实验六 金黄色葡萄球菌检验
金葡球菌实验报告
一、实验目的通过本次实验，掌握金黄色葡萄球菌的分离、培养和鉴定方法，了解其生物学特性，为临床诊断和治疗提供依据。
二、实验材料1. 实验菌株：金黄色葡萄球菌标准菌株2. 培养基：普通琼脂、血琼脂、Baird-Parker培养基、营养肉汤3. 实验仪器：恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、显微镜、移液器、试管、培养皿等4. 实验试剂：革兰氏染色液、碱性复红液、氯化钠、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、甲基红等三、实验方法1. 菌株分离与纯化（1）将金黄色葡萄球菌标准菌株接种于营养肉汤中，37℃培养24小时。
（2）取培养好的肉汤，用无菌移液器吸取适量接种于普通琼脂平板，37℃培养24小时。
（3）挑取单菌落，接种于血琼脂平板，37℃培养24小时。
（4）挑取单菌落，接种于Baird-Parker培养基平板，37℃培养24小时。
2. 鉴定试验（1）革兰氏染色：取纯化后的金黄色葡萄球菌，进行革兰氏染色，观察菌体形态。
（2）生化试验：进行触酶实验、葡萄糖发酵实验、麦芽糖发酵实验、乳糖发酵实验、蔗糖发酵实验、甲基红反应、VP反应等，以确定金黄色葡萄球菌的生化特性。
（3）溶血试验：观察金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上的溶血情况。
（4）过氧化氢酶试验：观察金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基平板上的过氧化氢酶反应。
四、实验结果1. 菌株分离与纯化在普通琼脂平板、血琼脂平板和Baird-Parker培养基平板上均分离出金黄色葡萄球菌，菌落呈圆形、凸起、表面光滑、湿润、不透明，产生黄色脂溶性色素。
2. 革兰氏染色金黄色葡萄球菌革兰氏染色阳性，呈球形，排列成葡萄串状。
3. 生化试验金黄色葡萄球菌触酶实验阳性，分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、产酸不产气，甲基红反应阳性，VP反应阴性。
4. 溶血试验金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生溶血环。
5. 过氧化氢酶试验金黄色葡萄球菌在Baird-Parker培养基平板上产生黑色沉淀。
五、实验结论根据实验结果，分离出的金黄色葡萄球菌符合金黄色葡萄球菌的生物学特性，可以确认为金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌检验 标准文本(食品安全国家标准)
食品安全国家标准金黄色葡萄球菌检验1 范围本标准规定了食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的检验方法。
本标准第一法适用于食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的定性检验；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数；第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数。
2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
2.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。
2.3 恒温水浴箱：37 ℃～65 ℃。
2.4 天平：感量0.1 g。
2.5 均质器。
2.6 振荡器。
2.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。
2.8 无菌锥形瓶：容量100 mL、500 mL。
2.9 无菌培养皿：直径90 mm。
2.10 L涂布棒。
2.11 pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。
3 培养基和试剂3.1 7.5 %氯化钠肉汤：见附录A 中A.1。
3.2 血琼脂平板：见附录A 中A.2。
3.3 Baird-Parker 琼脂平板：见附录A 中A.3。
3.4 兔血浆纤维蛋白原（RPF）琼脂培养基：见附录A 中A.4。
3.5 脑心浸出液肉汤(BHI) ：见附录A 中A.5。
3.6 兔血浆：见附录A 中A.6。
3.7 稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录A 中A.7。
3.8 营养琼脂小斜面：见附录A 中A.8。
3.9 革兰氏染色液：见附录A 中A.9。
3.10 无菌生理盐水：见附录A 中A.10。
第一法金黄色葡萄球菌定性检验4检验程序金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。
图1 金黄色葡萄球菌检验程序5 操作步骤5.1 样品的处理称取25 g 样品至盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000 r/min～10000 r/min 均质1 min～2 min，或放入盛有225 mL 7.5 %氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min。
金黄色葡萄球菌检测实验报告
金黄色葡萄球菌检测实验报告一、实验目的金黄色葡萄球菌是一种常见的病原菌，能够引起多种感染性疾病。
本次实验的目的是通过一系列的检测方法，准确检测出样本中是否存在金黄色葡萄球菌，并确定其数量和特性，为食品安全、临床诊断和环境卫生等领域提供可靠的检测依据。
