrinsically stable antibody fragments derived from a single2framework scaffold[ J ]. J M ol B iol, 2001, 310: 603 - 615.
[ 4 ] Cox J P, Tomlinson I M, W inter G. A directory of human germ2line V kappa segments reveals a strong bias in their usage[ J ]. Eur J Imm unol, 1994, 24: 827 - 836.
[ 7 ] Steinhauer C, W ingren C, Hager AC, et al. Single framework recombinant antibody fragments designed for p rotein chip app lications [ J ]. B iotech2 niques, 2002, Supp l: 38 - 45.
1 材料和方法
1. 1 材料 噬菌粒载体 pCANTAB S2, 由 Amersham Pharma2 cia公司的 pCANTAB 5E改造而成 。大肠杆菌 TG1 与辅助噬 菌体 M13KO7和抗 E2tag抗体 , 均购自 Amersham Pharmacia公 司 。DNA胶回收试剂盒购自 TaKaRa公司 。限制性内切酶和 蛋白 M arker购自 New England B iolabs公司 。HRP2羊抗鼠 IgG 购自 R&D公司 。重组表达的人外周淋巴组织趋化性细胞因 子 ( SLC)为本室制备 。本实验中所涉及的 DNA 合成和测序均 由上海博亚公司完成 。 1. 2 方法 1. 2. 1 单骨架全合成人源噬菌体抗体库的构建 ( 1)单链抗 体骨架序 列 的 选 择 及 合 成 : 采 用 人 抗 体 胚 系 基 因 DP47 和 DPK22作为合成库的骨架序列 , 抗体序列位点的计数按 Kabat 计数系统进行 。将以上胚系基因 [4 ]按大肠杆菌偏好密码子转
图 3 4株噬菌体抗体与抗原结合活性的 EL ISA分析
2 结果
2. 1 全合成人源单骨架噬菌体抗体库的构建 scFv的骨架 序列 、重轻链库及 scFv库的扩增产物如图 2 所示 。经过 20 次连接和电转化后 , 构建得到全合成抗体库 , 经系列稀释计 算抗体库的库容为 8 ×107。
图 2 重 、轻链库及 scFv库构建中 PCR产物的琼脂糖凝胶电 泳鉴定
轮次
1 2 3
包被抗原的量 (mg/L ) 100 20 5
投入噬菌体 的量
1 ×1011 1 ×1011 1 ×1011
产出噬菌体 的量
5. 6 ×104 8. 2 ×105 5. 7 ×107
投入 /产出比 (% )
5. 6 ×10 - 7 8. 2 ×10 - 6 5. 7 ×10 - 4
3 Corresponding author
1. 2. 2 单骨架全合成抗体库的鉴定与筛选 ( 1)单骨架全合 成抗体库的淘选 : 以重组人 SLC为抗原 , 固相化至抗原管后 , 参照文献 [ 6 ]的方法对抗体库进行 3 轮亲和淘选 。每轮淘选 均测定次级库的滴度 , 并计算噬菌体的投入产出比作为特异
收稿日期 : 2004 - 08 - 25; 修回日期 : 2004 - 12 - 14 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863)重点项目 (No. 2001AA215381) 作者简介 : 王尚资 (1974 - ) , 女 , 内蒙古赤峰人 , 博士.
Tel: ( 010) 80726905; Email: wangsz@ouc. edu. cn
图 1 全合成抗体库的构建流程图
表 1 构建抗体库所用的引物
引物 名称
a b c d
引物序列
5′2ATG ACC ATG ATT ACG CCA AG23′ 5′2CAG GGT GCC TTG GCC CCA A 23′ 5′2GGC CAA GGC ACC CTG GTG ACG GTT AGC TCA G23′ 5′2TTC GAA TTC AA G GCC TCG GGG GCC CGT ACG TTT AA T TTC AAC TTT CG23′
选用经过优化并具有某些特殊性质 (如高稳定性 、高表 达性质 )的抗体序列作为骨架 , 构建单骨架合成抗体库 , 具有 组分清晰 、表达均一 、设计构建灵活等优点 , 因而得到广泛 应用 [2, 3 ] 。本实验中 , 我们采用抗体基因全合成的方法 , 构 建了 1个中等库容的全合成单骨架抗体库 , 并对其进行了质 量分析和筛选鉴定 。
换为 DNA序列 , 将每个序列拆分为 6个含有重叠区的寡核苷 酸序列 , 分别经序列合成拼接后 , 连接至 pCANTAB S2 载体 中 。经测序分析后 , 将克隆有正确胚系基因序列的载体命名 为 pCANTAB scFv。 ( 2)分组式合成法合成 CDR3区 : 以已知 的抗体序列为参考 , 对重链 CDR3区 ( HCDR3 )和轻链 CDR3 区 (LCDR3) , 分别进行了随机化和部分随机化设计 。为了消 除传统的随机化合成法中不可避免的终止密码子 , 采用了一 种新颖的分组式方法合成 CDR3区的随机化序列 [5 ] , 并能够 在特定位点引入不同比例的氨基酸 。 ( 3)单骨架全合成抗体 库的组装和构建 : 单骨架全合成抗体库的组装流程图见图 1, 引物见表 1。以克隆有 DP47和 DPK22基因的 pCANTAB scFv 载体为模板 , 分别扩增 DP47胚系基因和 linker2DPK22胚系基 因 。进行胶回收并纯化后 , 再取等摩尔数的 DP47、HCDR3和 linker2DPK22、LCDR3及 相 应 引 物 , 分 别 进 行 25 个 循 环 的 PCR扩增 , 便可得到重链库和轻链库 。将纯化的重 、轻链库 DNA 片段各取 100 ng于 PCR体系中进行 scFv的组装 。
M: DNA marker(DL 2 000) ; 1: scFv基因 ; 2: VL 基因 ; 3: L inker2DPK22胚 系基因的 PCR产物 ; 4: VH 基因 ; 5: DPK47胚系基因的 PCR产物.