二、实验原理金黄色葡萄球菌具有一些独特的生物学特性和生化反应，可通过以下几种方法进行检测：1、血浆凝固酶试验：金黄色葡萄球菌能够产生血浆凝固酶，使血浆发生凝固。
2、甘露醇发酵试验：金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇产酸。
3、革兰氏染色：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
三、实验材料1、样本：食品样本（如乳制品、肉类）、临床样本（如脓液、血液）等。
2、培养基和试剂：血琼脂平板甘露醇氯化钠琼脂培养基兔血浆革兰氏染色液生理盐水3、仪器设备：恒温培养箱显微镜无菌接种环、移液管等四、实验步骤1、样本处理食品样本：称取一定量的样品，加入适量生理盐水进行均质处理，制成稀释液。
临床样本：直接进行涂片或适当稀释。
2、增菌培养将处理后的样本接种于 75%氯化钠肉汤中，置于 36±1℃恒温培养箱中培养 18 24 小时。
3、分离培养从增菌培养物中分别划线接种于血琼脂平板和甘露醇氯化钠琼脂培养基上，于 36±1℃培养 18 24 小时。
4、形态观察观察血琼脂平板上的菌落形态，金黄色葡萄球菌菌落呈金黄色，周围有明显的透明溶血圈。
观察甘露醇氯化钠琼脂培养基上的菌落，金黄色葡萄球菌能使培养基变黄。
5、革兰氏染色挑取可疑菌落进行革兰氏染色，在显微镜下观察，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，呈葡萄串状排列。
6、血浆凝固酶试验取兔血浆与可疑菌落混合，置于 36±1℃培养箱中观察，若血浆发生凝固，则为阳性。
7、甘露醇发酵试验接种可疑菌落于甘露醇氯化钠琼脂培养基中，观察是否产酸。
五、实验结果1、形态观察在血琼脂平板上观察到金黄色、周围有透明溶血圈的菌落。
在甘露醇氯化钠琼脂培养基上观察到变黄的菌落。
金黄色葡萄球菌检验方法
3、涂片、染色与镜检
将纯培养的未知菌涂片，革兰氏染色，显微镜观察。
4、生化实验
①触酶试验
在载玻片上滴1滴3%的过氧化氢，调取纯化的细菌放在过氧 化氢中观察变化。30s内产生大量气泡者为阳性，不产生气 泡者为阴性。
②血浆凝固酶试验
吸取1：4新鲜兔血浆0.5ml，放入小试管中，再加入培养24h 的2①中的肉汤培养液0.5ml，摇荡均匀，放入（37±1℃） 恒温箱中培养，每0.5h观察一次，观察6h，检查是否出现凝 固。将试管倾斜或倒置时，呈现凝块状，可判定为阳性，同 时以已知阳性葡糖球菌和阴性肉汤作为对照。
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5、动物感染实验
用无菌生理盐水将2①中血琼脂板上纯化的菌落洗下后，以 0.5ml/只腹腔注射入小白鼠体内，同时用灭菌生理盐水注射 入另外的小白鼠体内，以做对照，分别在相同条件饲养，观 察其症状。对感染试验出现症状或死亡的小白鼠进行剖检， 并采集病料，进行分离。
二．结果与分析
1、培养特性及形态特征
2、方法
待检样品25g+225ml灭菌生理盐水
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┌─────┴─────┐
直接计数法
金黄色葡萄球菌的测定
金黄色葡萄球菌的测定1 卫生学意义金黄色葡萄球菌定性检验（增菌培养法）：适用于检查含有受损伤的金黄色葡萄球菌的加工食品。
2 检验方法2.1 术语与定义金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为一种革兰氏染色阳性球形细菌。
显微镜下排列成葡萄串状，金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜。
是常见的引起食物中毒的致病菌。
常见于皮肤表面及上呼吸道黏膜。
2.2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
（3）恒温水浴箱：37℃～65℃。
（4）天平：感量0.1g。
（5）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。
（6）无菌锥形瓶：容量100mL、500mL。
（7）无菌培养皿：直径90mm。
（8）pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.3 培养基和试剂（1）7.5%氯化钠肉汤1）成分：蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0g；氯化钠：75g；蒸馏水：1000mL；pH：7.4；2）制法：将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225mL，121℃高压灭菌15min。
（2）B－P琼脂平板1）成分：胰蛋白胨：10.0g；牛肉膏：5.0 g；酵母膏：1.0g；丙酮酸钠：10.0g；甘氨酸：12.0g；氯化锂（LiCl·6H2O）：5.0g；琼脂：20.0g；蒸馏水：950mL；pH：7.0±0.22）增菌剂的配法：30%卵黄盐水50mL与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10mL 混合，保存于冰箱内。
3）制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。
分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min。
临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL摇匀后倾注平板。
培养基应是致密不透明的。
使用前在冰箱储存不得超过48h。
金黄色葡萄球菌检验原理
金黄色葡萄球菌检验原理
金黄色葡萄球菌检验的原理是通过培养和鉴定来确定细菌是否为金黄色葡萄球菌。
具体步骤如下：
1. 培养：将样本在含有富含营养物质的培养基上进行培养。
金黄色葡萄球菌在常见的琼脂培养基上能够快速生长并形成典型的黄色菌落。
2. 鉴定：通过一系列的生化反应和特征性实验来确认细菌的身份。
金黄色葡萄球菌一般具有以下特征：
- 革兰氏染色：呈阳性，即菌体呈紫色。
- 非运动性：无鞭毛或鞭毛不活跃。
- 产生黄色色素：金黄色葡萄球菌能够产生一种特殊的黄色色素，使得菌落呈现金黄色。
3. 确认：通过进一步的检测，如凝胶酶试验和DNA鉴定等，来进一步确认菌株是否为金黄色葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌是一种常见的致病菌，可以引起多种感染，如皮肤感染、呼吸道感染和食物中毒等。
通过对其进行准确快速的检验可以帮助医生进行针对性治疗和控制传播。
金黄色葡萄球菌检验
食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
• 最适生长温度37℃，最适pH为7.4； • 兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好； • 可在高盐环境下生长，15%氯化钠环境下
还能生长； • 一般用含10%氯化钠的胰酪胨大豆肉汤增
菌或7.5%氯化钠肉汤增菌。
食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
• 所有的毒株产生血浆凝固酶，人和动物来 源的菌株通常可凝固兔、人、马和猪的血 浆。
• 金黄色葡萄球菌产生磷脂酶、蛋白酶、脂 肪酶和溶菌酶等，大多数菌株可水解天然 的动物蛋白并释放脂肪酸。在BP平板产生 磷脂环。
食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
生物学特性 ——致 病 性
•金黄色葡萄球菌为条件致病菌，菌株致病力的强弱主要取 决于其产生的毒素和侵袭性酶： •a.溶血素：外毒素，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌 体局部缺血和坏死；在血平板培养出现溶血环。 •b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； •c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血 液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬 细胞的吞噬作用。 •d.耐热核酸酶 •e.肠毒素：引起急性胃肠炎。
如结果可疑，从营养琼脂小斜面挑去菌落到BHI肉 汤，重复凝固酶试验。
食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
阴性
阳性
不凝固
少量、 零散凝
固
明显的块 状凝固
巨大块 凝固
完全凝固， 倒置不流动
食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
试管法
食品安全检验技术（微生物部分） 金色葡萄球菌检验
结果报告
• 在25g(mL)样品中检出或未检出金黄色葡萄 球菌。
• 即：检出/ 25g(mL) 或 未检出/ 25g(mL)
金黄色葡萄球菌的检验
金黄色葡萄球菌的检验(定性检测)一．金黄色葡萄球菌的生物学特性金黄色葡萄球菌革兰氏阳性球菌，直径为0.8-1.0微米，镜检时呈单个、成对、四联或不规则的簇群；无芽孢，无鞭毛、无荚膜、不运动；兼性厌氧菌，在好氧条件下生长最好；大多数菌株产生类胡萝卜素，使细胞团呈现出深橙色到浅黄色，色素的产生取决于生长的条件，故称金黄色葡萄球菌，营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH 7.4。
普通平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。
血平板菌落周围形成透明的溶血环。
主要存在于主要为淀粉类(如剩饭、米面、粥等)、牛乳及乳制品，以及鱼、肉、蛋类等。
二、培养基7.5%的氯化钠（三角瓶135mL）；BP平板培养基；血平板培养基；BHI肉浸液肉汤培养基（试管5个）。
三、金黄色葡萄球菌的定性检测主要包含四个步骤：样品处理；增殖培养；平板分离培养；鉴定（染色镜检和血浆凝固酶实验）。
1.样品的处理和增殖培养：样品为冷冻鱼丸，每组称量15g，放于研钵中，用研磨棒捣碎，放于135mL 7.5%的氯化钠肉汤中进行增菌培养，36℃±1℃培养18h～24h后，可观察到金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长。
2.血平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于血平板上，36℃±1℃培养18h～24h。
（每组2个血平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个血平板）。
金黄色葡萄球菌在血平板上的菌落特征：菌落较大，圆形，光滑突起，湿润，金黄色（有时为白色），菌落周围为完全透明溶血圈。
3.BP平板划线培养：将样品增菌培养物，用接种环取一环划线接种于BP平板上，36℃±1℃培养18h～24h。
（每组2个BP平板接种增殖样品，1个平板划线接种金黄色葡萄球菌，每组共3个BP平板）。
金黄色葡萄球菌在BP平板上的菌落特征：菌落直径2-3mm，颜色从灰色到黑色，边缘为淡色，周围有一浑浊带，其外层有一透明圈，用接种针触碰有奶油树脂的硬度。
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析