2. 2 单骨架全合成抗体库的鉴定与筛选 (1)单骨架全合成抗 体库的淘选 : 以本实验室重组表达纯化的 SLC作为固相抗原 , 对 全合成单骨架抗体库进行 3轮淘筛。逐步降低靶分子的浓度 , 以 利于淘筛出高亲和力的噬菌体抗体 。从每轮淘筛的重组噬菌体
的回收率可以看出 , 与靶抗原亲和结合的噬菌体颗粒不断得到富 集 (表 2)。 (2)噬菌体抗体与抗原的结合活性及特异性鉴定 : 用 EL ISA法检测噬菌体抗体与重组 SLC抗原的结合活性结果表明 , 4株噬菌体抗体与重组 SLC抗原具有较高的结合活性 , 与 BSA 无交叉反应 (图 3)。 表 2 3轮亲和淘选对噬菌体抗体的富集效应
(1中国海洋大学海洋药物与食品研究所 , 山东 青岛 266003; 2中国科学院遗传与发育生物学研究所 , 北京 100101)
[关键词 ] 全合成抗体库 ; 噬菌体展示 ; 筛选 [中图分类号 ] Q75 [文献标识码 ] B
全套抗体库为制备抗任意抗原的人源抗体提供了来源 , 且具有重要的基础研究和应用价值 。因此 , 构建高质量的抗 体库一直是抗体工程研究的热点 。全合成抗体库技术以其可 控性 、可操作性强 , 组成成分明确 , 设计灵活并能满足高通 量筛选的要求等特点 , 得以迅速发展和广泛应用 [1 ] 。随着对 抗体结构和功能认识的深入 , 人们越来越多地利用蛋白质工 程手段进行优化设计 , 来提高抗体库中抗体分子的表达能力 和稳定性 , 通过提高抗体库中功能性抗体的比例 , 从而有效 地提高抗体库的质量 。
3 讨论
随着人们对抗体结构和功能认识的深入和对各种抗体库构 建与筛选经验的积累 , 新的设计方案不断出现 , 使繁琐的建库与 筛选工作日趋简便易行 。
本实验中 , 采用表达良好的骨架序列 , 一方面有利于抗体分 子在大肠杆菌中表达和折叠 , 减少了因各种表达问题所致库容量 降低的问题 , 提高了功能性抗体分子的比例 , 使中等库容抗体库 中的功能性抗体分子数量接近高库容抗体库中的有效抗体分子 , 从而降低了构建高质量抗体库的繁琐操作 , 使建库的工作更为简 便易行。另一方面 , 单骨架的设计可使不同克隆间抗体分子的表 达量趋于一致 , 有利于随后的展示和筛选过程 , 以便实现高通量 筛选的平行性。此外 , Steinhauer等 [7]的研究表明 , 从稳定性高、 表达良好的单骨架抗体库中 , 分离的抗体分子具有良好的生物物 理学特性 , 适用于高密度抗体芯片的构建。
348
ISSN1007 - 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 (3)
性噬菌体抗体富集的指标 。 ( 2)噬菌体抗体与抗原的结合活 性及特异性鉴定 : 挑取经 3轮筛选得到的 PCR 阳性克隆 , 培 养至菌液浓度达 A600 = 0. 9, 加入 1 mmol/L IPTG于 30℃诱导 表达 16 h, 取培养基上清 , EL ISA 法测定各个克隆的抗原结 合活性 , 保留具有较高活性的克隆 , 测序鉴定 。 EL ISA 中以 重组人 SLC作为抗原 , BSA 作为对照抗原 。抗 E2tag抗体作 为一抗 , HRP2羊抗鼠 IgG作为二抗 。
[ 3 ] Azriel2Rosenfeld R, ValensiM, Benhar I. A human synthetic combinatori2 al library of arrayable single2chain antibodies based on shuffling in vivo formed CDR s into general framework regions[ J ]. J M ol B iol, 2004, 335: 177 - 192.
ISSN1007 - 8738细胞与分子免疫学杂志 (Chin J Cell Mol Immunol) 2005, 21 (3)
347
文章编号 : 1007 - 8738 (2005) 03 - 0347 - 02
全合成人源单骨架抗体库的构建及初步筛选
王尚资 1 , 尹长城 2 , 林正红 2 , 王祥斌 2 , 刘 晶 2 , 管华诗 1 , 黄华 23
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