金黄色葡萄球菌检验技术介绍及分析金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的致病菌，广泛存在于环境中和人体的皮肤黏膜上。
它是一种革兰氏阳性球菌，通过空气、飞沫、直接接触等途径传播。
金黄色葡萄球菌引起的感染包括皮肤感染、呼吸道感染、骨髓炎、心内膜炎等，严重时还可以导致败血症和中毒性休克。
为了诊断金黄色葡萄球菌感染，需要进行相关的检验技术。
以下是金黄色葡萄球菌检验的常用技术介绍及分析：1. 细菌培养：将样品（如血液、脓液、分泌物等）接种到适当的培养基上，利用培养器将细菌培养在适当的温度和湿度下。
金黄色葡萄球菌能够在常规寒温培养基上生长，并产生特征性的金黄色色素。
2. 葡萄糖发酵试验：用含葡萄糖的培养基培养金黄色葡萄球菌，通过观察培养基的酸碱指示剂变化，如果培养基变为黄色，则说明金黄色葡萄球菌能够发酵葡萄糖产生酸。
3. 凝固酶试验：用凝固酶试剂与金黄色葡萄球菌接触，在一定时间内观察是否发生凝固反应。
凝固酶是金黄色葡萄球菌特有的酶，可以将凝血蛋白原转化为凝血蛋白，从而导致液体凝固。
4. 硝酸盐还原试验：将含有硝酸盐的培养基与金黄色葡萄球菌接触，观察是否产生还原反应。
正常情况下，金黄色葡萄球菌可以将硝酸盐还原为亚硝酸盐和硝酸，导致培养基变为红色。
5. 蛋白酶试验：用含有牛血清蛋白的培养基培养金黄色葡萄球菌，观察是否溶解蛋白质。
金黄色葡萄球菌能够产生多种蛋白酶，可以分解牛血清蛋白，形成溶解区。
通过以上的检验技术，可以初步判断金黄色葡萄球菌的存在和性质。
这些检验方法并不是专门针对金黄色葡萄球菌的，也不能确定金黄色葡萄球菌的毒力和抗药性等重要特征。
要做进一步的分析和确认，需要使用专门的分子生物学方法，如聚合酶链反应（PCR）和基因测序等。
食品中金黄色葡萄球菌检验
食品中金黄色葡萄球菌检验（一）原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。
此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在食品中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。
因此，检验食品中金黄色葡萄球菌有实际意义。
绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热性的DNA 酶。
（二）仪器和设备（1）显微镜（2）培养箱：（36±1）℃（3）离心机（4）灭菌吸管：1mL、10mL（5）灭菌小试管（6）培养皿：皿底直径9cm（7）均质机（8）载玻片（10）酒精灯（11）水浴锅（三）培养基和试剂（1）胰酪胨大豆肉汤培养基成分：胰酪胨（或胰蛋白胨）17g 磷酸氢二钾 2.5g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨）3g 葡萄糖 2.5 g氯化钠100g 蒸馏水1000mL 制法：将上述各成分混合，加热时轻轻搅拌使之溶解，分装三角瓶后，于121℃下高压灭菌15min。
最终pH为7.3±0.2。
（2）7.5%的氯化钠肉汤培养基成分：蛋白胨10g 蒸馏水1000mL 牛肉膏3g pH=7.4 氯化钠75g 制法：将上述各成分加热溶解，校正pH，分装于三角瓶中，在121℃下高压灭菌15min。
（3）黄豆粉浸液取黄豆粉5g、氯化钠10g，加入蒸馏水100mL。
置100℃水浴内加热1h，放于冰箱中过夜。
吸取上清液即为黄豆浸液。
（4）牛肉消化汤成分：绞碎牛肉1000g 15%氢氧化钠溶液27mL胰蛋白酶40mL 三氯甲烷1mL氯化钠10g 蒸馏水2000mL 制法：①称取碎牛肉，加蒸馏水，隔水加热到80℃，维持15min。
②加氢氧化钠溶液，pH试纸呈弱碱性，冷至40℃。
金黄色葡萄球菌的测定
食品中金黄色葡萄球菌的检测一、实验目的1、学习和掌握金黄色葡萄球菌的检测方法。
2、了解测定过程中的反应原理。
二、实验原理金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球型菌，分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气，能产生黄色色素。
需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃、PH7.4。
耐盐性强，在含7.5－15%NaC肉汤培养基中能生长。
能产生毒素和酶，如溶血毒素（在血琼脂平板上能形成溶血圈）、血浆凝固酶（区分葡萄球菌是否具有致病性的重要标志）等。
三、实验材料1、被检样：酱油（以金黄色葡萄球菌为对照）2、培养基：（1）．7.5%NaCl肉汤培养基成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化钠 75g蒸馏水 1000m1pH 7.4（2）Baird－Parker培养基制法：将各成分加于蒸馏水中，加热煮沸使完全溶解，冷至25℃，调至pH7.0±0.2，分装每瓶95mL，121℃高压灭菌15min，临用时加热溶化琼脂，冷至50℃左右，于每95mL加入预热至50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5mL，摇匀后倾注平皿培养基，卵黄亚碲酸盐增菌剂配制：将新鲜鸡蛋浸泡在适当的HgCl2溶液（1∶1000）中约1min，以无菌操作打开鸡蛋，使蛋黄与蛋白分开，将蛋黄加于生理盐水中（3＋7，V／V）充分摇匀，于50mL蛋黄乳液中加入10mL过滤除菌的1％亚碲酸钾水溶液，混匀，4±1℃贮存。
3、试剂：革兰氏染色液、生理盐水4、仪器与设备：恒温培养箱、高压灭菌锅、托盘天平、电炉、吸管、三角瓶、平皿、试管、试管架、酒精灯、75%酒精棉球等。
四、方法与步骤1、检样稀释：以无菌手段吸取酱油样品25m1放于含有225ml灭菌稀释液——生理盐水的玻璃瓶内(瓶内预置适当数量的玻璃珠)，经充分振摇作成l：l0的稀释液。
2、增菌：吸取5mL1：10的检样稀释液，接种于50mL已灭菌的7.5%Nacl肉汤培养基内，37℃培养24h。
同时以5mL生理盐水接种于50mL已灭菌的7.5%Nacl肉汤培养基内做对照。
金黄葡萄球菌鉴定步骤
金黄葡萄球菌鉴定步骤金黄葡萄球菌鉴定步骤导语：金黄葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的致病菌，对人类健康造成威胁。
了解金黄葡萄球菌的鉴定步骤对于预防和控制感染具有重要意义。
本文将从简单到深入，介绍金黄葡萄球菌鉴定的全过程。
一、目的金黄葡萄球菌鉴定的目的是确认样本中是否存在金黄葡萄球菌，并进一步了解其特点和性质，以便进行预防和治疗。
二、前期准备1. 确保实验室安全：佩戴实验室必备的防护用品，如手套、口罩和实验室服。
2. 培养基准备：准备适用于金黄葡萄球菌生长的培养基，如牛肉膏蔗糖培养基（Baird Parker Agar）或含有亚硒酸钠的万氏精液胆盐柳糖培养基（Mannitol Salt Agar）。
3. 无菌操作：使用无菌技术，以避免外来细菌的污染。
三、鉴定步骤1. 样本处理：将待检样本在无菌条件下接种于培养基上，可以是涂布法、点状法或环法。
a. 涂布法：将待检样本取适量涂布在培养基表面。
b. 点状法：用匀浆针将待检样本点状刺入培养基内。
c. 环法：用无菌棉签从待检样本中取样后沿培养基表面画环。
2. 培养条件：将培养基培养于37℃恒温培养箱中，培养时间一般为24小时。
3. 金黄葡萄球菌特征：a. 形态特征：金黄葡萄球菌在培养基上生长为黄色或类似葡萄球菌的菌落，呈珠状集聚。
b. 生理特性：金黄葡萄球菌产生酶溶血性作用，可溶解红细胞，形成溶血环。
c. 生化特性：金黄葡萄球菌可产生凝固酶，将凝血蛋白溶解成凝胶。
4. 疑似金黄葡萄球菌鉴定：a. 形态观察：观察菌落形态，如颜色、形状和大小等。
b. 酶溶血性试验：将待检菌落在凝集红细胞上涂布，观察是否形成溶血环。
溶血环直径大于3毫米时，判定为金黄葡萄球菌的溶血作用阳性。
c. 产凝固酶试验：将待检菌悬液与凝血蛋白混合，观察是否形成凝胶。
若凝胶形成，即判定为金黄葡萄球菌的凝固酶阳性。
5. 进一步确认：a. 分子鉴定：可采用PCR等分子生物学方法，通过特定基因的检测来确认金黄葡萄球菌。
金黄色葡萄球菌检验
至少观察6h；
☞凝固为阳性。 ☺用阳性表皮菌做对照试验，观察结果。（不凝固）
兔血浆配制：将小支试剂加入粉剂瓶中，摇匀即可。现配现用。
革兰氏染色步骤：
涂片—— 火焰固
定——结晶紫初染——
水洗—— 碘液媒染——
乙醇脱色—— 水洗——
吸干—— 番红或沙黄复 染—— 水洗—— 干燥— — 镜检
• 涂片：在载玻片中央滴一滴生理盐水，用
无菌操作法挑取菌种于生理盐水中，调匀
并涂成薄膜。注意：生理盐水不宜过多；
涂片必须均匀。
• 火焰固定：载玻片通过火焰1 ~ 2 次固定，
不可过热，以载玻片不烫手背为宜。
• 结晶紫初染：涂片置于水平位置。涂片薄
谢 谢
7.5%氯化钠肉汤
分离
从阳性增菌液中用接种环取
1环 BP平板，划线 18~24h或45~48h 1环 血平板，划线 18~24h
36℃±1 ℃
培养
血平板 BP平板
开始处
开始处
平板划线示意图
菌落特征：黑色或灰 色，圆形，光滑凸起， 湿润，周围有一浑浊 带，在其外层有一透 明圈
菌落特征：金黄色， 有时也为白色，大而 凸起，圆形，不透明， 表面光滑、湿润，周 围有透明溶血圈。
从阳性血平板或BP平 板上挑取典型菌落，营 养琼脂斜面划线
于36℃±1℃培养18~24h
从血平板或BP平 板上挑取典型菌落， 加入脑心浸出液 （BHI）肉汤
从血平板或BP平 板上挑取典型菌 落，染色
血浆凝固酶试验
☞用长滴管将新配制的兔血浆移入灭菌小试管中；
☞用吸量管移取0.2~0.3mL脑心浸出液（BHI）肉汤
金黄色葡萄球菌的测定方法验证报告
方法验证报告公共场所卫生检验方法第4部分：公共用品用具微生物GB/T18204.4-2013(5)胰酪胨（或胰蛋白胨17g 植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3g 氯化钠 100g 磷酸氢二钾 2.5g 葡萄糖 2.5g蒸馏水1000m L制法：将上述成分混合后，加热溶解，调pH 为7.2~7.3，分装，121C 、20min高压灭菌。
2.1.2氯化钠肉汤(75g/L)成分： 蛋白胨 10g 牛肉膏 10g 氯化钠 75g 蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热溶解，调pH 为7.4,分装，121°C 、20min 高压灭菌。
2.1.3BairdParker 平板成胰蛋白胨 10g 牛肉膏 5g 酵母浸膏1g 丙酮酸钠 10g甘氨酸 12g1. 目的验证平皿鉴定法测定公共用品用具微生物中的金黄色葡萄球菌，来判断在本实验室此方法的适用性。
2.培养基和试剂2.1培养基和试剂2.1.1胰酪胨大豆肉汤成分：氯化锂（LiCl.6H2O）琼脂5g 20g蒸馏水950mL增菌剂的配制：卵黄盐水（30%,体积分数）50mL与除菌过滤的亚碲酸钾溶液（质量浓度=1%）10mL混合，保存于冰箱内。
制法：将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25°C校正pH至7.0±0.2。
分每瓶95mL,121C高压灭菌15min,临用时加热熔化琼脂，每95mL加入预热至50C的卵黄亚碲酸钾增菌5mL,摇匀后倾注平板。
培养基应是致密不透明的。
使用前在冰箱储存，不得超过48h。
2.1.4血琼脂培养基成分：营养琼脂100mL脱纤维羊血（或兔血）10mL制法：将营养琼脂加热溶化,待冷至50C左右以无菌方法加人脱纤维羊血摇匀，制成平板，置冰箱内备用。
2.1.5革兰氏染色液2.1.5.1结晶紫染色液成分：结晶紫1g乙醇（95%,体积分数）20mL草酸铵水溶液（质量浓度=1%）80mL制法：将结晶紫溶于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合2.1.5.2革兰氏碘液成分：碘1g碘化钾2g蒸馏水300mL制法：将碘与碘化钾先进行混合，加人蒸馏水少许，充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水。
第六章金黄色葡萄球菌的检验PPT资料
3、生化特性：
可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸 不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。
许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝 酸盐，液化明胶。
金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺 类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏 感。
金黄色葡萄球菌的致病性
金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素 和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分α、β、γ、δ，能损伤血小板， 破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液 或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞 的吞噬作用。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶 能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋 白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F六种血清型。
比如：法国梅里埃公司生产的RPF培养基、API检测系统等。 当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。 葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； 5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50 mL培养基内，36℃±1℃培养24 h，转种血平板和Baird-Parker平板， 36℃±1℃培养24 h，挑取血 平板上金黄色（有时为白色）菌落进行革兰氏染色镜检及血浆凝固酶试验。 金黄色葡萄球球菌的单个菌落在血平板上呈金黄色，有时也为白色，大而突出、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。 Staphylococcus aureus Enhanced sem w: 7. 5～15%NaCl肉汤中生长。 中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。 金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞；
实验六 金黄色葡萄球菌检验
实验六金黄色葡萄球菌检验（第二篇）1 目的1.1 了解金黄色葡萄球菌检验原理1.2 掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法2 原理葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。
金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。
可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。
如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。
金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。
这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。
3 材料3.1 样品奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。
3.2 菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）3.3 培养基与试剂7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-parker氏培养基、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。
3.4 其它显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。
4 流程5 步骤5.1 一般培养称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液(液体样品可不稀释)。
吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。
同时将对照菌种在上述两种平板上作划线分离接种。
置36±1℃温箱培养24h。
5.2 分纯培养将上述血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落,先观察对照的菌落特征,再观察被检样品的菌落.,并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。
若无菌落生长，可用也增菌培养物在上上述平板上划线分离，在36±1℃温箱培养24h后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。
金黄色葡萄球菌检验与计数
▪ 耐热，经100℃煮沸30min不被破坏，也不受胰 蛋白酶的影响。食物中的肠毒素耐热性更强，一 般烹调温度不能将其破坏。218~248 ℃的油中 需30min才能被破坏。可引起急性胃肠炎。
▪ 根据肠毒素的血清型，可分A、B、C（C1、 C2）、D、E 5 个型。A型肠毒素引起的食物中 毒较多，约占50%左右。其他依次为D、C、B 和E型。也有A＋D、A＋B、A＋C、B＋C等。
---某一稀释度平板的菌落大于200 cfu且有典 型菌落，且上一稀释度平板上有典型菌落， 其平板上的菌落数不在20 cfu～200 cfu之 间，计数该稀释度平板上的典型菌落；
公式一
T=AB/Cd T:样品中金黄色葡萄球菌落数； A:某一稀释度典型菌落的总数 ； B:某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数 ； C:某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数； d:某一稀释度。
▪ 液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品至盛 有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无 菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠) 中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。
增菌与分离培养
▪ 增菌培养：吸取5mL上述样品匀液，接种于 50mL 7.5%氯化钠肉汤或10%胰酪胨大豆肉 汤培养基内，36℃±1℃培养18h～24h。金 黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生 长，污染严重时在10%胰酪胨大豆肉汤内呈 混浊生长。
血浆凝固酶试验
▪ 挑取Baird－Parker平板或血平板上可疑菌 落1个或以上，分别接种到5mL BHI和营养 琼脂小斜面，36℃±1℃培养18 h～24 h。
▪ 取新鲜配置兔血浆0.5mL，放入小试管中， 再加入可疑菌落的BHI培养物0.2mL～ 0.3mL，振荡摇匀，置36℃±1℃温箱或水浴 箱内，每半小时观察一次，观察6h，如呈现 凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块） 或凝固体积大于原体积的一半，判定为阳性 结果。
实验金黄色葡萄球菌的分离和鉴定
实验题目金黄色葡萄球菌的分离和鉴定一、实验目的金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在,空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到;因而,食品受其污染的机会很多;近年来,美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌;金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生难题,在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒,占整个细菌性食物中毒的33%,加拿大则更多,占到45%,我国每年发生的此类中毒事件也非常多;为控制金黄色葡萄球菌的对人的危害,我们要分离出它们并研究;二、实验原理典型的金黄色葡萄球菌为球型,直径左右,显微镜下排列成葡萄串状;金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛,大多数无荚膜,革兰氏染色阳性;金黄色葡萄球菌营养要求不高,在普通培养基上生长良好,需氧或兼性厌氧,最适生长温度37°C,最适生长,干燥环境下可存活数周;平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起,直径1—2mm;血平板菌落周围形成透明的溶血环;金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性,可在10—15%NaCl肉汤中生长;可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖,产酸不产气;甲基红反应阳性,V—P反应弱阳性;许多菌株可分解精氨酸,水解尿素,还原硝酸盐,液化明胶;金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力,对磺胺类药物敏感性低,但对青霉素、红霉素等高度敏感;对碱性染料敏感,十万分之一的龙胆紫液即可抑制其生长;三、实验材料和设备1.培养基牛肉膏蛋白胨培养基13%NaCl：牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化钠130g,琼脂15g,蒸馏水1000ml,121℃灭菌20min后倒平板;肉汤培养基：酵母膏5g,蛋白胨10g,氯化钠10g,蒸馏水1000ml,121℃灭菌20min;甲苯胺兰-DNA平板2.试剂磺胺类药物、革兰氏染液3.仪器和设备显微镜、超净工作台、水浴锅、培养皿、锥形瓶、移液器、灭菌锅、培养箱、试管、载玻片、接菌环;四、实验方法金黄色葡萄球菌的分离：1.称取5g土样,在无菌条件下放入灭菌的锥形瓶中,加入50ml蒸馏水,再加入200ul磺胺类药物,振荡10min,使土样充分混匀;利用金黄色葡萄球菌对磺胺类药物敏感性低的特性,杀死其他细菌;2.从上述锥形瓶中取5ml上清液放入一只干净的试管中,30℃,200rpm,24h;3.取培养好的菌液,按梯度稀释法稀释土壤悬液,依次制备成100、1000、10000、100000倍悬液后,分别取200ul涂布于牛肉膏蛋白胨培养基平板上,置于37℃培养箱中培养24h;利用高盐培养基抑制其他细菌的生长,从而分离金黄色葡萄球菌;金黄色葡萄球菌的鉴定：1.菌落形态：菌落较小,较湿,较透明,边缘整齐,隆起;2.染色观察：从平板上挑取可疑性菌落进行革兰氏染色,金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性,显微镜下呈葡萄状排列、无芽孢、荚膜,直径—1um;3.血浆凝固酶试验：吸取兔血浆与金黄色葡萄球菌试液浸液肉汤24小时培养物充分混匀,置36±1°C培养,每隔半小时观察一次,连续观察6小时,出现凝固,即将小试管倾斜或倒置时,内容物不流动,判为阳性;同时做阴阳性对照;4.耐热核酸酶试验：将24小时肉汤培养物沸水浴处理15min,用接种环划线刺种于甲苯胺兰-DNA平板,36±1°C培养24小时,在刺种线周围出现淡粉色者为阳性;本试验金黄色葡萄球菌为阳性;。
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实验六金黄色葡萄球菌检验（第二篇）
1 目的
1.1 了解金黄色葡萄球菌检验原理
1.2 掌握金黄色葡萄球菌鉴定要点和检验方法
2 原理
葡萄球菌在自然界分布极广，空气、土壤、水、饲料、食品(剩饭、糕点、牛奶、肉品等)以及人和动物的体表粘膜等处均有存在，大部分是不致病，也有一些致病的球菌。
金黄色葡萄球菌是葡萄球菌属一个种。
可引起皮肤组织炎症，还能产生肠毒素。
如果在食品中大量生长繁殖，产生毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食物中毒，故食品中存在金黄色葡萄球菌对人的健康是一种潜在危险，检查食品中金黄色葡萄球菌及数量具有实际意义。
金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆凝固，多数致病菌株能产生溶血毒素，使血琼脂平板菌落周围出现溶血环，在试管中出现溶血反应。
这些是鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。
3 材料
3.1 样品
奶、肉、蛋、鱼制品和饮料等。
3.2 菌种
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）
藤黄八叠球菌（Sarcina lutea）
3.3 培养基与试剂
7.5%氯化钠肉汤、血琼脂平板、Baird-parker氏培养基、无菌盐水、兔血浆、革兰氏染色液。
3.4 其它
显微镜、温箱、离心机、无菌吸管、无菌试管、无菌平皿、均质器、载玻片、L型涂布棒、酒精灯、接种环等。
4 流程
5 步骤
5.1 一般培养
称取25g固体样品，加入225mL无菌生理盐水，制成混悬液(液体样品可不稀释)。
吸取5mL上述混悬液，接种于7.5%氯化钠肉汤或胰酪胨大豆肉汤50mL培养基
内，同时挑取混悬液或液体样品直接在血平板和Baird-Parker平板划线分离。
同时将对照菌种在上述两种平板上作划线分离接种。
置36±1℃温箱培养24h。
5.2 分纯培养
将上述血平板和Baird-Parker平板上挑取可疑菌落,先观察对照的菌落特征,再观察被检样品的菌落.,并挑取可疑菌落在血平板上进行分离纯化。
若无菌落生长，可用也增菌培养物在上上述平板上划线分离，在36±1℃温箱培养24h后再分离纯化，挑取可疑菌落及对照菌种进行革兰氏染色及血浆凝固酶试验。
5.3 形态特征
本菌为革兰氏阳性球菌，排列是葡萄状，无芽孢，无荚膜，致病性葡萄球菌菌体较小，直径约为0.5～1um。
在肉汤中呈混浊生长，在胰酪胨大豆肉汤内有时液体澄清，菌量多时呈混浊生长，血平板菌落呈金黄色，也有时呈白色，大而突起、圆形、不透明、表面光滑，周围有溶血圈。
在Baird-Parker平板上为圆形、光滑凸起、湿润、直径2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。
用接种针接触菌落似有奶油树胶的硬度。
偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。
长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。
5.5血浆凝固酶试验
挑取上述可疑菌落菌种于肉浸液肉汤，同时将金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌分别接种于肉浸液肉汤，在36±1℃温箱培养24h后进行血浆凝固酶试验。
吸取1∶4新鲜兔血浆0.5mL，放入小试管中，再加入培养24h的金黄色葡萄球菌肉浸液肉汤培养基0.5mL，振荡摇匀，放在36℃温箱或水浴内，每0.5h观察一次，观察6h，如呈现凝固，即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块者，被认为是阳性结果。
同时以已知阳性和阴性葡萄球菌株及肉汤作为对照。
6 结果
根据形态染色，血平板情况以及血浆凝固酶试验，判别检样有否金黄色葡萄球菌。
7 思考
7.1 金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上的菌落特征如何？为什么？
7.2 鉴定致病性金黄色葡萄球菌的重要指标是什么？。